第二章分子克隆的工具酶

第二章分子克隆的工具酶第一頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一切割位點(diǎn)可為獲得DNA的物理圖的特殊的標(biāo)記利用限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生特殊DNA片段的能力使得純化那些DNA片段成為可能獲得的限制性DNA片段可作為DNA操作中的基本介質(zhì)第二頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一任何物種都有排除異物保護(hù)自身的防御機(jī)制 免疫系統(tǒng) 細(xì)菌的限制與修飾系統(tǒng)限制性內(nèi)切酶修飾酶第三頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一第一節(jié)限制性內(nèi)切酶Restrictionendonuclease第四頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一一、限制與修飾Restrictionandmodification50年代初，發(fā)現(xiàn)hostcontrolledspecificity噬菌體具有代表性和普遍性其在不同宿主中的轉(zhuǎn)染頻率，在感染某一宿主后，再去感染其它宿主時(shí)受到限制的現(xiàn)象。第五頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一E.coliKE.coliBE.coliCKBC第六頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一E.coliKE.coliBE.coliCKBC11110-410-410-410-411第七頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一說(shuō)明K和B菌株中存在一種限制系統(tǒng)可排除外來(lái)的DNA10-4的存活率是由宿主修飾系統(tǒng)作用的結(jié)果甲基化：AN6甲基-腺膘呤

C5’甲基-胞嘧啶第八頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.限制酶的發(fā)現(xiàn)60年代，限制內(nèi)切酶和限制酶的概念1968年首次從E.coliK中分離限制性內(nèi)切酶需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等有特定的識(shí)別位點(diǎn)但沒(méi)有特定的切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)遠(yuǎn)離識(shí)別位點(diǎn)1000bp以上第九頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一1970年美國(guó)約翰·霍布金斯大學(xué)H.Smith偶然發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae）能迅速降解外源的噬菌體DNA細(xì)胞提取液可降解E.coliDNA但不能降解自身DNA

即HindII酶第十頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一5’...GTPyPuAC...3’3’…CAPuPyTG...5’GTCGACGTTAACGTCAACGTTGACYRPy表示嘧啶，Pu表示嘌呤第十一頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一5’...GAATTC...3’3’…CTTAAG...5’EcoRI第十二頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一3.限制酶的命名宿主屬名第一字母、種名頭兩個(gè)字母菌株或型號(hào)序號(hào)羅馬字HindIIEcoRI

第十三頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一例如：HindⅢ

Haemophilusinfluenzae（流感嗜血桿菌），ｄ：表示菌系為ｄ型血清型；

Ⅲ：表示分離到的第三個(gè)限制酶。Eco

RI—Escherichiacoli

RI

EcoRI表示基因位于Escherichiacoli中的抗藥性R質(zhì)粒上Hin

dⅢ—Haemophilus

influensaedⅢSac

I(II)—Streptomycesachromogenes

I(Ⅱ)第十四頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一第Ⅰ類酶（切割部位無(wú)特異性）：

如EcoB(大腸桿菌B株)、EcoK(大腸桿菌K株)分子量較大(約300000)，作用時(shí)需ATP、Mg++等輔助因子第Ⅱ類酶（切割部位有特異性）：

如EcoRI(大腸桿菌)、HindⅢ(嗜血桿菌)，分子量較小(約20000-100000)，作用時(shí)需Mg++存在4、限制性內(nèi)切酶的分類：III類識(shí)別位點(diǎn)嚴(yán)格專一（不是回文序列）：切點(diǎn)不專一，往往不在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)部。

NEB；Invitrogen公司；promega普洛麥格；TakaRa.第十五頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、限制酶的識(shí)別序列

2、識(shí)別特定堿基順序：2、1回文對(duì)稱序列（palindrome，從兩個(gè)方向閱讀其序列相同的序列）。1、限制酶識(shí)別序列長(zhǎng)度4，5，6個(gè)堿基對(duì)。4堿基酶識(shí)別位點(diǎn)在DNA分子中的頻率6堿基酶稀有切割限制酶第十六頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一R=AorGY=CorTM=AorCK=GorTS=CorGW=AorTH=AorCorTB=CorGorTV=AorCorGD=AorGorTN=AorCorGorT第十七頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

3、Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式

切點(diǎn)大多數(shù)在識(shí)別順序之內(nèi)限制酶切后產(chǎn)生兩個(gè)末端，末端結(jié)構(gòu)是５’-Ｐ和３’-ＯＨ

CC↓TCAGC

GGAGT↑CG

BbvcI第十八頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一三、限制酶產(chǎn)生的末端種類

1.粘性末端１）３’-端突起，２）５’-端突起，個(gè)數(shù)為２或４個(gè)核苷酸第十九頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一

2.平末端

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’

在對(duì)稱軸上同時(shí)切割DNA的兩條鏈

HaeIIIGG↓CCEcoRVGAT↓ATCXmnIGAANN↓NNTTC

第二十頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一3.非對(duì)稱突出端①來(lái)自非對(duì)稱識(shí)別序列

