第四章反向遺傳學及其相關技術

第四章反向遺傳學及其相關技術當前第1頁\共有74頁\編于星期六\8點一、概述（一）遺傳研究的二條途徑1、表→里：正向遺傳學研究雜交或誘變→表型觀察→遺傳規(guī)律→確定存在的基因及數(shù)目→基因的功能及作用性質(zhì)。這一途徑是從生物體的性狀、表型變化來研究遺傳物質(zhì)的組成、分布與傳遞規(guī)律，屬于正向遺傳學采用的研究方法。當前第2頁\共有74頁\編于星期六\8點2、里→表：反向遺傳學研究在已知DNA序列的基礎上，通過DNA重組、定點突變、插入/缺失等遺傳修飾手段創(chuàng)造突變體并研究突變所造成的表型效應，從而研究基因的生物學功能，闡明生命的本質(zhì)現(xiàn)象與規(guī)律。與反向遺傳學相關的遺傳操作技術為反向遺傳學技術。當前第3頁\共有74頁\編于星期六\8點（二）RNA病毒的反向遺傳學采用病毒的遺傳材料，在培養(yǎng)細胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或類似病毒物質(zhì)。

能夠拯救病毒的遺傳材料稱為感染性克隆，一般是在細菌質(zhì)粒中含有整個病毒基因組的cDNA拷貝，使得cDNA本身或從cDNA體外轉(zhuǎn)錄所得的RNA具有感染性。RNA病毒的反向遺傳系統(tǒng)通過定向修飾病毒的基因組序列，檢測被拯救的人工改造病毒的表型，可以在體內(nèi)(invivo)有效地研究病毒基因結(jié)構、功能和病毒-宿主相互作用。

當前第4頁\共有74頁\編于星期六\8點RNA病毒的反向遺傳操作RT-PCR構建RNA病毒的全長cDNA，并進行遺傳修飾↓與RNA聚合酶啟動子結(jié)合體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA↓轉(zhuǎn)錄物RNA感染哺乳動物細胞↓拯救到活病毒↓拯救病毒的表型變化

↓病毒基因組的表達、調(diào)控、致病機理、病毒與宿主細胞互作、疫苗制造等當前第5頁\共有74頁\編于星期六\8點單正股RNA病毒：RNA聚合酶+mRNA–

++–+中間型

結(jié)構蛋白+子代正股RNA單負股RNA病毒：RNA聚合酶–

+結(jié)構蛋白–子代負股RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒：＋＋RNARNA/DNA中間體逆轉(zhuǎn)錄酶DNA/DNA宿主＋＋子代RNA正股RNA與負股RNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒?當前第6頁\共有74頁\編于星期六\8點（三）真核生物的反向遺傳學采用反向遺傳學鑒定基因功能是真核生物功能基因組學的主要內(nèi)容。研究手段包括基因的互補實驗、超表達、反義抑制、基因敲除/基因打靶、基因陷阱、基因激活等手段。利用基因敲除或基因沉默而產(chǎn)生的功能變化研究基因功能是主要的反向遺傳學技術。當前第7頁\共有74頁\編于星期六\8點二、反向遺傳學相關技術1、基因的同源重組2、基因的位點突變3、基因沉默基因敲除當前第8頁\共有74頁\編于星期六\8點利用DNA轉(zhuǎn)化技術，將含有目的基因和靶基因同源片段的重組載體導入靶細胞，通過載體與靶細胞染色體上同源序列間的重組，將外源基因整合入內(nèi)源基因組內(nèi)，使外源基因得以表達。通過研究靶細胞或者個體在目的基因插入前后遺傳特性的改變，達到研究基因功能的目的。1、基因的同源重組當前第9頁\共有74頁\編于星期六\8點完全敲除：通過同源重組直接將靶基因在細胞或者動物個體中的活性完全消除。條件敲除：將某個基因的修飾限制于特定類型的細胞或個體發(fā)育特定的階段。完全敲除→條件敲除→特定組織/時間基因敲除基因敲除當前第10頁\共有74頁\編于星期六\8點1）通過同源重組的基因敲除步驟構建重組載體↓重組DNA轉(zhuǎn)入受體細胞核內(nèi)↓篩選目的細胞↓轉(zhuǎn)基因生物重組載體的類型：a)替換性載體系統(tǒng)：包括同源序列片段、替換基因的啟動子、報道基因等成分。b)插入性載體系統(tǒng)：插入基因片段(目的基因)、同源序列片段、標志基因片段。當前第11頁\共有74頁\編于星期六\8點用替換型（a）或插入型（b）載體進行完全基因敲除實驗當前第12頁\共有74頁\編于星期六\8點2）Res同源重組系統(tǒng)——源于λ噬菌體Res重組酶的重組系統(tǒng)Ha和Hb:同源重組區(qū)域Pa和Pb:引物位點sm:篩選標記

