病原學(xué)免疫學(xué)及生化檢測(cè)

（優(yōu)選）病原學(xué)免疫學(xué)及生化檢測(cè)當(dāng)前第1頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)使用油鏡時(shí)，需在玻片上滴加香柏油。這是因?yàn)橛顽R的放大倍數(shù)較高，而透鏡很小，光線通過(guò)不同密度的介質(zhì)物體（玻片→空氣→透鏡）時(shí)，部分光線會(huì)發(fā)生折射而散失，進(jìn)入鏡筒的光線少，視野較暗，物體觀察不清。如在透鏡與玻片之間滴加和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），則使進(jìn)入油鏡的光線增多，視野亮度增強(qiáng)，物象清晰。當(dāng)前第2頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)一、微生物分類(lèi)微生物雖然個(gè)體微小，但具有一定的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能，所以按其結(jié)構(gòu)和組成的差異分為三大類(lèi)1、非細(xì)胞型微生物：體積微小，能通過(guò)濾菌器，只能在活細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，如病毒、噬菌體；2、原核細(xì)胞型微生物：僅有原始核，無(wú)核仁和核膜，缺乏完整的細(xì)胞器，如細(xì)菌、放線菌、支原體、衣原體；3、真核細(xì)胞型微生物：細(xì)胞核的分化程度較高，有核膜、核仁和染色體，胞質(zhì)內(nèi)有完整的細(xì)胞器，如霉菌、酵母菌、藻類(lèi)等。當(dāng)前第3頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)二、細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的條件1、充足的營(yíng)養(yǎng)。水、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子。2、合適的酸堿度。大多數(shù)為中性或弱堿性，即。個(gè)別細(xì)菌在較堿性的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。3、適宜的溫度。分為嗜冷菌、嗜熱菌、嗜溫菌。4、必要的氣體環(huán)境。主要是氧與二氧化碳。當(dāng)前第4頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)三、細(xì)菌群體的生長(zhǎng)繁殖分期1、遲緩期。此期中細(xì)菌體積增大，代謝活躍但不分裂，菌數(shù)并不增多。此期長(zhǎng)短不一，從數(shù)小時(shí)到數(shù)天不等，視菌種、菌齡與接種菌量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同而異。2、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)或指數(shù)期。此期中細(xì)菌生長(zhǎng)迅速，以恒定的速度進(jìn)行分裂繁殖，菌數(shù)以幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)，增長(zhǎng)極快。研究細(xì)菌的性狀最好選用此期的細(xì)菌。3、穩(wěn)定期。對(duì)數(shù)期后，細(xì)菌繁殖速度逐漸下降，細(xì)菌繁殖數(shù)與死亡數(shù)幾近相等，活菌數(shù)保持穩(wěn)定。4、衰亡期?；罹鷶?shù)急劇減少。當(dāng)前第5頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)當(dāng)前第6頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)四、細(xì)菌的染色1、分為單染法、復(fù)染法、特殊染色法、負(fù)染色法、熒光染色體法等。單染法：只用一種染液，可顯示細(xì)菌的形態(tài)與排列，不能顯示細(xì)菌的結(jié)構(gòu)與染色反應(yīng)的特性。原理：由于細(xì)菌在中性環(huán)境中一般帶負(fù)電荷，所以通常采用堿性染料如美藍(lán)、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫、孔雀綠、番紅等進(jìn)行染色。這類(lèi)染料解離后，染料離子帶正電荷，使細(xì)菌著色。當(dāng)前第7頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)復(fù)染法：用兩種以上不同顏色的染料進(jìn)行染色，除可觀察細(xì)菌的形態(tài)、排列、大小外，還能將細(xì)菌染成不同的顏色。常用的革蘭氏染色法和抗酸染色法即為復(fù)染法。當(dāng)前第8頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)2、革蘭氏染色法2.1原理：依據(jù)的是細(xì)菌的細(xì)胞壁組成成分和結(jié)構(gòu)的不同，革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁肽聚糖層厚，交聯(lián)而成的肽聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)致密，經(jīng)乙醇處理發(fā)生脫水作用，使孔徑縮小，通透性降低，結(jié)晶紫與碘形成大分子復(fù)合物保留在細(xì)胞內(nèi)而不被脫色，結(jié)果使細(xì)胞呈現(xiàn)紫色。而革蘭氏陰性菌肽聚糖層薄，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)少，而且類(lèi)脂含量較高，經(jīng)乙醇處理后，類(lèi)脂被溶解，細(xì)胞壁孔徑變大，通透性增加，結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物被溶出細(xì)胞壁，因而細(xì)胞被染色，再經(jīng)番紅復(fù)染后細(xì)胞呈紅色。當(dāng)前第9頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)2.2試劑：堿性染料草酸銨結(jié)晶紫液；媒染劑碘液，其作用是增強(qiáng)染料與菌體的親和力，加強(qiáng)染料與細(xì)胞的結(jié)合；脫色劑乙醇，將染料溶解，使被染色的細(xì)胞脫色。利用不同細(xì)菌對(duì)染料脫色的難易程度不同，而加以區(qū)分；復(fù)染液番紅溶液，目的是使經(jīng)脫色的細(xì)菌重新染上另一種顏色，以便與未脫色菌進(jìn)行比較。當(dāng)前第10頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)2.3操作過(guò)程標(biāo)本經(jīng)固定后，先用結(jié)晶紫染色、再加碘液媒染、然后用乙醇脫色，最后用沙黃或復(fù)紅復(fù)染。2.4意義依據(jù)革蘭氏染色可將細(xì)菌分為陽(yáng)性和陰性?xún)纱箢?lèi)。由于陽(yáng)性、陰性細(xì)胞壁等結(jié)構(gòu)上的差別可造成對(duì)抗生素的敏感性不同，臨床上依據(jù)此，可選擇性針對(duì)用藥。當(dāng)前第11頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)1.涂片固定2.單染—結(jié)晶紫染液第一次染色

