第三章細胞分離技術

第三章細胞分離技術第一頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一部分微生物胞內酶第一節(jié)細胞分離第二頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一胞內重組藥物

設計試驗，請用生物工程學的原理和方法生產治療糖尿病的胰島素？第三頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一

分離胞內產物與胞外產物的差別是什么？為回收和提純胞內產品,必須先將它們從胞內釋放到胞外,然后進行分離純化?？梢圆捎梅置谛运拗魇拱麅犬a物直接分泌到胞外;也可用破碎細胞的方法使其釋放出來。第四頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一細胞與液體物質的分離又稱為固液分離，固液分離方法包括過濾與離心沉降。一、過濾指利用多孔性介質截流固體懸浮液中的固體顆粒，進行固液分離的方法。過濾不但是傳統(tǒng)的化工單元，而且是目前工業(yè)生產中用于分離細胞和不溶性物質的主要方法。第五頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一過濾一般過濾：微生物、動植物細胞膜過濾：蛋白質等物質的選擇性分離一般過濾：以壓力差作為推動力。第六頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一二、離心沉降沉降法：指固體顆粒在外力作用下與液體物質做相對運動最終實現(xiàn)固液分離的技術。沉降法根據(jù)作用外力的不同，可分為重力沉降和離心沉降。第七頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一離心沉降是利用慣性離心力和物質的沉降系數(shù)或浮力密度的不同而進行的一項分離、濃縮或提取條件。1）離心沉降的原理：固體和液體之間存在一定的密度差，且固體密度大于液體的密度。2）影響離心沉降速度的因素密度差、顆粒大小、液體粘度、離心力大小第八頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一斯托克斯公式：u=d2(ρs－ρ)rω2/18μ1)密度差越大(ρs－ρ)，離心沉降速度越快；2)固體顆粒尺寸越大，越容易離心;3)液體粘度μ越大，越不容易離心；4)離心力rω2的大小對固液分離影響很大。第九頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一3）離心機的分類分離因數(shù)Fr＝rω2／g分離因數(shù)Fr的大小分為1)Fr＜3000常速離心機2)Fr＝3000～5000中速離心機3)Fr≥5000高速離心機4)Fr=2×104～106超速離心機第十頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一離心分離法根據(jù)其操作方式的不同，又可分為差速離心和密度梯度離心。1)差速離心法如果所要的蛋白質(或生物大分子)主要集中在某一細胞組分，如細胞核、染色體、核糖體或可溶性的細胞質等；則可利用差速離心（differentialcentrifugation）方法將它們分開收集，該細胞組分作為下步純化的材料。第十一頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一優(yōu)點：可以一下子除去很多雜蛋白質，使純化工作容易得多。如果碰上所要蛋白質是與細胞膜或膜質細胞器結合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結構解聚，然后用適當?shù)慕橘|提取。第十二頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一差速離心法的原理差速離心是利用不同離心速度產生不同離心力，將各種亞細胞組分和各種顆粒分別分開。不同物質有不同的形狀、大小、質量和密度，當在介質中離心時，它們的沉降速度各有差異。第十三頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一大的顆粒碎片在低速時很快沉降，被分離的物質留在上清液中;逐步增加離心力，進一步離心上清液，使中等顆粒沉降，最后是大小和密度最小的顆粒沉降。注意：每次得到的沉淀，必須經(jīng)過幾次洗滌后，反復懸浮和離心，才能得到比較純的部分。第十四頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一差速離心圖示第十五頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一差速離心的方法為了將細胞中各種組分純化分離，首先要在等滲緩沖液中把細胞破碎勻漿;然后用差速離心的方法，把勻漿液中的各種組分分離;在離心場中，不同大小的顆粒沉向離心管底部的速率不同。第十六頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一差速離心的方法當離心力低，離心時間短時，細胞核即可沉到管底；加大離心力后，又可分離出線粒體；離心力再加大，才能分離出微粒體和核糖體。最后幾步的超離心力，可超過地心引力的10萬倍以上，懸液經(jīng)離心分離出核糖體以后所剩的上清液，則是由細胞原生質的可溶性部分和極微小的顆粒所組成，這些組分則需要更嚴格的離心方法才能分離出來第十七頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一2)一般密度梯度離心法也稱分級區(qū)帶離心，有：1）蔗糖密度梯度離心2）氯化銫密度梯度離心用于RNA-DNA混合物、核蛋白體亞單位和其他細胞成分的分離第十八頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一一般密度梯度離心法：把樣品鋪放在一個連續(xù)的液體密度梯度上，然后進行離心，并控制離心分離的時間，使得粒子完全沉降之前，在液體梯度中移動而形成不連續(xù)的分離區(qū)帶。第十九頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一一般密度梯度離心圖示第二十頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一3)等密度梯度離心法等密度梯度離心法：不同粒子存在密度差時，在離心力場作用下，粒子或向下沉降，或向上浮起，一直移動到與它們密度恰好相等的位置上（即等密度點）并形成區(qū)帶，此即等密度梯度離心法。第二十一頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一等密度梯度離心法第二十二頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一三、離心過濾 1）離心過濾的原理以離心力作為推動力完成過濾操作,具有離心和過濾的雙重作用。2）影響離心過濾速度的因素過濾面積和離心力第二十三頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一離心過濾機可分離固體密度大于或小于液體密度的懸浮液?？煞譃?連續(xù)式離心機和間歇式離心機。第二十四頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一第二節(jié)細胞破碎細胞破碎：指選用物理，化學，酶或機械的方法來破壞細胞壁或細胞膜。第二十五頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一一、細胞壁結構細胞壁化學組成非常復雜,取決于微生物類型細胞的年齡細胞的生長生理學多糖，脂質，蛋白質在三維結構上的排列方式第二十六頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一細胞壁的結構第二十七頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一二、細胞破碎率破碎率：被破碎細胞的數(shù)量占原始細胞數(shù)量的百分數(shù)。1）直接記數(shù)法2）間接記數(shù)法第二十八頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一1）直接記數(shù)法平板計數(shù)技術需時長；只有活細胞才能計數(shù)；會產生誤差血球細胞器上用顯微鏡計數(shù)快速而簡單，但細胞小計數(shù)困難第二十九頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一2）間接記數(shù)法在細胞破碎后，測定懸浮液中細胞釋放出來的化合物的量（如可溶性蛋白，酶等）。將破碎后的細胞懸液離心去掉固體（完整細胞和碎片），然后對上清液進行含量或活性分析。酶活性是破碎程度的很好指示參數(shù)。第三十頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一三、細胞破碎的方法破碎方法機械法非機械法固體剪切作用液體剪切作用珠磨法壓榨法高壓勻漿超聲破碎酶溶法化學法物理法第三十一頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一1）珠磨法（圖3-6）作用機理：微生物細胞懸浮液與極細的研磨劑在攪拌漿作用下充分混勻，珠子之間及珠子與細胞之間相互剪切、碰撞，促使細胞壁破裂，釋放出內含物。第三十二頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一影響因素：①轉盤轉速：破碎比速度與轉盤速度成正比。②細胞濃度：最佳濃度應由實驗確定。濃度大，產生的熱量大，但單位細胞重量所消耗的功率小。③珠粒大小：在一定范圍內，磨珠越小，破碎速度越快，但也不能過小。第三十三頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一④溫度：將溫度控制在5～40℃對破碎物影響較小。⑤流量：流量大，加工單位質量細胞消耗的能量減小，但細胞的破碎程度和蛋白質的釋放量會降低。第三十四頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一