Red同源重組技術用于基因打靶當前第13頁\共有74頁\編于星期六\8點3）Cre-LoxP同源重組系統(tǒng)——源自P1噬菌體的重組系統(tǒng)屬于傳統(tǒng)的同源重組載體，但具有時空調(diào)控的功能。該系統(tǒng)由P1噬菌體的Cre重組酶和LoxP位點兩部分組成。Cre重組酶：由Cre基因編碼，識別LoxP位點，介導兩個LoxP位點（序列）之間的特異性重組，使LoxP位點間的基因序列被刪除或重組。LoxP位點：由2個13bp的反向重復序列和1個8bp的間隔區(qū)域構成。當前第14頁\共有74頁\編于星期六\8點Cre酶Cre酶

Cre酶Cre重組酶13bp的反向重復序列

當前第15頁\共有74頁\編于星期六\8點Cre-LoxP重組系統(tǒng)的特點CreCreCre重組酶所催化的是一個可逆的重組事件Cre催化重組不需要任何輔助因子的參與介導兩個同向LoxP位點之間序列的插入/缺失（下左）介導兩個反向LoxP位點之間序列顛倒（下右）介導兩條含LoxP位點DNA鏈的交換或染色體易位。

當前第16頁\共有74頁\編于星期六\8點Cre-Loxpgeneknock-outsystem當前第17頁\共有74頁\編于星期六\8點4)高等動物基因敲除技術真核生物基因敲除的技術路線主要包括構建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA導入胚胎干細胞純系中，使外源DNA與胚胎干細胞基因組中相應部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達。顯微注射命中率較高，技術難度相對大些。電穿孔法命中率比顯微注射低，操作使用方便。胚胎干細胞（ES細胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動物基因敲除的技術基礎。當前第18頁\共有74頁\編于星期六\8點模式動物小鼠中完全基因敲除的步聚近交系，白色，易產(chǎn)生免疫缺陷

當前第19頁\共有74頁\編于星期六\8點2、基因的位點突變1）點突變—TILLING技術TILLING(targetinginducedlocallesionsingenomes)—定向誘導基因組局部突變，是一種快速有效地從由化學誘變劑(EMS)誘變過的突變?nèi)后w中鑒定出點突變的方法。

先用化學誘變劑(甲基磺酸乙酯，EMS)誘發(fā)產(chǎn)生一系列的點突變，再用設計的特異性引物進行PCR擴增，然后將PCR擴增產(chǎn)物變性和退火形成異源雙鏈核酸分子，再用特異切割錯配的內(nèi)切酶CELl酶切，最后變性處理后采用雙色聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳檢測分析。當前第20頁\共有74頁\編于星期六\8點（建池）當前第21頁\共有74頁\編于星期六\8點當前第22頁\共有74頁\編于星期六\8點TILLING特點：TILLING技術屬于高頻率點突變和PCR篩選相結(jié)合的技術，可發(fā)現(xiàn)基因的錯義突變、基因截短型損傷等突變類型?？色@得大量的等位基因系列，對長度很小基因，復等位基因等具有獨特的技術優(yōu)勢。可誘導產(chǎn)生高頻率的點突變，篩選目的基因需要較小的突變?nèi)后w。不依賴于農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化或內(nèi)源標簽系統(tǒng)，無需耗時的轉(zhuǎn)基因和復雜的組織培養(yǎng)。需要知道所研究基因的序列。當前第23頁\共有74頁\編于星期六\8點2）隨機插入突變T-DNA插入突變