1min

當(dāng)前第12頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)3.媒染—碘-碘化鉀溶液浸濕30S4.脫色—95%乙醇溶液進(jìn)行顏色洗脫5.復(fù)染—紅色的藩紅染液第二次染色

當(dāng)前第13頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)2.5注意事項(xiàng)制片是染色的關(guān)鍵，載片要清潔，不得沾污油脂，菌株才能涂布均勻。注意初次涂片時(shí)，取菌量不應(yīng)過(guò)大，以免造成菌體重疊。注意水流不得直接沖在涂菌處，以免將菌體沖掉。脫色是革蘭氏染色的關(guān)鍵，必須掌握乙醇的脫色程度。若脫色過(guò)度則陽(yáng)性菌被誤染為陰性菌，而脫色不夠時(shí)陰性菌被誤染為陽(yáng)性菌。（拉絲試驗(yàn)——未斷裂DNA螺旋）當(dāng)前第14頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)當(dāng)前第15頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)革蘭氏染色

1884年丹麥醫(yī)師Gram所發(fā)明當(dāng)前第16頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)紫色者為G＋菌，紅色者為G—菌細(xì)菌呈現(xiàn)第一次染色的效果紫色，革蘭氏陽(yáng)性菌（紫陽(yáng)G＋）；呈現(xiàn)第二次染色的效果紅色；稱(chēng)革蘭氏陰性菌（紅陰G-）當(dāng)前第17頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)當(dāng)前第18頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)五、細(xì)菌的培養(yǎng)和分離大多數(shù)細(xì)菌可以用人工方法培養(yǎng)，但必須根據(jù)不同細(xì)菌采取各自適宜的條件，如無(wú)菌技術(shù)、接種和分離方法、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等1、樣品處理標(biāo)本采集是否符合要求，直接影響細(xì)菌的檢測(cè)結(jié)果，因此要求除糞、痰、咽拭子等標(biāo)本，其他樣本均應(yīng)以無(wú)菌技術(shù)采集。標(biāo)本盛于無(wú)菌容器內(nèi)，根據(jù)目的菌的種類(lèi)采用不同的方法采集，標(biāo)本采集后及時(shí)冷藏送檢。當(dāng)前第19頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)2、無(wú)菌技術(shù)2.1細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)必須隨時(shí)防止污染和病原菌的擴(kuò)散，為達(dá)到此目的而采取的技術(shù)就是無(wú)菌技術(shù)或無(wú)菌操作，在進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)檢查過(guò)程中，無(wú)論是標(biāo)本采集或培養(yǎng)操作，均需嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作技術(shù)。2.2所用器具、培養(yǎng)基等必須嚴(yán)格滅菌，使用過(guò)程中不得與未經(jīng)消毒物品接觸，忌長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣手中，有蓋的應(yīng)迅速蓋上。2.3滅菌的試管、玻璃等在打開(kāi)蓋后及關(guān)閉前，口部應(yīng)在火焰上通過(guò)1-2次，以殺滅可能從空氣中落入的雜菌；接種環(huán)或接種針每次使用前后，均應(yīng)在火焰上燒灼滅菌，金屬棒或玻璃棒部分亦須轉(zhuǎn)動(dòng)通過(guò)火焰3次。