溫控與能耗珠磨機是采用夾套冷卻的方式實現(xiàn)溫度控制的，一般情況下能將溫度控制在要求的范圍內；珠磨機的能耗與細胞破碎率成正比；高的破碎率會提高分離的成本。第三十五頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一2)高壓勻漿法（圖3-8）作用機理從高壓室壓出的細胞懸浮液，經(jīng)過閥座的中心孔道從閥座和閥桿之間的小環(huán)隙中噴出，速度可達幾百米每秒。這種高速噴出的懸液又射擊到靜止的碰撞環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。第三十六頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一

溫控與能耗活性物質在破碎過程中的失活問題。蛋白質和酶的失活主要由勻漿過程中產生的熱引起。如果能將溫度控制在35oC以下，酶失活的損失可以忽略。提高壓力有利于細胞破碎，但需增加能耗。機械破碎的能耗主要包括提供動力消耗的能量及低溫操作消耗的能量。第三十七頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一3)超聲波法作用機理聲頻高于15～20KHz的超聲波在高強度聲能輸入可以引起空化現(xiàn)象，使氣泡形成、脹大和破碎的現(xiàn)象。第三十八頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一此法多適用于微生物材料、細胞培養(yǎng)材料的破碎；因超聲波處理時產熱較多，故應用此法時，需要采取降溫措施；另外，某些核酸及酶對超聲波敏感，慎用此法。第三十九頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一超聲波破碎過程效率的影響因素：①聲頻②聲能③處理時間④細胞濃度⑤菌種類型第四十頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一四)化學滲透法