以農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化為基礎的一種插入突變研究方法，根據(jù)插入位點的基因序列與植物表型變異等的相互關系可以從基因組中分離出相應的基因并鑒定其功能。構建T-DNA載體→轉(zhuǎn)化→突變體的篩選及遺傳分析→分離T-DNA插入位點的側(cè)翼序列→基因的定位、結(jié)構與功能分析。當前第24頁\共有74頁\編于星期六\8點T-DNA法敲除植物基因及突變體篩選：a.引物設計。LP和RP分別代表插入基因兩端的引物，LB是指載體上的一段引物。旁鄰序列是經(jīng)測序后獲得的DNA序列。b.PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。分別代表野生型、雜合子和純合子PCR條帶。當前第25頁\共有74頁\編于星期六\8點T-DNA插入特點：不能控制其在生物體基因組中的插入位點。在植物中用T-DNA插入來敲除一個特定基因仍需要運氣。隱性突變與顯性突變：隱性——表型的變化只能在轉(zhuǎn)化體的部分后代中體現(xiàn)出來（基因敲除）；顯性——可以在轉(zhuǎn)化體中直接觀察到（基因激活）。某些特定基因，由于其特性在基因敲除后并不體現(xiàn)出功能的喪失。原因：重要的功能基因突變致死和冗余基因。染色體重排：突變體表型與T-DNA插入無關。效率不高，工作量大。建立飽和的突變體庫。當前第26頁\共有74頁\編于星期六\8點轉(zhuǎn)座子插入突變利用某些能隨機插入基因序列的轉(zhuǎn)座子，在目標細胞基因組中進行隨機插入突變，建立一個攜帶隨機插入突變的細胞庫，然后通過相應的標記進行篩選獲得相應的基因敲除細胞。由轉(zhuǎn)座子引起的突變可以轉(zhuǎn)座子DNA為探針，從突變體的基因組DNA文庫中篩選到突變的基因，再利用這部分序列從野生型基因文庫中獲得完整的基因。也可以利用PCR的方法擴增轉(zhuǎn)座子的側(cè)翼序列，進而得到完整的基因信息。當前第27頁\共有74頁\編于星期六\8點轉(zhuǎn)座子插入特點：插入的是完整的元件，便于分析?？蓮牟迦胛稽c切除，產(chǎn)生回復突變，因此不僅可以據(jù)此確認真正由轉(zhuǎn)座子引起的突變，還可以進一步驗證突變基因的功能。轉(zhuǎn)座子傾向于插入轉(zhuǎn)座子的臨近區(qū)域，可以用來研究基因組某一局部區(qū)域的結(jié)構。通過不斷跳動產(chǎn)生新的突變，相對較少的起始轉(zhuǎn)化系就可以獲得整個基因組的飽和突變，大大減少了工作量?？梢詰糜谵D(zhuǎn)化效率不高的植物。當前第28頁\共有74頁\編于星期六\8點轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)Ac/Ds系統(tǒng)由自主性元件（Ac）和非自主性元件（Ds）構成。Ds元件能夠在Ac編碼的轉(zhuǎn)座酶的作用下移動，去除Ac元件可使其自身不能轉(zhuǎn)座。通過遺傳雜交引入自主性元件，轉(zhuǎn)座子插入序列可以重新移動。因此，Ac/Ds轉(zhuǎn)座子插入系統(tǒng)只需要少量的轉(zhuǎn)基因品系（啟動品系）作為轉(zhuǎn)座源即可。當前第29頁\共有74頁\編于星期六\8點在真核系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)座插入事件常不能產(chǎn)生可見的表型，這是因為功能基因的冗余或在早期產(chǎn)生致死效應。采用經(jīng)修飾的轉(zhuǎn)座子可克服這些困難。修飾：轉(zhuǎn)座因子后帶一個報告基因，報告基因的表達只有在轉(zhuǎn)座事件發(fā)生的情況下才能獲得，這樣就可以通過報告基因來檢測轉(zhuǎn)座子的表達情況。修飾的Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)當前第30頁\共有74頁\編于星期六\8點增強子陷阱(enhancertrap)：轉(zhuǎn)座子含有一個具弱小啟動子驅(qū)動的報告基因。報告基因的表達只有在轉(zhuǎn)座發(fā)生在內(nèi)源增強子附近時才能獲得。啟動子陷阱(promotertrap)：轉(zhuǎn)座子帶有一個無啟動子的報告基因，這個基因只有在轉(zhuǎn)座子插入一個植物活躍的內(nèi)源啟動子下游時才能表達。修飾的方法-增強子陷阱與啟動子陷阱當前第31頁\共有74頁\編于星期六\8點Mu轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)座子打靶載體是以兩種噬菌體Mu為基礎的mini-Mu轉(zhuǎn)座子，每個轉(zhuǎn)座子上都攜帶標記基因?？梢栽跀M刪除基因兩側(cè)各插入一個mini-Mu轉(zhuǎn)座子，然后在兩個插入位點之間制造缺失。這種缺失可以使兩個轉(zhuǎn)座子加上靶區(qū)之間的部分基因轉(zhuǎn)移。特點：不需要知道基因組序列，僅已知外顯子即可載體構建迅速，技術簡單載體可以攜帶多種不同抗性基因，可以同時處理多基因。當前第32頁\共有74頁\編于星期六\8點三、基因沉默技術反義RNARNA干擾（RNAi）當前第33頁\共有74頁\編于星期六\8點反義RNA技術反義RNA技術是根據(jù)RNA序列人工合成的互補RNA。根據(jù)反義RNA的作用機制可將其分為三類：1、反義RNA是直接作用于靶mRNA的核蛋白體結(jié)合位點或與靶mRNA直接結(jié)合形成雙鏈RNA，從而直接抑制mRNA的翻譯或被RNA酶Ⅲ識別降解。2、反義RNA是與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，引起mRNA構象的變化，從而抑制其翻譯。3、反義RNA是作用于基因的啟動子，直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。當前第34頁\共有74頁\編于星期六\8點（一）概念RNA干擾(RNAinterference，RNAi)：與靶基因序列同源的雙鏈RNA所誘導的一種序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。RNA干擾當前第35頁\共有74頁\編于星期六\8點基因沉默轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(TranscriptionalGeneSilencing,TGS)轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS)基因沉默當前第36頁\共有74頁\編于星期六\8點轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（TGS）是指基因在細胞核內(nèi)RNA合成受到了阻止而導致基因沉默。轉(zhuǎn)錄水平基因沉默可以通過有性世代傳遞，表現(xiàn)為減數(shù)分裂的可遺傳性。引起轉(zhuǎn)錄水平基因沉默的機制主要有以下幾種：基因及其啟動子甲基化：通常發(fā)生在DNA的CG序列的堿基上，該區(qū)域堿基甲基化往往導致轉(zhuǎn)錄受抑制。

