第二核酸的凝膠電泳

第二核酸的凝膠電泳第一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一核酸的凝膠電泳

它是一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段，同時也是分子生物學(xué)研究方法的技術(shù)基礎(chǔ)。

第一節(jié)核酸的凝膠電泳第二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一

前言一、瓊脂糖凝膠電泳二、聚丙烯酰胺凝膠電泳三、脈沖場凝膠電泳第三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一前言

核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術(shù)之一，用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段；優(yōu)點：（1）便于分離;（2）便于檢測;（3）便于回收。

第四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一第五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一核酸凝膠電泳的基本原理1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團，呈負(fù)離子化狀態(tài)；核酸分子在一定的電場強度的電場中，它們會向正電極方向遷移；2）由于在電泳中往往使用無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)，電泳遷移率（或遷移速度）與分子的摩擦系數(shù)成反比。而摩擦系數(shù)是分子大?。?gòu)型）、介質(zhì)粘度等的函數(shù)；因此，可在同一凝膠中、一定電場強度下、可在凝膠上分離出不同分子量大小或相同分子量但構(gòu)型有差異的核酸分子。第六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一一、瓊脂糖凝膠電泳

Agarosegelelectrophoresis第七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是一種從紅色海藻中提取出的線性多糖聚合物。它是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。分為常熔點的瓊脂糖和低熔點（LMP）瓊脂糖。

第八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一（一）凝膠的制備及電泳第九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一制膠1.準(zhǔn)備好凝膠成型器，插入成型梳。2.將1.5g瓊脂糖加至100ml1×TAE緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全熔化，冷卻至60℃以下。3.加入5ul溴化乙錠（終濃度0.5ug/ml）至熔化的瓊脂糖液中混勻，但避免出現(xiàn)氣泡。4.將冷卻的瓊脂糖倒入凝膠成型器，制備凝膠。第十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一第十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一第十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一電泳1.待膠變硬，直到它呈乳白狀且不透明（約20分鐘），小心垂直向上拔出梳子，將凝膠置入電泳槽中，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm。2.用移液器吸取2μl的6X載樣緩沖液于封口膜上，再加入5μl樣品，混勻后，小心加入點樣孔。3.接通電源，調(diào)節(jié)電壓至4-5V/cm，DNA從負(fù)極移到正極。電泳時間30－60分鐘。4.電泳結(jié)束，關(guān)掉電源。第十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一1.將電泳完畢的瓊脂糖凝膠置于自動成像系統(tǒng)的平臺中間；2.開通紫外光，可見到發(fā)出熒光的DNA條帶，在電腦中觀察圖像；3.關(guān)上紫外光電源，在電腦中編輯和保存圖像；4.根據(jù)圖像判定結(jié)果。結(jié)果分析第十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一第十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一第十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一第十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一（二）DNA的遷移速率決定因素第十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一1DNA分子的大小雙鏈DNA分子遷移的速率與其堿基對數(shù)的常用對數(shù)近似成反比；

2瓊脂糖濃度濃度越低，相同核酸分子遷移越快；第十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA相對遷移距離推測待測定的DNA片段的大小第二十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一

3DNA的構(gòu)象

一般同一分子：超螺旋環(huán)狀＞線狀＞切口環(huán)狀。

4凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠

溴化乙錠（EB）插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長度增加。第二十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一Agarosegelelectrophoresis第二十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一5所用的電壓低電壓時DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。

6瓊脂糖種類常見的有兩種：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和低熔點瓊脂糖；第二十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一

不同類型瓊脂糖的性質(zhì)

瓊脂糖類型凝結(jié)溫度/℃熔化溫度/℃

標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖35~3890~95不同廠家生產(chǎn)的不同商品其凝結(jié)溫度和熔化溫度有一定差異40~4285~90

高強度瓊脂糖34~4385~95

修飾的低熔點/凝點瓊脂糖25~3563~653565

超低熔點8~1540~45

低黏性低熔點瓊脂糖25~307038853075第二十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一