CCTCAGCBbvCIGGAGTCG第二十一頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一

②簡(jiǎn)并序列

AccI

GT/MKACGTATACGTAGACGTCTACGTCGAC第二十二頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一

③間隔序列

DraIIICACNNNGTGEarICTCTTC(1/4)GAGAAG第二十三頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一4.同裂酶

1.定義：能識(shí)別相同序列但來(lái)源不同的兩種或多種限制酶

2.特點(diǎn)：1）識(shí)別相同順序

2）切割位點(diǎn)的異同

KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG

第二十四頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一①同序同切這些酶識(shí)別序列和切割位置都相同

HindIIHincII

GTY/RAC

HpaIIHapII

C/CGG

MobISau3AI

/GATC第二十五頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一②同序異切KpnIGGTAC/CAcc65IG/GTACCAsp718IG/GTACCAatIIGACGT/CBsaHIGR/CGYC識(shí)別的序列是相同的，但它們的切割位點(diǎn)不同第二十六頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一③“同功多位”EcoRIG/AATTCApoIR/AATTYHpaIGTT/AACHincIIGTY/RAC許多識(shí)別簡(jiǎn)并序列的限制酶包含了另一種限制酶的功能。如EcoRⅠ識(shí)別和切割位點(diǎn)為G↓AATTC，ApoⅠ識(shí)別和切割位點(diǎn)為R↓AATTY，后者可識(shí)別前者的序列。第二十七頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一④其它

SalI

G/TCGAC

AccI

GT/MKAC

HincII

GTY/RAC第二十八頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一

許多不同的限制酶來(lái)源各異，識(shí)別的靶子序列也各不相同，但切割DNA產(chǎn)生的末端是相同的，且是對(duì)稱的，即它們可產(chǎn)生相同的粘性突出末端。這些酶統(tǒng)稱為同尾酶。這些酶切割DNA得到的產(chǎn)物可進(jìn)行粘端連接。5、同尾酶（isocaudamer）：GATC4個(gè)核苷酸組成的粘性末端平端同裂酶第二十九頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一四、DNA末端長(zhǎng)度對(duì)限制酶切割的影響

限制酶切割DNA時(shí)對(duì)識(shí)別序列兩端的非識(shí)別序列有長(zhǎng)度的要求，也就是說(shuō)在識(shí)別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。

雙酶切PCR產(chǎn)物第三十頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一2hr20hrAccICCGGTCGACCGG00HindIIICAAGCTTG00CCAAGCTTGG00CCCAAGCTTGGG10%75%EcoRIGGAATTCC>90>90

第三十一頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一PstI

GCTGCAGC00TGCACTGCAGTGCA1010AACTGCAG(N)14

>90>90

CTGCAG(N)2000第三十二頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一1、保護(hù)堿基

限制性內(nèi)切酶識(shí)別特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白還要占據(jù)識(shí)別位點(diǎn)兩邊的若干個(gè)堿基，這些堿基對(duì)內(nèi)切酶穩(wěn)定的結(jié)合到DNA雙鏈并發(fā)揮切割DNA作用是有很大影響的，被稱為保護(hù)堿基。PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)，為保護(hù)5’端外加的內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，使酶切完全而添加.第三十三頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一

比如設(shè)計(jì)引物5'端導(dǎo)入酶切位點(diǎn)的時(shí)候,一般導(dǎo)入3–4個(gè);導(dǎo)入的堿基,最好是A/G/C/T比較平均,并能部分平衡整個(gè)引物的GC%和Tm;G/C為主,可以使引物5'形成所謂GCClamp(有的軟件,認(rèn)為這樣好).別的就沒(méi)什么了.加幾個(gè)和加哪幾個(gè)的問(wèn)題/techinfo/re/restrdigpcrii.htm第三十四頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一

載體的酶切位點(diǎn)也會(huì)碰到，相臨的2個(gè)酶切位點(diǎn)往往不能同時(shí)使用，因?yàn)橐粋€(gè)位點(diǎn)切割后留下的堿基過(guò)少以至于影響旁邊的酶切位點(diǎn)切割。第三十五頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一第三十六頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一第三十七頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIEcoRIPstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base第三十八頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIEcoRIPstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base第三十九頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIPstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base第四十頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base第四十一頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base第四十二頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIPstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base第四十三頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一EcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIPstI第四十四頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一EcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiencyXhoI97%1basePstI37%1base...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIEcoRIPstIXhoI:

1EcoRI100%PstI:1EcoRI88%第四十五頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一五、位點(diǎn)偏愛(ài)(sitepreferences)單位酶:在建議使用的緩沖液及溫度下，在20l反應(yīng)液中反應(yīng)1小時(shí)，使1gDNA完全消化所需的酶量DNA第四十六頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一