同源基因間的反式失活：擁有同源序列的沉默位點和其他位點的DNA的相互作用而引起的基因沉默。甲基化并失活的基因能作為一種“沉默子”，對其他具有同源性的靶基因施加一種反式作用，使具有同源序列的靶基因發(fā)生甲基化并導致失活。反式失活的靶基因既可以與沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。

當前第37頁\共有74頁\編于星期六\8點后成修飾作用導致的基因沉默：指轉(zhuǎn)基因的序列和堿基組成不發(fā)生改變，但是其功能卻在個體發(fā)育的某一階段受到細胞內(nèi)因子的修飾作用后而關閉。這種修飾作用所造成的轉(zhuǎn)基因沉默是可以隨著修飾作用的解除而被消除。后成修飾作用導致的轉(zhuǎn)基因沉默與受體植物的核型構成有關。重復序列：外源基因如果以多拷貝形式整合到同一位點上，形成首尾相連的正向重復或頭對頭、尾對尾的反向重復，則不能表達，而且拷貝數(shù)越多，基因沉默現(xiàn)象越嚴重。這種重復序列誘導的基因沉默可能是重復序列間自發(fā)配對，甲基化酶特異性識別這種配對結(jié)構而使其甲基化，從而抑制其表達。當前第38頁\共有74頁\編于星期六\8點轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默（PTGS）則是指基因能夠在細胞核里被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄，但在細胞質(zhì)里卻無相應的mRNA存在的現(xiàn)象。引起轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制主要有以下幾種：共抑制：由Napoli在轉(zhuǎn)CHS基因的矮牽?；ㄖ邪l(fā)現(xiàn)，普遍存在于轉(zhuǎn)基因植物中。其發(fā)生是由于外源基因編碼區(qū)與受體細胞基因間存在同源性而導致外源基因與內(nèi)源基因的表達同時受到抑制。

