第九節(jié)工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)

第九節(jié)工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)演示文稿當前第1頁\共有47頁\編于星期五\22點優(yōu)選第九節(jié)工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)當前第2頁\共有47頁\編于星期五\22點一、微生物菌種保藏在一定時間內(nèi)使菌種不死、不變、不亂基本要求：基本方法：生活態(tài)休眠態(tài)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)寄主傳代培養(yǎng)冷凍干燥斜面、平板液氮、低溫冰箱沙土管、冷凍真空干燥當前第3頁\共有47頁\編于星期五\22點

由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對不同的保藏方法有不同的適應(yīng)性，因此，在具體選擇保藏方法時必須對被保藏菌株的特性、保藏物的使用特點及現(xiàn)有條件等進行綜合考慮。

對于一些比較重要的微生物菌株，則要盡可能多的采用各種不同的手段進行保藏，以免因某種方法的失敗而導(dǎo)致菌種的喪失。當前第4頁\共有47頁\編于星期五\22點國際重要菌種保藏機構(gòu)當前第5頁\共有47頁\編于星期五\22點中國菌種保藏單位當前第6頁\共有47頁\編于星期五\22點當前第7頁\共有47頁\編于星期五\22點二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)

(1)超低溫或在液氮中冷凍保藏；(2)冷凍干燥或真空干燥保藏；

(3)

轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?/p>

(4)土壤或陶瓷珠等載體于燥保藏。當前第8頁\共有47頁\編于星期五\22點菌種保藏方法

暫時保藏法

斜面?zhèn)鞔ù┐谭?/p>

長期保藏法

液體石蠟法甘油管法砂管保藏法砂土管保藏法濾紙片保藏法冷凍干燥保藏法液氮冷凍法

當前第9頁\共有47頁\編于星期五\22點2.1

冷凍保藏

冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡單而有效的方法。通過冷凍，使微生物代謝活動停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲得滿意的冷凍結(jié)果，通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護劑。冷凍保藏時溫度要求在-20℃以下，同時應(yīng)認真掌握好冷凍速度和解凍速變。冷凍深藏的缺點之一是培養(yǎng)物運輸較困難。當前第10頁\共有47頁\編于星期五\22點冷凍保藏種類

一、普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)三、液氮冷凍保藏技術(shù)

當前第11頁\共有47頁\編于星期五\22點普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細胞分接到試管或指管肉，然后貯藏于一冰箱的冷藏室中，或于溫度范圍在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中?；蛘撸瑢⒕N培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力1—2年。當前第12頁\共有47頁\編于星期五\22點應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。保藏過程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴格密封。這一方法雖簡便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。當前第13頁\共有47頁\編于星期五\22點二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在-60℃以下進行保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：

1．離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細胞；

2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細胞；

3．加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；

4．混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。當前第14頁\共有47頁\編于星期五\22點如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2℃／min。若干細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。當前第15頁\共有47頁\編于星期五\22點三、液氮冷凍保藏技術(shù)

(一)冷凍保護劑

在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用的甘油—般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。

當前第16頁\共有47頁\編于星期五\22點(二)液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟

1．待冷凍保藏菌種懸液的制備

(1)從生長斜面制備菌懸液：每一斜面加入5ml含10％甘油的營養(yǎng)液體培養(yǎng)；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細胞懸液；0.5～lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶。

當前第17頁\共有47頁\編于星期五\22點(2)從浸沒培養(yǎng)物制備菌懸液：在浸沒培養(yǎng)液中加入等體積20%無菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散；0.5-lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使細胞和懸浮培養(yǎng)基之間達到平衡。當前第18頁\共有47頁\編于星期五\22點2．控速冷凍．(1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中；(2)將此金屬容器置于控速冷凍機的冷凍室中；(3)以1-2℃/min的致冷速度降溫，直到溫度達到相對溫度之上幾度的細胞凍結(jié)點(通常為-30℃)；(4)補加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細胞在凍結(jié)點時盡可能快地發(fā)生相變；當前第19頁\共有47頁\編于星期五\22點(5)細胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1℃/min，直到溫度達-50℃；(6)將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或氣相(-156℃)中保存。如果無控速冷凍機，則一般可將安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。當前第20頁\共有47頁\編于星期五\22點(三)復(fù)蘇1．從液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2．迅速將安瓿置于37-40℃水浴中，并輕輕搖動以加速解；3．用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有2m1無菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取0.1-0.2ml(約4、8滴)轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。當前第21頁\共有47頁\編于星期五\22點2.2