某些限制酶對(duì)同一介質(zhì)中的有些位點(diǎn)表現(xiàn)出偏愛(ài)性切割，即對(duì)不同位置的同一個(gè)識(shí)別序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱作位點(diǎn)偏愛(ài)。第四十七頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一*1975EcoRI切割

phage(Lambda)中的5個(gè)位點(diǎn)，并不是隨機(jī)的，靠近右端的位點(diǎn)，比分子中間的位點(diǎn)切割快10倍。1.現(xiàn)象第四十八頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一*

有4個(gè)SacII位點(diǎn)三個(gè)在中央一個(gè)在右臂（Right-terminus）

at40,386

中央三個(gè)快50倍第四十九頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一NEB檢測(cè)了許多限制酶，有許多酶的差異在10倍的范圍上，但有許多酶有較大的差異,如NarI,NaeISacIIGGCGCC,GCCGGC,CCGCGG第五十頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一(1)pBR322含4個(gè)NarI位點(diǎn)1單位酶1hr(標(biāo)準(zhǔn)條件)將兩個(gè)位點(diǎn)完全切割但是另外兩個(gè)位點(diǎn)50單位,16小時(shí)不能完全切割完全第五十一頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一(2)NaeI在pBR322也有4個(gè)位點(diǎn)，其中兩個(gè)易切割，有一個(gè)有點(diǎn)慢,第四個(gè)慢50倍。在

DNA上NarI和NaeI各都有一個(gè)位點(diǎn)，但是過(guò)量的酶只能完成部分酶切。第五十二頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.原因(1)

在切割DNA之前需要同時(shí)與兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)相作用第五十三頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一plasmidPlasmid/SalIPlasmid/EagI第五十四頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一六、酶切反應(yīng)條件任何一個(gè)提供商都會(huì)標(biāo)明其產(chǎn)品的最佳作用條件第五十五頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一(一)緩沖液1.常規(guī)緩沖液pH,Mg++,DTT,BSA(10X)Mg2+的作用是提供二價(jià)的陽(yáng)離子。巰基試劑對(duì)于保持某些核酸內(nèi)切限制酶的穩(wěn)定性是有用的，而且還可保護(hù)其免于失活。第五十六頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一①pH7.0-7.9(at25℃)Tris-HCl,乙酸

Tris-HCL的作用在于，使反應(yīng)混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳數(shù)值的范圍之內(nèi)。②離子強(qiáng)度：NaCl高中低100mM50mM0第五十七頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一③Mg++10mMMgCl2,MgAc④DTT(dithiothreitol,二硫蘇糖醇)1mM⑤100g/mlBSA少數(shù)需要第五十八頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一

不同酶具有不同Buffer

各公司設(shè)立幾種常用BufferNEBuffer1NEBuffer2NEBuffer3NEBuffer4BufferABufferBBufferHBufferLRoche第五十九頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一

對(duì)DNA進(jìn)行雙酶切時(shí)，如何選擇緩沖液是相當(dāng)重要的。一方面可選用都合適的緩沖液或通用緩沖液；若找不到共用的緩沖液則先用低濃度的，再加適量NaCl和第二種酶；或先用低鹽緩沖液再用高鹽緩沖液（DNA可純化或不純化）。第六十頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.通用緩沖體系

Phamacia法瑪西亞

One-Phor-Allbufferplus,OPA+第六十一頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一3.注意事項(xiàng)a.取少量酶(方法or稀釋)b.最后加酶、盡快操作c.減少反應(yīng)體積d.反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)e.分裝（對(duì)于多個(gè)反應(yīng)）第六十二頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一(二)反應(yīng)溫度大多數(shù)為37℃一部分為50-65℃少數(shù)25-30℃高溫作用酶于37℃時(shí)活性多數(shù)10-50%TaqI(65℃)10%,ApoI(50℃)50%第六十三頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一(三)反應(yīng)時(shí)間

1hrormore許多酶延長(zhǎng)其反應(yīng)時(shí)間可減少酶的用量16hrEcoRI0.13(1/8)HindIII(1/8)KpnI(1/4)BamHI(1/2)HaeIII(1/1)第六十四頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一(四)反應(yīng)終止EDTA終10mMEDTA可鏊合鎂離子，從而可終止酶切反應(yīng)2.加熱

37℃酶65℃20minotherwise80℃20min第六十五頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一不失活在80℃20min的酶37℃：Bg1IIHpaIPvuII65℃：Tth111ITspRI50℃：Bc1I第六十六頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一3.其它

DNA純化(苯酚,試劑盒)第六十七頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一七、星星活性(staractivity)