具有同源性的外基因和內(nèi)源基因在細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄速率很高，但在細胞質(zhì)內(nèi)無mRNA積累，是典型的轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默。共抑制的產(chǎn)生不僅同內(nèi)、外源基因間編碼區(qū)的同源性有關，還與控制外源基因的啟動子的強度等因素有關。當前第39頁\共有74頁\編于星期六\8點基因壓制：Cogoni等首先在粗糙脈孢霉的轉(zhuǎn)化實驗中發(fā)現(xiàn)，外源基因可以抑制自身和相應內(nèi)源基因的表達，他們把這一現(xiàn)象定為基因壓制?；驂褐剖强赡娴?，而且這種逆轉(zhuǎn)會伴隨有外源拷貝的丟失?；驂褐瓢l(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，導致已復制的穩(wěn)定態(tài)mRNA大量減少。

RNA干擾：指將與靶基因的mRNA同源互補的雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞后并被切割成21～23個核苷酸長度的短核苷酸雙鏈，在其它作用因子的參與下能夠特異地與其同源的mRNA結(jié)合并導致其降解，從而產(chǎn)生相應的功能表型缺失。當前第40頁\共有74頁\編于星期六\8點RNAi——一種新的遺傳工具RNAi是植物、果蠅、線蟲和包括哺乳動物在內(nèi)的許多生物抵抗病毒感染和限制轉(zhuǎn)座子運動的一種自然存在的防御機制。RNAi可以作為一種簡單、有效的代替基因敲除的遺傳工具，來制備特定基因缺失表型的個體，從而研究該基因的功能.這項技術在疾病的基因治療上也有光明的應用前景。特別可以用于阻斷某些突變基因的表達，或者由蛋白過量表達引起的疾病。

當前第41頁\共有74頁\編于星期六\8點(二)、RNA干擾的發(fā)現(xiàn)

1994年Cogoni等證明真菌中亦有類似現(xiàn)象，此稱為基因壓制(quelling)。共抑制現(xiàn)象(cosuppression)

上世紀90年代初，美國和荷蘭的兩個轉(zhuǎn)基因植物實驗組在對矮牽牛(petunias)的研究中發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)基因的植株不僅沒有新基因表達，反而使原有的色素基因也受到了抑制。當前第42頁\共有74頁\編于星期六\8點1995年，康乃爾大學的SuGuo博士在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲(C.elegans)的par-1基因?qū)嶒炛邪l(fā)現(xiàn)：反義RNA與正義RNA（對照）都能切斷par-1基因的表達。該研究小組一直未能給這個意外以合理解釋。

GuoS,KemphuesKJ,ParL.Cell,1995,81:611-620.秀麗新小桿線蟲轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灧戳xRNA與正義RNA？反義RNA-與靶核酸(如mRNA或有義DNA)鏈互補的RNA分子，可抑制靶核酸的功能。正義RNA-與mRNA對應的RNA分子。當前第43頁\共有74頁\編于星期六\8點RNA干擾的發(fā)現(xiàn)

1998年，F(xiàn)ire和Mello（美）首次在秀麗新小桿線蟲中證明上述現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。他們發(fā)現(xiàn)SuGuo博士遇到的正義RNA抑制基因表達的現(xiàn)象，以及過去的反義RNA技術對基因表達的阻斷，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起：將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲，基因抑制效應變得十分微弱，而經(jīng)過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應基因的表達，其抑制基因表達的效率比純化后的反義RNA至少高2個數(shù)量級。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾。