不同類型瓊脂糖分離DNA片段的范圍濃度（%）標(biāo)準(zhǔn)(kb)高強度(kb)低熔點(kb)低黏度低溶點(kb)0.31-500.50.7--250.80.5-150.8-100.8-101.00.25-120.4-80.4-81.20.15-60.3-70.3-71.50.08-40.2-40.2-42.00.1-30.1-33.00.05-10.5-14.00.1-0.56.00.01-0.1第二十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一7電泳緩沖液常用的有TAE、TPE及TBE第二十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一TAE、TPE及TBE電泳緩沖液比較

都是常用電泳緩沖液。三者相比：1）TAE的緩沖容量最低，如長時間電泳會被消耗，此時凝膠的陽極一側(cè)將發(fā)生酸性化；2）TBE和TPE比TAE花費稍貴，但有高得多的緩沖容量；3）雙鏈線狀DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中遷移快10%；4）對于高分子質(zhì)量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，對于低分子質(zhì)量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的電泳分辨率要好于TBE。第二十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一（二）凝膠載樣緩沖液載樣緩沖液：臨上樣到凝膠加樣孔之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液。載樣緩沖液有三個作用：1）增加樣品密度保證DNA沉入加樣孔內(nèi)；2）使樣品帶有顏色便于簡化上樣過程；3）其中的染料在電場中以可以預(yù)測的泳動速率向陽極遷移。第二十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一6×凝膠載樣緩沖液類型6×緩沖液貯存溫度I0.25%溴酚藍4℃0.25%二甲苯氰FF40%(m/V)蔗糖水溶液II0.25%溴酚藍室溫0.25%二甲苯氰FF15%Ficoll(Type400)水溶液III0.25%溴酚藍4℃0.25%二甲苯氰FF30%甘油水溶液IV0.25%溴酚藍4℃40%(m/V)蔗糖水溶液第二十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一（三）瓊脂糖凝膠中DNA的檢測

通過染色,紫外燈下檢測。主要有溴化乙錠（ethidiumbromide,EB）染色法和SYBRGold染色法。第三十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一1凝膠的EB染色第三十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一

觀察瓊脂糖凝膠中DNA最常用的方法是利用熒光染料溴化乙錠進行染色，溴化乙錠含有一個可以嵌DNA堆積堿基之間的一個三環(huán)平面基團。它與DNA的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性。第三十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一在高離子強度的飽和溶液中，大約每2.5個堿基插入一個溴化乙錠分子。當(dāng)染料分子插入后，其平面基團與螺旋的軸線垂直并通過范德華力與上下堿基相互作用。這個基團的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致與DNA結(jié)合的染料呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身吸收302nm和366nm的光輻射。這兩種情況下，被吸收的能量在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來。由于溴化乙錠-DNA復(fù)合物的熒光產(chǎn)率比沒有結(jié)合DNA的染料高出20-30倍，所以當(dāng)凝膠中含有游離的溴化乙錠（0.5ug/ml）時，可以檢測到少至10ng的DNA條帶。第三十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一溴化乙錠可以用來檢測單鏈或雙鏈核酸（DNA或RNA）。但是染料對單鏈核酸的親和力相對較小，所以其熒光產(chǎn)率也相對較低。事實上，大多數(shù)對單鏈DNA或RNA染色的熒光是通過染料結(jié)合到分子內(nèi)形成較短的鏈內(nèi)螺旋產(chǎn)生的。

盡管在該染料存在的情況下，線狀DNA的電泳遷移率約降低15%，因此，當(dāng)需要知道DNA片段的準(zhǔn)確大小（如DNA限制酶酶切圖譜的鑒定），凝膠應(yīng)該在無EB情況下電泳，電泳結(jié)束后用EB染色。染色完畢后，通常不需要脫色。但是在檢測小量DNA（小于10ng）片段時，通常要將染色后的凝膠進行脫色。

第三十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一使用EB染色注意事項（1）EB被認(rèn)為是一種強致癌物質(zhì)（2）EB可用來檢測單鏈或雙鏈核酸第三十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一

（3）EB使用時的配制、貯存及使用

EB常用水配制成10mg/ml的貯存液，于室溫保存在棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為0.5μg/ml

。第三十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一（4）當(dāng)要知道DNA片段準(zhǔn)確大小時，凝膠應(yīng)在無EB情況下電泳，電泳結(jié)束后再用EB染色。第三十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一EB替代品sybr-green不穩(wěn)定，易降解goldview宣稱無毒,不靈敏,回收連接不好,對大片段的DNA染色還可以，熒光易猝滅gelred低毒,效果很強!但價格昂貴genefinder效果一般，以前懷疑它是sybrgreengenegreen不穩(wěn)定，易降解