非特異性切割在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識(shí)別序列相似的序列，這個(gè)改變的特殊性稱星星活性1.概念第六十八頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一實(shí)際上星星活性是限制內(nèi)切酶的一般性質(zhì)，任何一種限制酶在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下都能切割非典型位點(diǎn)。ApoI、AseI、BamHI、BssHII、EcoRI、EcoRV、HindIII、Hinf1、KpnI、PstI、PvuII、SalI、ScaI、TaqI、XmnI第六十九頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.酶的特異性變化方式與酶的種類和所應(yīng)用的條件有關(guān)最普遍的活性變化1個(gè)堿基的變化識(shí)別位點(diǎn)外層堿基的隨意性以及單鏈缺口第七十頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一3.引起星星活性的因素①高濃度甘油（>5%）②酶過(guò)量（>100U/g）③低離子強(qiáng)度（<25mM）④高pH(>pH8.0)第七十一頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一⑤有機(jī)溶劑PMSD(二甲基亞砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）、sulphalane⑥用其它二價(jià)陽(yáng)離子代替Mg++Mn++，Cu++，Co++,Zn++第七十二頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一不同的酶對(duì)上述條件的敏感性不一樣PstI比EcoRI對(duì)高pH更敏感但后者對(duì)甘油濃度更敏感星星活性在絕大多數(shù)情況下，是可控制的第七十三頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一4.抑制星星活性的條件（措施）①減少酶的用量，避免過(guò)量酶切,減少甘油濃度②保證反應(yīng)體系中無(wú)有機(jī)溶濟(jì)或乙醇③提高離子強(qiáng)度到100～150mM(如果不會(huì)抑制的話)④降低反應(yīng)pH至pH7.0⑤使用Mg++作為二價(jià)陽(yáng)離子第七十四頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一1.外因外因是可預(yù)見(jiàn)和控制的，如反應(yīng)條件、底物的純度（是否有雜質(zhì)、是否有鹽酚的污染）、何時(shí)加酶、操作是否恰當(dāng)、反應(yīng)體積的選擇以及反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短等等。

九、影響活性的因素第七十五頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.“內(nèi)因”①位點(diǎn)偏愛(ài)性

②甲基化③底物的構(gòu)象構(gòu)象的影響主要指切割線性DNA和超螺旋DNA時(shí)的活性，如與切割DNA相比，EcoRⅠ、PstⅠ、SalⅠ需要至少2.5-10倍的酶來(lái)切割pBR322的超螺旋DNA。

PaeRTⅠ與XhoⅠ切割相同的序列（C↓TCGAG），但如果5'端為CT則

PaeRTⅠ不能切割。第七十六頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一十、酶切位點(diǎn)的引入（酶切水平）第七十七頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一1.產(chǎn)生的5’突出端補(bǔ)平后連接EcoRIGAATTCCTTAAG第七十八頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIEcoRIPstI第七十九頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoIPstI第八十頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstI第八十一頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstI第八十二頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstIAATTTTAA第八十三頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstIAATTTTAA第八十四頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一...CTCGAGGAATTCCTGCAG......GAGCTCCTTAAGGACGTC...

XhoI

PstIAATTTTAA

AceIATTAAT

XmaIGAANNNNTTC

第八十五頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.同尾末端的連接BamHI(G/GATCC)+BclI(T/GATCA)

AlwI(GGATC4/5)第八十六頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一3.平端連接PvuII(CAGCTG)+EcoRV(GATATC)

MobI(GATC)第八十七頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一十一、酶切位點(diǎn)在基因組中分布的不均一性GC%酶切位點(diǎn)出現(xiàn)的機(jī)率BamHIGGATCCEcoRIGAATTC第八十八頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一在基因組中，堿基對(duì)的排列是非均勻的因此盡管GC含量相同的酶切位點(diǎn)，在基因組中出現(xiàn)的機(jī)率是不一樣的平均片段大小在E.coliAscI(GGCGCGCC)20kbNotI(GCGGCCGC)200kbEcoRI/HindIII5kbSpeI(ACTAGT)60kb第八十九頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一·細(xì)菌基因組在大多數(shù)富含A+T的細(xì)菌中，CCG和CGG的排列是最少見(jiàn)的，所以含有這兩種序列的識(shí)別序列出現(xiàn)的機(jī)率就非常少·酵母基因組G+C%為38%，因此在重復(fù)序列之外(tRNAorTyelements)，富含G+C的識(shí)別序列就特別少第九十頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一哺乳動(dòng)物細(xì)胞核基因組的G+C為41%，其中CG的序列比想象的低5倍之多，因此含CG序列的酶切位點(diǎn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞就相當(dāng)稀少。但是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，大多數(shù)CG序列是甲基化的第九十一頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一第二節(jié)甲基化酶

MethylaseMethylation methyltransferase第九十二頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一一、甲基化酶的種類在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶，在E.coli中大多數(shù)都有三個(gè)位點(diǎn)特異性的DNA甲基化酶第九十三頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一1.Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基第九十四頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一PvuIIBamHIBclIBglIIXhoII

MboISau3AI

識(shí)別位點(diǎn)中含GATC序列

ClaI(1/4)XbaI(1/16)TaqI(1/16)

MboII(1/16)HphI(1/16)部分識(shí)別序列含GATC序列4個(gè)ClaI位點(diǎn)(ATCGATN)中有一個(gè)該序列第九十五頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一有些限制酶對(duì)Dam甲基化敏感不能切割相應(yīng)的序列BclI,ClaI,MboI,XbaI等不敏感的有BamHI,Sau3AI,BglII,PvuI等第九十六頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一一般哺乳動(dòng)物DNA不會(huì)在A-N6上甲基化當(dāng)需要在敏感位點(diǎn)上完全切割DNA時(shí)，必須從dam-