FireA,XuS,MontgomeryME,etal.Nature.1998,391:806-811.當前第44頁\共有74頁\編于星期六\8點Negativecontrolshowinglackofstainingintheabsenceofthehybridizationprobe.（對照，缺mex-3

，不著色）(B)Embryofromuninjectedparentshowingnormalpatternofendogenousmex-3RNA(purplestaining).（正常野生型，紫）(C)Embryofromparentinjectedwithpurifiedmex-3antisenseRNA.Theseembryos(andtheparentanimals)retainmex-3mRNA,althoughlevelsmaybesomewhatlessthanwildtype.（野生型+反義RNA，淺紫）(D)Late4-cellstageembryofromaparentinjectedwithdsRNAcorrespondingtomex-3;nomex-3RNAisdetected.(TemplatesusedforinterferingRNAandinsituprobeswerelargelynon-overlapping.)

（野生型+雙鏈RNA，不著色）Effectsofmex-3RNAinterferenceonlevelsoftheendogenousmRNA.NomarskiDICmicrographsshowinsituhybridization（原位雜交）of4-cellstageembryos.當前第45頁\共有74頁\編于星期六\8點“沉默”是金Fire與Mello獲2006年諾貝爾獎當前第46頁\共有74頁\編于星期六\8點在1999年一年內(nèi),發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象廣泛存在于植物、真菌、線蟲、昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠、猴一直到人類的幾乎所有的真核生物細胞中。2000年，又先后發(fā)現(xiàn)小鼠早期胚胎中和大腸桿菌中也存在RNA干擾現(xiàn)象。2000年提出RNAi作用機制模型。HannondSMetal.Nature,2000,404(6775):293-296ZamorePD.Cell,2000,101(1):25-332001年，RNAi技術成功誘導培養(yǎng)的哺乳動物細胞基因沉默現(xiàn)象。Nature，2001，411（6836）：494－498RNAi技術被《Science》評為2001年度的十大科技進展之一。當前第47頁\共有74頁\編于星期六\8點2002年5月，Lindenbach(美),雙鏈RNA→艾滋病病毒細胞→減少艾滋病病毒基因表達90%以上。2002年7月,Novina等用RNAi技術實現(xiàn)了HIV1病毒的阻抑。2002年7月,McCaffrey(美)等人,雙鏈RNA+肝炎Ｃ病毒-標志基因→鼠肝臟→抑制標志基因的表達/肝炎Ｃ病毒基因的表達。利用RNAi可以直接和有效地起到抗病毒的作用。當前第48頁\共有74頁\編于星期六\8點共抑制、基因壓制和RNAi→dsRNA→降解靶mRNA→抑制靶基因的表達。均屬于PTGS！dsRNA導入線蟲→RNAi；dsRNA注射線蟲體腔→RNAi；dsRNA浸潤線蟲/dsRNA的工程菌喂養(yǎng)線蟲→RNAi。dsRNA導入植物→RNAi；同樣，dsRNA注射植物韌皮部→RNAi；吸附500bp基因片段的金屬片插入植物→侵入點組織發(fā)生RNAi。RNAi普遍存在于各種生物中,具有抗病毒、穩(wěn)定轉(zhuǎn)座子及監(jiān)控異常表達mRNA的生物學功能。當前第49頁\共有74頁\編于星期六\8點（三）、RNA干擾的機制

dsRNA：雙鏈RNA，包含正義鏈和反義鏈。Dicer：屬于RNaseⅢ家族的一員，是dsRNA的特異性核酸內(nèi)切酶，能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉(zhuǎn)基因、病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA。siRNA(smallinterferingRNA)：小干擾RNA，是長度為21-23個nt大小的雙鏈RNA，為RNAi的關鍵效應分子。名詞解釋：當前第50頁\共有74頁\編于星期六\8點

DicercontainstwoRNAseIIIdomainssiRNAslongdsRNA當前第51頁\共有74頁\編于星期六\8點siRNA當前第52頁\共有74頁\編于星期六\8點RISC(RNA-inducingsilencingcomplex)：RNA誘導沉默復合物，是一種核蛋白復合物，具有核酸內(nèi)切、外切以及解旋酶活性。RdRP（RNA-dependentRNApolymerases）：依賴RNA的RNA聚合酶，是RNAi的調(diào)節(jié)因子，使RNAi可以在生物體內(nèi)傳遞。當前第53頁\共有74頁\編于星期六\8點RISC:RNA-InducedSilencingComplexExonucleaseHomologysearchactivityEndonucleaseHelicase5’3’TargetmRNAOH3’5’P核酸外切酶