當(dāng)前第20頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)2.4進(jìn)行細(xì)菌檢驗(yàn)的全過(guò)程應(yīng)在無(wú)菌室、接種罩或生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。2.5檢驗(yàn)時(shí)忌用手接觸標(biāo)本及已滅菌的器材內(nèi)部，也勿用口吹以防其他雜菌混入培養(yǎng)物中。2.6打開(kāi)瓶塞及試管塞時(shí)，應(yīng)將塞子上端夾持于手指間適當(dāng)位置，不得將棉塞任意放置別處。當(dāng)前第21頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)3、接種、分離及結(jié)果觀察接種細(xì)菌應(yīng)用接種環(huán)（針）來(lái)蘸取細(xì)菌標(biāo)本，進(jìn)行接種，其程序可分為：滅菌接種環(huán)冷卻蘸取細(xì)菌標(biāo)本進(jìn)行接種接種環(huán)滅菌5個(gè)程序。當(dāng)前第22頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)細(xì)菌的接種與分離技術(shù)

平板分區(qū)劃線法每劃完一區(qū)，要將接種環(huán)滅菌

2斜面接種法--常用于雙糖管接種3液體接種法--糖類(lèi)微量生化管4穿刺法-----常用于半固體接種5傾注平板法--自來(lái)水細(xì)菌計(jì)數(shù)6涂布接種法--紙片法藥敏試驗(yàn)當(dāng)前第23頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)當(dāng)前第24頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)當(dāng)前第25頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)當(dāng)前第26頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)六、生化反應(yīng)1、各種細(xì)菌具有各自獨(dú)特的酶系統(tǒng)，因而在代謝過(guò)程中所產(chǎn)生的分解和合成的代謝產(chǎn)物也不同，這些分解或合成代謝產(chǎn)物又各有不同的生化特點(diǎn)，利用此生化特點(diǎn)來(lái)檢查代謝產(chǎn)物以鑒別細(xì)菌的方法，稱(chēng)為生化反應(yīng)。2、生化反應(yīng)主要分為糖類(lèi)的代謝試驗(yàn)、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)、有機(jī)酸鹽和銨鹽的利用試驗(yàn)、呼吸酶類(lèi)試驗(yàn)及其他酶類(lèi)試驗(yàn)。當(dāng)前第27頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)2.1碳水化合物的代謝試驗(yàn)

糖、醇、苷發(fā)酵試驗(yàn)

糖細(xì)菌→生長(zhǎng)分解糖產(chǎn)酸PH↓當(dāng)前第28頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)不同微生物分解利用糖類(lèi)的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣。可用指示劑及發(fā)酵管檢驗(yàn)。當(dāng)前第29頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)淀粉水解試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。當(dāng)前第30頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)O/F（葡萄糖）試驗(yàn)細(xì)菌分解葡萄糖時(shí)利用分子氧—氧化型(O)無(wú)氧降解—發(fā)酵型(F)不分解葡萄糖—產(chǎn)堿型(-)一管加石臘油FO堿當(dāng)前第31頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)ONPG試驗(yàn)