E.coli中提取DNA第九十七頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.Dcm甲基化酶識(shí)別CCAGG或CCTGG序列在第二個(gè)C上C5位置上引入甲基第九十八頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一EcoRII/BstNI

CCA(T)GG二者識(shí)別序列相同，但切點(diǎn)不同EcoRII受dcm甲基化作用影響B(tài)stNI可避免這一影響第九十九頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一受影響酶有：Acc65IGGTACCAlwNIApaIGGGCCCEcoRIIEaeI等不受影響酶有：KpnI

GGTACCBanIIBg1IBstNINarIGGCGCC等第一百頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、甲基化對(duì)限制酶切的影響1.修飾酶切位點(diǎn)①HincIIGTCGACGTCAACGTTGACGTTAACM.TaqI甲基化TCGA中的A，所以M.TaqI處理DNA后，GTCGAC將不受HincII切割第一百零一頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一②BamHIGGATCC

M.MspIm5CCGG如果BamHI前面為CC或后面為GG，那么M.MspI處理的DNA抵抗BamHI的切割第一百零二頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一③構(gòu)建DNA文庫(kù)時(shí)用AluI(AG↓CT)和HaeIII(GG↓CC)部分消化基因組DNA用M.EcoRI甲基化酶處理，然后加上合成的EcoRI接頭當(dāng)再用EcoRI來(lái)切割時(shí)只有接頭上的位點(diǎn)可被切割第一百零三頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.產(chǎn)生新酶切位點(diǎn)TCGATCGAAGCTAGCT

TaqITaqIM.TaqITCGA*TCGA*

*AGCT*AGCTDpnI第一百零四頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一第三節(jié)DNA聚合酶DNApolymerase催化DNA的合成(模板/引物/dNTP等)及其相輔的活性第一百零五頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一第一百零六頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一

真核細(xì)胞有4種DNApoly：也許是復(fù)合物，位于細(xì)胞核內(nèi)，有催化細(xì)胞增生的作用。：小分子蛋白質(zhì)（4.4kDa）曾從小牛胸腺出提出，與細(xì)胞增生無(wú)關(guān)。：100kDa，利用RNA為模板的效率比利用DNA為模板的效率高。其它：線粒體DNA聚合酶、催化線粒體DNA的合成。第一百零七頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一原核細(xì)胞三種DNA聚合酶，都與DNA鏈的延長(zhǎng)有關(guān)I．單鏈多肽，可催化單鏈或雙鏈DNA的延長(zhǎng)II與低分子脫氧核苷酸鏈的延長(zhǎng)有關(guān)III在細(xì)胞中存在的數(shù)目不多，是促進(jìn)DNA鏈延長(zhǎng)的主要酶一、大腸桿菌DNA聚合酶IEcoliDNApolymeraseI第一百零八頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一1.活性單鏈多肽(109kDa)

三種活性①5’→3’DNA聚合酶活性底物:模板(ssDNA),引物（帶3‘OH基）或5’突出DsDNAMg2+dNTPDNApolyI第一百零九頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一②5’→3’外切核酸酶活性底物:dsDNAorDNA:RNA雜交體活性：從5’端降解dsDNA，也降解

RNA:DNA中的RNA(RNaseH活性)Mg2+

DNApolyI+dNTP第一百一十頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一③3’→5’外切酶活性底物：3’-OHdsDNAorssDNA活性：從3’-OH端降解DNA，可被5’→3’聚合活性封閉。Mg2+

DNApolyI+dNTPMg2+

DNApolyI+dNTPProofreading第一百一十一頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一反應(yīng)平衡過(guò)量dNTP平端第一百一十二頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.用途①切口平移法標(biāo)記DNANicktranslation（所有DNApoly中只有此有此活性）第一百一十三頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一Mg2+,低限量DNaseIdNTPDNApolyI產(chǎn)生切口切口平移外切活性和合成活性共同作用使切口沿5’--3’方向平移若有放射性dNTP,則可標(biāo)記成探針第一百一十四頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一②用于cDNA克隆中的第二鏈即單純的DNA聚合活性但由于有5’---3’外切活性，已不再使用，而改用Klenow酶和反轉(zhuǎn)錄酶第一百一十五頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一③末端標(biāo)記（交換或置換反應(yīng)）Mg2+,DNApolyI[-P32]dATPA*TT4DNApolyT7DNApoly更好第一百一十六頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、Klenow酶E.coliDNApolymeraseIlargefragmentKlenowfragment在蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶）裂解,從全酶中除去5’—3’外切活性片段，而聚合活性和3’—5’外切活性不受影響，或基因工程而得76kDa第一百一十七頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段Klenow聚合酶或Klenow大片段酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ

DNA聚合酶Ⅰ全酶

大片段Klenow

小片段具有5′→3′的聚合活性和3′→5′核酸外切酶活性，5′→3′的核酸外切酶活性枯草桿菌蛋白酶第一百一十八頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一1.活性共兩種,同DNApolyI2.作用①補(bǔ)平3’凹端，注意要用dNTP②抹平3’凸端，注意必須加足量dNTPT4和T7具更強(qiáng)3’--5’外切活性。③末端標(biāo)記

A．置換反應(yīng)同前,同樣被T4poly代替

B．補(bǔ)平3’--凹端的過(guò)程進(jìn)行標(biāo)記第一百一十九頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一第一百二十頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一第一百二十一頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一④cDNA克隆中合成第二鏈⑤隨機(jī)引物標(biāo)記⑥D(zhuǎn)NA測(cè)序（Sanger雙脫氧鏈末端終止法）被T7取代，Taq等PCR酶。⑦PCR反應(yīng)被Taq等取代⑧在體外誘變中，用于從單鏈模板合成dsDNA僅利用DNA合成活性第一百二十二頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一三、T4噬菌體DNA聚合酶T4DNApolymerase來(lái)源于T4phage感染的E.coli

114kDa第一百二十三頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一1.活性由噬菌體基因編碼的，具有兩種酶催活性，即5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性。與Klenow酶相似，但3’—5’外切活性強(qiáng)200倍

第一百二十四頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.用途①補(bǔ)平或標(biāo)記3’

凹端必須有高濃度dNTP（末端標(biāo)記）②置換反應(yīng)必須有高濃度dNTP(一種)末端標(biāo)記第一百二十五頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一③標(biāo)記DNA片段即利用外切活性產(chǎn)生了3’凹端再補(bǔ)平（用標(biāo)記的dNTP）第一百二十六頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一第一百二十七頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一T4DNA聚合酶和取代合成法標(biāo)記DNA片段第一百二十八頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一四、T7噬菌體DNA聚合酶T7DNApolymerase來(lái)源于T7phage感染的E.coli為兩種緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合體(基因5蛋白和宿主的硫氧還蛋白)第一百二十九頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一T7DNApoly為持續(xù)合成能力最強(qiáng)的一個(gè)平均長(zhǎng)度要大得多,在測(cè)序時(shí)具有優(yōu)勢(shì)活性/功能與T4DNApoly、Klenow類似但3’→5’外切活性為Klenow的1000倍用途:A.替代T4的功能B.長(zhǎng)模板的引物延伸第一百三十頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一修飾的T7DNApolymerase99%3’—5’外切活性被除去（V1.0）完全除去（V2.0）用于測(cè)序反應(yīng)（測(cè)序酶）SequenaseUSBBiochemical第一百三十一頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一1.特點(diǎn)：

分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應(yīng)溫度75℃，對(duì)95℃高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在3’→5’外切酶活性2.用途：

主要用于DNA的體外擴(kuò)增，經(jīng)25次循環(huán)后才進(jìn)入酶的反應(yīng)穩(wěn)定期，一個(gè)DNA分子因而可被擴(kuò)增4×106倍

DNA擴(kuò)增技術(shù)又稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它包括以下三個(gè)步驟：

DNA模板變性(95℃)→與DNA引物退火(45℃)→

引物延伸(75℃)

五.TaqDNA聚合酶耐熱DNA聚合酶第一百三十二頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一六、反轉(zhuǎn)錄酶Reversetranscriptase依賴于RNA的DNA聚合酶1．種類來(lái)自AMV禽成髓細(xì)胞瘤病毒Mo-MLV(M-MuLV)Moloney鼠白血病病毒5’→3’合成DNA無(wú)3’→5’外切活性第一百三十三頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一第一百三十四頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一①AMV

二鏈多肽(62kDa/94kDa)具5’→3’DNA聚合活性具很強(qiáng)的RNA酶H活性(降解與DNA雜交的RNA)在反應(yīng)開(kāi)始時(shí),引物和mRNA模板雜交體可成為RNaseH的底物,此時(shí)模板的降解和cDNA的合成相競(jìng)爭(zhēng)第一百三十五頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一反應(yīng)終止時(shí)，RNaseH可在正在增長(zhǎng)的

DNA鏈近3’端切割模板趨向于抑制cDNA的產(chǎn)量并限制其長(zhǎng)度但在42℃(雞的正常體溫),能有效發(fā)揮DNA合成作用，能有效地拷貝較復(fù)雜的mRNA

早期提純過(guò)程中易被內(nèi)切酶污染,cDNA不超過(guò)1kb,現(xiàn)已解決第一百三十六頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一HighFidelityPrimeScriptRT-PCRKit是用于從TotalRNA或mRNA高保真合成cDNA的2StepRT-PCR試劑盒。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用了TaKaRa獨(dú)自開(kāi)發(fā)的反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScriptRTase，該酶是一種新型的RNaseH-型反轉(zhuǎn)錄酶，無(wú)RNaseH活性，不會(huì)分解模板RNA，能夠有效合成長(zhǎng)鏈的1st-strandcDNA。本反轉(zhuǎn)錄酶具有極強(qiáng)的延伸能力，即使對(duì)有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA，在42℃條件下也能得到良好的反應(yīng)效果，無(wú)需進(jìn)行高溫反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，因?yàn)楦邷氐姆崔D(zhuǎn)錄反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致RNA的降解。PCR反應(yīng)選用兼具高保真和高效擴(kuò)增性能的PrimeSTARHSDNAPolymerase，可以很好地應(yīng)用于cDNA克隆等對(duì)保真性要求高的實(shí)驗(yàn)。使用本試劑盒擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物幾乎都為平滑末端，可克隆于平滑末端的載體中。