解旋酶

核酸內(nèi)切酶

當前第54頁\共有74頁\編于星期六\8點dsRNA介導的同源性靶mRNA降解過程主要分為兩步：第一步（起始階段）較長dsRNA在ATP參與下，被RNaseⅢ的特異核酸酶切割加工成21~23nt的，由正義和反義鏈組成的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。siRNA的兩條單鏈末端為5’-磷酸和3’-羥基，且3’端均有2個突出的核苷酸。Dicer有解旋酶活性并含有dsDNA結(jié)合域和PAZ結(jié)構域。Dicer的類似物相繼在擬南芥、秀麗線蟲及哺乳動物等機體中被發(fā)現(xiàn)。步驟當前第55頁\共有74頁\編于星期六\8點第二步（效應階段）siRNA在ATP參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈，并由其中反義鏈指導形成RNA誘導的沉默復合體(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)?；罨腞ISC在單鏈siRNA引導下識別互補的mRNA，并在RISC中的核酸內(nèi)切酶作用下從siRNA引導鏈中心所對應的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶進一步降解，從而干擾基因表達。當前第56頁\共有74頁\編于星期六\8點RNAi的放大效應機制siRNA不僅可引導RISC切割靶RNA，而且可作為引物在RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA為模板合成新的dsRNA。新合成的長鏈dsRNA同樣可被RNaseⅢ核酸酶切割、降解而生成大量的次級siRNA。次級siRNA又可進入合成-切割的循環(huán)過程，進一步放大RNAi作用。這種合成-切割的循環(huán)過程稱為隨機降解性PCR（randomdegradativePCR）。當前第57頁\共有74頁\編于星期六\8點GiselaStorz,Science,296(5571):1263-1265,2002.異常的單鏈RNA依賴RNA的RNA聚合酶特異性核酸內(nèi)切酶RNA誘導沉默復合物當前第58頁\共有74頁\編于星期六\8點①RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制；②RNAi具有很高的特異性：只有dsRNA才能誘導產(chǎn)生RNAi；只有針對編碼區(qū)的dsRNA才能產(chǎn)生有效的和特異性的干擾；注射同源dsRNA可以引起內(nèi)源性mRNA特異性的降解；dsRNA不得短于21個堿基，大于30bp的dsRNA不能在哺乳動物中誘導特異的RNA干擾，而是細胞非特異性和全面的基因表達受抑制凋亡；RNAi具有高效性：

RNAi抑制基因表達具有很高的效率，可達到缺失突變體表型的程度，而且相對很少量的dsRNA分子就能完全抑制相應基因的表達，這是通過催化放大的方式進行的；RNAi干擾的幾個重要生物學特征當前第59頁\共有74頁\編于星期六\8點RNAi具有很好的穩(wěn)定性：siRNA分子3′端有突出的非配對堿基的雙鏈分子，在細胞內(nèi)可穩(wěn)定存在3-4d，以3′端懸垂TT堿基的雙鏈RNA尤為穩(wěn)定，半衰期遠長于反義寡聚核苷酸。

RNAi的可傳播性和遺傳性：RNAi抑制基因表達的效應可以長距離傳遞和維持信號甚至傳播至整個有機體以及可遺傳給F1，但F2往往恢復為野生型。RNAi效應的依賴性：只有連續(xù)產(chǎn)生dsRNA才能產(chǎn)生長期效應，否則只產(chǎn)生短暫的沉默反應。RNAi作用迅速，mRNA快速降解；當前第60頁\共有74頁\編于星期六\8點miRNA及其作用機制miRNA(microRNA):