用化學藥品改變細胞壁或膜的通透性，從而使內含物有選擇地滲透出來，這種處理方式稱為化學滲透法。作用機理化學滲透取決于化學試劑的類型及細胞壁和膜的結構與組成。不同試劑對各種微生物細胞作用的部位和方式有所差異。第四十一頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一有機溶劑（苯、甲苯）表面活性劑有些動物細胞，例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）表面活性劑處理法使細胞膜破壞。金屬螯合劑（EDTA）變性劑（鹽酸胍、脲）第四十二頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一五)酶溶法

用生物酶將細胞壁和細胞膜消化溶解的方法。溶菌酶、?-1，3-葡聚糖酶、?-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鏈內切酶等。第四十三頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一作用機理溶酶具有高度專一性，蛋白酶只能水解蛋白質，葡聚糖酶只能水解葡聚糖，因此，利用溶酶系統(tǒng)處理細胞必須根據(jù)細胞的結構和化學組成選擇適當?shù)拿?，并確定相應的使用次序。第四十四頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一酶溶法的優(yōu)點：①產品釋放的選擇性高②抽提的速率和收率高③產品的破壞最少④對pH和溫度等外界條件要求低⑤不殘留細胞碎片第四十五頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一六)物理法①滲透壓沖擊法②反復凍融法多用于動物細胞。將細胞在-20℃以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由于細胞內冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。③低溫玻璃化法指從超微結構上損傷細胞，使細胞壁、細胞膜等成分遭受破壞。第四十六頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一各種破碎方法的比較及選擇分類具體方法優(yōu)缺點及適用范圍機械破碎法珠磨法破碎率高，適用范圍廣，但后處理復雜高壓均漿法破碎率高，可大規(guī)模操作，適用范圍小超聲波破碎適用于實驗室小規(guī)模操作物理破碎法凍融法操作簡便，但不適用于對冷凍敏感的細胞低溫玻璃化成本高，適用于實驗室小規(guī)模生產化學滲透法加入特定化學試劑選擇性高，細胞碎片大，后處理容易；但作用時間長，適用范圍小酶溶法加入酶選擇性高，細胞碎片大，后處理容易；但成本高，適用范圍小第四十七頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一細胞破碎技術的發(fā)展方向①多種破碎方法相結合②與下游過程相結合破碎過程要易于細胞碎片的除凈。③與上游過程相結合培養(yǎng)基、生長期、操作參數(shù)等。第四十八頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一第三節(jié)胞內產物的溶解及復性一、包含體及其形成二、包含體的分離和溶解三、蛋白質復性第四十九頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一（一）包含體及其形成

1)包含體的概念在基因工程菌細胞內表達的重組蛋白，常常互相交聯(lián)在一起，形成不溶性的聚積物，通常稱為包含體。第五十頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一包含體在相差顯微鏡下呈現(xiàn)為許多個高度折光的顆粒，含有這些包含體的大腸桿菌的菌體變大，并出現(xiàn)突起部分。在電鏡下，包含體是無明顯的膜存在，大致為圓形，直徑可達1微米。包含體第五十一頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一包涵體存在于包含體內的重組蛋白通常無生物活性，其形成與否取決于蛋白質的類型。含有二硫鍵的真核生物蛋白質，在原核生物中進行表達，常常因重組蛋白內及分子間二硫鍵的錯配，而產生無活性的蛋白質，成為不溶性的物質。第五十二頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一包含體形成的原因①產生少量蛋白時，可溶，量過多時，在細胞內超過其溶解度而沉淀；②蛋白質合成速度太快，肽鏈來不及形成正常的折疊構象，導致分子間因疏水作用聚合而不溶，生物活性受影響；第五十三頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一③高表達的蛋白沒有形成正常的二硫鍵，或宿主細胞內氧化還原等條件不同而生成不同的-S-S-；④蛋白的溶解需要與其他成分結合或經(jīng)其他成分誘導形成適當?shù)目扇苄詷嬒?，當產生的蛋白量過多，所需其他成分相對不足，如折疊酶，分子伴侶等。第五十四頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一⑤包含體的形成亦與蛋白質自身穩(wěn)定性有關。第五十五頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期一二、包含體的分離和