第三十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一gelRed&gelGreen的凝膠染色

它們是一種新型極敏感染料的商品名稱。其與DNA結(jié)合的親和力高，并且結(jié)合后，能夠極大增強熒光信號。第三十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一（四）凝膠中DNA的成像

可以用透射或入射紫外光對EB染色的凝膠成像，圖像可以直接輸出到計算機觀察。第四十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一（五）凝膠中DNA的回收現(xiàn)一般采用試劑盒回收：存在的主要問題：1不能有效的回收大片段DNA2不能有效回收少量DNA第四十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一二、聚丙烯酰胺凝膠電泳

polyacrylamidegelelectrophoresis

PAGE第四十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一第四十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一

在TEMED(四甲基乙二胺)催化過硫酸銨還原產(chǎn)生的自由基的存在下，丙烯酰胺單體的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的線狀長鏈。在雙功能交聯(lián)劑如N，N`-亞甲基雙丙烯酰胺的參與下的共聚合反應(yīng)中，聚丙烯胺的交聯(lián)形成三維帶狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。網(wǎng)格孔徑的平均直徑?jīng)Q定于丙烯酰胺和雙功能交聯(lián)劑的濃度。（一）聚丙烯酰胺凝膠的本質(zhì)第四十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一CH2=CH-C(O)-NH2

(丙烯酰胺）

CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2

（N，N`-亞甲雙丙烯酰胺）第四十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳種類1變性聚丙烯酰胺凝膠

用于單鏈DNA片段的分離或純化。

變性的DNA在這些凝膠中的遷移率幾乎與其堿基組成及序列完全無關(guān)。用途：放射性DNA探針的分離、DNA測序反應(yīng)等。第四十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一

2非變性聚丙烯酰胺凝膠

用于雙鏈DNA片段的分離和純化。注：遷移率受其堿基組成和序列的影響。用途：制備高純度的DNA片段。第四十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一（三）DNA在聚丙烯胺凝膠中的有效分離范圍丙烯酰胺濃度（%）有效分離范圍（bp）二甲苯氰FF溴酚藍3.51000~20004601005.080~500260658.060~4001604512.040~200702015.025~150601520.06~1004512第四十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一三、脈沖場凝膠電泳

（pulsed-fieldgelelectrophoresis，

PFGE）第四十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一為何選PFGE？

超過一定大小的線狀雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中以相同速率遷移。大于該極限長度（40kb）后DNA的遷移速率幾乎與分子大小無關(guān)，而主要決定于電場強度。但PEGE

解決了這一問題。

第五十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一（一）脈沖電場凝膠電泳基本原理1984年，D.R.Cantor發(fā)明的。分離超大分子量的DNA分子。在脈沖電泳中，電場方向是周期變化的，頭一個脈沖電場方向與核酸的移動方向成45度角，下一個脈沖的電場方向與核酸移動方向在另一側(cè)成45度角，由于加在瓊脂糖凝膠電泳上的電場方向、電流大小、以及作用時間都在交替地變換著，這就使得DNA分子必須隨時調(diào)整其泳動的方向，來適應(yīng)凝膠孔隙的無規(guī)則變化。與分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要較多的次數(shù)來更換其構(gòu)型和方位，使之能夠按新的方向游動，所以遷移率就慢，從而達到了分離大分子量DNA分子的目的。10^7bp的DNA大分子第五十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一B+A-+A-B脈沖電場電泳示意圖第五十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一PFGEcanresolvelargeDNAfragments第五十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一（二）PEGE類型垂直脈沖場電泳系統(tǒng)(verticalpulsedfield)場翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)(fieldinversion)旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)(rotatinggel)箝位勻強電場系統(tǒng)(contour-clampedhomogeneouselectricfield)第五十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一A-+AB-+B垂直交變電場系統(tǒng)場翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)箝位勻強電場系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)A-+AB-+BA-+AB-+B-+第五十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一（三）影響分辨率的因素1脈沖時間（0.1s-1000s)：增加脈沖時間分離較大分子，減少脈沖時間分離較小分子。2電壓：若固定脈沖時間，增加電場強度就增大了可分離最大片段的范圍，但是太大的電場強度會導(dǎo)致較小片段泳動的紊亂。第五十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一3電場夾角：電場方向的夾角常為1100-1200，研究證實900夾角也非常有效的。4溫度：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖電泳基本在室溫進行，PFGE一般應(yīng)在4℃進行。較高的溫度DNA泳動較快；但是較高的溫度也引起較小片段的泳動截留和明顯的條帶變寬。第五十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一核酸分子雜交（DNA/DNAorDNA/RNA）技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)，是在1968年由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事發(fā)明的。所依據(jù)的原理是，帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。