微小RNA，指長度約21～25nt的小分子單鏈RNA，位于基因組的非編碼區(qū)，進化上高度保守，可在翻譯水平上對基因表達進行調(diào)節(jié)的RNA家族。其介導的沉默機制也屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。miRNA基因的表達具有特定模式:階段特異性和組織特異性，在不同組織中表達有不同類型的miRNA，在生物發(fā)育的不同階段里有不同的miRNA表達。當前第61頁\共有74頁\編于星期六\8點miRNA的作用機制當前第62頁\共有74頁\編于星期六\8點相同點:長度都約22nt左右；同是Dicer產(chǎn)物，因此具有Dicer產(chǎn)物的特點；二者生成都需Argonaute家族蛋白的存在；同是RISC的組分。miRNA與siRNA比較當前第63頁\共有74頁\編于星期六\8點來源不同：siRNA來源于轉(zhuǎn)基因或病毒RNA，由長dsRNA轉(zhuǎn)變而來；miRNA來源于內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本，是細胞內(nèi)RNA的固有組分之一，由具有發(fā)夾狀結(jié)構的pre-miRNA轉(zhuǎn)變而來；結(jié)構不同：siRNA主要以雙鏈形式存在，其3’端存在2個非配對的堿基，通常為UU；miRNA主要以單鏈形式存在；對靶RNA的特異性不同：siRNA與靶mRNA完全互補配對結(jié)合；miRNA與靶RNA并不完全互補，存在錯配現(xiàn)象。靶序列有一個核苷酸突變，就會影響到siRNA的作用功能，但不會影響到miRNA的功能；作用形式不同：siRNA主要在轉(zhuǎn)錄后通過降解mRNA發(fā)揮作用，而miRNA只在蛋白質(zhì)翻譯水平上負調(diào)控靶基因的表達。不同點:當前第64頁\共有74頁\編于星期六\8點（四）、RNA干擾的研究方法一般技術路線當前第65頁\共有74頁\編于星期六\8點（五）、RNA干擾的應用

1.基因功能研究由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此可以作為功能基因組學的一種強有力的研究工具。已有研究表明RNAi能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達，制作多種表型，而且抑制基因表達的時間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應。與傳統(tǒng)的基因敲除技術相比，這一技術具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢，近來RNAi成功用于構建轉(zhuǎn)基因動物模型的報道日益增多，標志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。

當前第66頁\共有74頁\編于星期六\8點2.病毒性疾病的治療

使用RNAi技術來阻止艾滋病病毒進入人體細胞。某研究小組設計合成的lenti病毒載體引入siRNA，激發(fā)RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5（化介素受體，HIV-1的輔因子）進入人體外周Ｔ淋巴細胞，而不影響另一種HIV-1主要的coreceptor-CCR4，從而使以lenti病毒載體為媒介引導siRNA進入細胞內(nèi)產(chǎn)生了免疫應答，由此治療HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加?！滩‘斍暗?7頁\共有74頁\編于星期六\8點2.病毒性疾病的治療

Shlomai和Shaul設計了各針對HBV基因19nt的兩種pSUPER載體：pSUPERX-siRNA和pSUPERcore-siRNA。已轉(zhuǎn)染含1.3XwtHBV基因質(zhì)粒載體的Huh7細胞再被X-siRNA或core-siRNA轉(zhuǎn)染后，core蛋白水平分別降低了89%、63%，轉(zhuǎn)染X-siRNA的細胞中HBsAg降低60%，但轉(zhuǎn)染core-siRNA對HBsAg表達無明顯影響（X-siRNA干擾沉默了所有的病毒轉(zhuǎn)錄物，而core-siRNA僅沉默3.5kb、3.9kb的mRNA）?！狧BV（乙肝病毒）當前第68頁\共有74頁\編于星期六\8點2.病毒性疾病的治療

Randall等證明了針對HCVRNA的siRNA轉(zhuǎn)染細胞4天后可使細胞質(zhì)中復制的HCVRNA降低80倍；將siRNA轉(zhuǎn)染至已有HCV感染、復制的細胞，siRNA對98%以上可檢測到HCV抗原、HCV復制活躍的細胞有抑制作用；siRNA干擾沉默HCVRNA具有劑量依賴性和序列特異性。Kapadia等也證明了siRNA特異抑制HCVRNA