第一百三十七頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一②M-MuLV

M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶是一種依賴于RNA和DNA的DNA聚合酶。它可以單鏈RNA、DNA或RNA-DNA雜合鏈為模板，以RNA或DNA為引物啟動(dòng)DNA合成。該酶帶有針對(duì)RNA-DNA雜合鏈中RNA的RNaseH活性。本產(chǎn)品來(lái)源于帶有編碼莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MLV）逆轉(zhuǎn)錄酶的pol基因片段的E.coli菌株。單肽84kDaRNaseH活性弱利于合成較長(zhǎng)cDNA第一百三十八頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一2．用途①cDNA克?、跍y(cè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)（引物延伸法）③5’突出DNA的補(bǔ)平④測(cè)序反應(yīng)(當(dāng)用DNApolyI,Klenow或測(cè)序酶不理想時(shí))⑤其它RT-PCRRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)第一百三十九頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一3.活性①5’→3’DNA聚合活性（Mg++）

RNAorDNA模板及帶3’OH的RNA或DNA引物②RNaseH活性RNaseH-突變第一百四十頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一4.注意事項(xiàng)

①無(wú)3’→5’外切校正作用，在高dNTP和Mn2+時(shí)，每500個(gè)bases會(huì)有一個(gè)誤摻入。②為防止新合成的DNA提前終止，需高濃度dNTP。③單鏈拷貝，也可雙鏈合成（自身序列為引物，但效率低）,50g/ml放線菌毒D，抑制第二鏈合成。第一百四十一頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一七、末端轉(zhuǎn)移酶來(lái)源于小牛胸腺,存在于前淋巴細(xì)胞及分化早期的類淋巴樣細(xì)胞內(nèi)的一種不尋常的DNApoly在二價(jià)陽(yáng)離子存在下，末端轉(zhuǎn)移酶催化dNTP加于DNA分子的3’羥基端T,C→首選Co2+A,G→首選Mg2+Terminaltransferase第一百四十二頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一1.底物DNA,可短至3個(gè)核苷酸,3’突出低離子強(qiáng)度時(shí),平端或3’凹出端DNA亦可但效率低2.用途①在3’端加同聚尾，cDNA或載體，用于克隆，或標(biāo)記②末端標(biāo)記ddNTP(標(biāo)記的)第一百四十三頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一37℃15min隨時(shí)間的延長(zhǎng)尾亦長(zhǎng)。3.同尾的長(zhǎng)度第一百四十四頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一第四節(jié)RNA聚合酶RNApolymerase來(lái)源于噬菌體感染宿主后所產(chǎn)生第一百四十五頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一SP6噬菌體聚合酶來(lái)源于感染鼠傷寒沙門(mén)氏菌LT2菌株T3或T7噬菌體聚合酶來(lái)源于感染的大腸桿菌第一百四十六頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一1.活性這些RNA聚合酶實(shí)際上為轉(zhuǎn)錄過(guò)程中RNA合成的酶，識(shí)別DNA中特異的啟動(dòng)子序列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。與DNA聚合酶不同，無(wú)需引物，但識(shí)別特異性位點(diǎn)第一百四十七頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.用途①體外：將這些RNA聚合酶特異性的啟動(dòng)子安裝在載體,如pGEM-3Z載體(2.74kb,p13)中，用于體外轉(zhuǎn)錄（合成）與外源DNA同源的RNA，從而用作雜交探針，體外翻譯系統(tǒng)中的mRNA，體外剪接反應(yīng)的底物第一百四十八頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一第一百四十九頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一②體內(nèi)：用于表達(dá)外源基因A.Ecoli先構(gòu)建宿主菌，將T7polyRNA基因置于lacUV5啟動(dòng)子之下，插入到噬菌體中，感染E.coli建立穩(wěn)定的溶原菌EcoliBL21(DE3)：lacUV5啟動(dòng)子+T7RNA聚合酶基因，置于噬菌體DE3區(qū)，該區(qū)整合于染色體的BL21處。第一百五十頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一若將T7噬菌體啟動(dòng)子控制的目的基因經(jīng)質(zhì)粒載體導(dǎo)入該宿主菌中在IPTG(異丙基硫代--D-半乳糖苷)誘導(dǎo)啟動(dòng)外源基因的表達(dá)另一種方法是，先導(dǎo)入重組質(zhì)粒，再用（帶T7RNApoly）感染，激活目的基因的表達(dá)第一百五十一頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一B．酵母菌酵母啟動(dòng)子+T7RNApolyin穩(wěn)定載體T7啟動(dòng)+外源基因in另一載體第一百五十二頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一第五節(jié)連結(jié)酶(Ligase)將兩段核酸連接起來(lái)的酶1.T4DNAligase