第五十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一

雜種核酸分子：彼此退火的核酸來自不同的生物有機體，而形成的雙鏈分子。

DNA/DNA的雜交作用檢測特定生物有機體之間的親源關(guān)系

DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片段中某種特定基因的位置。第五十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一核酸雜交常用幾種膜的性能比較第六十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一硝酸纖維素膜不能滯留小于150bp的DNA片段，不能同RNA結(jié)合。應(yīng)用1mol/L醋酸銨和0.2mol/L的NaOH緩沖液代替SSC緩沖液可改善對小片段DNA的滯留能力。

RNA變性后也能十分容易的結(jié)合到膜上。第六十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一

尼龍膜或硝酸纖維素膜雜交的步驟：

1.核酸印跡轉(zhuǎn)移：將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持膜上。利用的是毛細(xì)管作用

2.印跡雜交：將具有核酸印跡的濾膜同帶有標(biāo)記的DNA/RNA進行雜交。第六十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一1、薩瑟恩DNA印跡雜交

根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由E.Southern于1975年首先設(shè)計出來的，故又叫SouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。

第六十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一

印跡轉(zhuǎn)移前的凝膠處理：分子量不同所需轉(zhuǎn)移的時間不同；浸泡在0.25M的HCl溶液中脫嘌呤，再進行堿變性堿水解，DNA鏈斷裂單鏈第六十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片Southern凝膠轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)第六十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一第六十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一第六十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一SouthernDNA印跡雜交之X光顯像圖片

水稻（OryzasativaL.)的葉綠體DNA分別用核酸內(nèi)切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加樣在含有EtBr染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標(biāo)記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)的陽性條帶，表明含有水稻的psbA基因序列。第六十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一

在進行核酸印跡轉(zhuǎn)移的時，

1.要將以轉(zhuǎn)好的硝酸纖維素膜在80度下烘烤1～2小時；

2.紫外線交聯(lián)法，將DNA分子上的部分胸腺嘧啶殘基同尼龍膜表面的帶正電荷的氨基基團之間進行交聯(lián)。

第六十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一2、諾賽恩RNA印跡技術(shù)（Northernblotting）

1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。由于這種方法與薩瑟恩DNA印跡雜交技術(shù)十分類似，所以叫做諾賽恩RNA印跡技術(shù)（Northernblotting）。

第七十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一第七十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一3.而將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進行反應(yīng)，這種技術(shù)叫做韋斯頓蛋白質(zhì)雜交技術(shù)（Westernblotting）。第七十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一第七十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一第七十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一4、斑點印跡雜交和狹線印跡雜交斑點印跡雜交（dotblotting）和狹線印跡雜交（slotblotting）是在Southern印跡雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展的量種類式的快速檢測特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸雜交技術(shù)。由于在實驗的加樣過程中使用了特殊設(shè)計的加樣裝置，使眾多待測樣品能夠一次同步轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，并有規(guī)律地排列成點陣或線陣。這兩項技術(shù)更適應(yīng)與核酸樣品的定量檢測。

通過抽真空的方式將加在多孔過濾進樣器上的核酸樣品，直接轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)碾s交濾膜上。第七十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一第七十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一5、菌落雜交也叫原位雜交，是指把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的DNA同濾膜原位結(jié)合，帶有DNA的濾膜烘干后，與放射性同位素標(biāo)記特異的DNA或RNA探針雜交。鑒定重組子。第七十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一檢測重組體克隆的菌落雜交技術(shù)第七十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期一