鄰-硝基酚＋β-半乳糖（黃色）β-半乳糖苷酶

細(xì)菌＋鄰-硝基-半乳糖

陽(yáng)性-黃色陰性對(duì)照-無(wú)色當(dāng)前第32頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)本試驗(yàn)可同時(shí)觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來(lái)又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類(lèi)不被氧化，所以仍保持黃色。1.下黃上不黃為分解葡萄糖，不分解乳糖2.上下均黃為分解葡萄糖、乳糖3.上下均不黃為非發(fā)酵菌4.中間變?yōu)楹谏珵楫a(chǎn)H2S當(dāng)前第33頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)沙門(mén)氏菌的TSI試驗(yàn)當(dāng)前第34頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)VP、MR試驗(yàn)

葡萄糖丙酮酸乙酰甲醇→二乙酰＋胍基→紅色VP陽(yáng)性

肺炎克雷伯菌甲酸、乙酸PH↓＋甲基紅試劑→紅色MR陽(yáng)性

大腸埃希菌VPMR陽(yáng)陰陽(yáng)對(duì)當(dāng)前第35頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)V-P試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱(chēng)V－P（+）反應(yīng)。當(dāng)前第36頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)甲基紅（MethylRed）試驗(yàn)?zāi)c桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。當(dāng)前第37頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)2.2蛋白質(zhì)和氨基酸代謝試驗(yàn)

★吲哚試驗(yàn)

細(xì)菌＋（色氨酸酶）蛋白胨水吲哚＋柯氏試劑→紅色當(dāng)前第38頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)靛基質(zhì)（Imdole）試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來(lái)。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。當(dāng)前第39頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)★尿素試驗(yàn)

＋細(xì)菌→NH3、PH↑→紅色尿素陽(yáng)性尿素當(dāng)前第40頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)尿素酶（Urease）試驗(yàn)有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。1、未接種2、尿素酶陽(yáng)性3、尿素酶陰性當(dāng)前第41頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)★苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)

苯丙氨酸＋細(xì)菌→苯丙酮酸＋FeCI3→綠色

當(dāng)前第42頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)★氨基酸脫羧酶試驗(yàn)

石蠟油葡萄糖溴甲酚紫精aa葡萄糖溴甲酚紫賴(lài)aa葡萄糖溴甲酚紫烏aa葡萄糖溴甲酚紫對(duì)照管當(dāng)前第43頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)2.3碳源和氮源利用試驗(yàn)

★枸櫞酸鹽試驗(yàn)

細(xì)菌＋檸檬酸三鈉→Na2CO3PH↑→深藍(lán)色

當(dāng)前第44頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)枸椽酸鹽試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能利用枸椽酸鹽作為碳源，及磷酸銨作為氮源，將枸椽酸鹽分解為二氧化碳，培養(yǎng)基反應(yīng)后成堿性，由于指示劑的作用，培養(yǎng)基變?yōu)樘m色。當(dāng)前第45頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)★硝酸鹽還原試驗(yàn)

細(xì)菌＋NO3－----------NO2

NO2＋對(duì)氨基苯磺酸（甲液）→對(duì)重氮基苯磺酸

對(duì)重氮基苯磺酸＋α-萘胺（乙液）→紅色（＋）

NO3－＋細(xì)菌＋甲、乙液→無(wú)色（-）＋鋅粉（還原劑）紅色為陰性無(wú)色為陽(yáng)性NO3－＋細(xì)菌→NO2→N2↑＋NH3↑當(dāng)前第46頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)2.4酶類(lèi)試驗(yàn)細(xì)菌＋血漿結(jié)合凝固酶

纖維蛋白→肉眼可見(jiàn)凝集細(xì)菌＋血漿游離凝固酶＋纖維蛋白→血漿凝固

★CAMP試驗(yàn)

B群鏈球菌產(chǎn)生CAMP因子，促進(jìn)金葡溶血更好

★凝固酶試驗(yàn)當(dāng)前第47頁(yè)\共有51頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)七、血清學(xué)試驗(yàn)1、基本概念1.1血清學(xué)試驗(yàn)是利用抗原抗體在適宜條件下的體外特異反應(yīng)，可作為抗原抗體的檢測(cè)。1.2抗原：是一種刺激機(jī)體引起免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體和（或）致敏淋巴細(xì)胞，并能在體外與其相應(yīng)的抗體（或）致敏淋巴細(xì)胞發(fā)