68kDaT4噬菌體感染大腸桿菌產(chǎn)生催化DNA5’磷酸基與3’羥基之間形成磷酸二脂鍵。這種反應(yīng)需要供給能量，大腸桿菌和其他細(xì)菌的DNA連接酶以NAD+作為能量來(lái)源，動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體的連接酶則以ATP作為能量來(lái)源。第一百五十三頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一①ATP+DNAligase(E)→E-AMP+PPi。②E-AMP上的AMP轉(zhuǎn)移到DNA的5’磷酸根上，使其活化，釋放出酶。③活化的5’磷酸根與相鄰的3’羥基形成3’，5’－磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。第一百五十四頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一

底物：DNAorRNA(效率低)

粘端，切口，平端

影響因素：

PEG（低濃度）10%

單價(jià)陽(yáng)離子（150-200mMNaCl）

提高平端連接速率第一百五十五頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一

Weiss單位在37℃下20min催化1nmol32p從焦磷酸根置換到[,-32P]ATP所需的酶量。

NEB單位(NewEnglandBiolabs)20l,16℃,30min,300g/ml(0.12M5’末端)/HindIII連接50%所需的酶量第一百五十六頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一/HindIII(7個(gè)切點(diǎn))23.1(kb)9.46.64.42.32.0564(bp)125

48502bp第一百五十七頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一

1Weiss=67粘端連接單位

(NEB單位)

(Molecularcloning寫(xiě)為60NEBunit)

1NEB單位=0.015Weiss單位第一百五十八頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一

條件

16℃～4hr4℃overnight

需ATP5min連接T4DNAligaseRoomtemperature(BoehringerMeinnham公司)第一百五十九頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一平頭雙鏈DNA片段的連接操作

從分子動(dòng)力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢的多。提高平頭末端連接效率的方法包括：①加大連接酶用量(10倍大于粘性末端的連接)。②加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)。③加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用。④加入單價(jià)陽(yáng)離子(NaCl),最終濃度150-200mmol/L。第一百六十頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.E.coliDNA

連接酶與T4DNAligase相似,但需煙酰胺-腺嘌呤二核苷酸(NAD+)參與平端連接效率低，用于置換合成法作cDNA克?。ú粚NA連接到DNA,不連接RNA）第一百六十一頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一第六節(jié)核酸酶(nuclease)一、BAL31核酸酶

來(lái)源于AlteromonasespejianaBAL3主要活性為3’外切核酸酶活性，可從線性DNA兩條鏈的3’端去掉除單核苷酸，還是一個(gè)內(nèi)切核酸(單鏈，nick,gap)

依賴Ca++EGTA可抑制活性第一百六十二頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一

連續(xù)去除3‘端單核苷酸后形成的單鏈DNA，可被內(nèi)切核酸活性降解用途：從兩頭縮短DNA(用于缺失突變等），活性發(fā)揮均勻，活性與酶濃度成線性關(guān)系確定DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)DNA限制酶切圖注：可能有單鏈突出，可用DNApoly補(bǔ)平，單鏈突出的長(zhǎng)度與酶濃度有關(guān)，如：2-5u/ml,平均有5個(gè)bases單鏈，10-20%保持平端第一百六十三頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、Sl核酸酶來(lái)源于米曲霉(Aspergillusoryzae)降解單鏈DNA或RNA，產(chǎn)生帶5’磷酸的單核苷酸或寡核苷酸對(duì)dsDNA，dsRNA；DNA:RNA不敏感酶量大可完全消化雙鏈，中量，可在切口或小缺口處切割雙鏈作用：用于分析DNA:RNA雜交體的結(jié)構(gòu)去掉突出的單鏈尾，以產(chǎn)生平端打開(kāi)雙鏈cDNA合成中產(chǎn)生的發(fā)莢環(huán)第一百六十四頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一三、綠豆核酸酶MungBeanNuclease

來(lái)源于綠豆芽與Slnuclease相似但比Sl更溫和在大切口上才切割可使DNA突出端變成平端第一百六十五頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一CCAAGCTTGGGGTTCGAACCCCAAGCTTGGGGTTCGAACCCCATGGGGTACCHindIIIMBNCCATGGGGTACCNcoI第一百六十六頁(yè)，共一百七十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一四、核糖核酸酶ARNaseA（來(lái)源于牛胰）內(nèi)切核酸酶可特異攻擊RNA上嘧啶殘基的3’端

形成

帶嘧啶3’磷酸的單核苷酸或末端帶嘧啶3’磷酸的寡核苷酸用途：除去DNA樣品中的RNA

除去DNA:RNA中未雜交的RNA區(qū)確定雜交體DNA的RNA中單突變的位置可能污染其它酶（如D