凍干保藏

冷凍干燥的基本方法：是通過在減壓條件下使凍結(jié)的細胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一。冷凍干燥過程中必須使用冷凍保護劑，目前國內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國外尚有運用動物血清等的。大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無需進行冷凍保藏，便于運輸。當前第22頁\共有47頁\編于星期五\22點培養(yǎng)物的凍干過程當前第23頁\共有47頁\編于星期五\22點冷凍真空干燥操作流程安培瓶配制保護劑滅菌菌種培養(yǎng)制備菌懸液分裝安培瓶洗凈烘干裝標簽加棉塞預(yù)凍真空干燥測定水分熔封管口檢查真空度包藏當前第24頁\共有47頁\編于星期五\22點(三)凍干菌種的保藏與再生1．保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于5℃下保藏。較低的保藏溫度(-20～-70℃)對于培養(yǎng)物的長期穩(wěn)定更好。2．復(fù)蘇：(1)在超凈工作臺中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂輪在安瓿中銼一道溝。(2)用無菌紗布或無菌毛巾包好安瓿，然后用手掰開安瓿。當前第25頁\共有47頁\編于星期五\22點(3)在安瓿中加入0.5～1ml營養(yǎng)液體培養(yǎng)基，慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿，使凍干菌種復(fù)水。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基的無菌試管中，或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。(4)在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此直接振落入盛有l(wèi)～2ml液體培養(yǎng)基的試管中，輕輕振蕩5～l0min，然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基。當前第26頁\共有47頁\編于星期五\22點2.3傳代保藏將菌種定期在新鮮瓊脂培養(yǎng)基上傳代，然后在一定的生長溫度下生長和保存的傳代保藏方法?？捎糜趯嶒炇抑腥舾删N的保藏。此法最為簡單和經(jīng)濟，且不要求任何特殊的設(shè)備。但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變。當前第27頁\共有47頁\編于星期五\22點2.3傳代培養(yǎng)法實驗原理：保藏的菌種通過斜面、穿刺或皰肉培養(yǎng)基（用于厭氧細菌）培養(yǎng)好后，置4C?冰箱中存放，定期進行傳代培養(yǎng)、再存放。可用膠塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無菌液體石蠟來進一步延長保存期。操作方法

1、斜面保藏法將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上，待其充分生長后，用牛皮紙將棉塞部分包扎好（棉塞換成膠塞效果更好），置4C?冰箱中包藏。保藏時間依微生物的種類而定。霉菌、放線菌及芽孢菌保存2－4個月移種一次，酵母菌間隔兩個月，普通細菌一個月，假單胞菌兩周傳代一次。此法優(yōu)點是操作簡單、使用方便，缺點是保藏時間短、易被污染。當前第28頁\共有47頁\編于星期五\22點2、液體石蠟保藏法將無菌石蠟加在已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1CM為準，使菌種與空氣隔絕。將試管直立，置低溫或室溫下保存。此法實用且效果較好。霉菌、放線菌、芽孢菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏1－2年，普通細菌也可保藏1年左右。3、穿刺保藏法按穿刺接種方式培養(yǎng)菌種，菌種長好后用膠塞封嚴，置4℃冰箱存放。當前第29頁\共有47頁\編于星期五\22點礦物油中浸沒保藏將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下保藏，此方法簡便有效?？捎糜诮z狀真菌、酵母、細菌和放線菌的保藏。特別對難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌等的保藏更為有效。當前第30頁\共有47頁\編于星期五\22點浸沒保藏的操作要點是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長，然后注入經(jīng)170℃下滅菌1-2h的礦物油，礦物油的用量以高出培養(yǎng)物1cm為宜。以液體石蠟作為保藏方法時，應(yīng)對需保藏的菌株預(yù)先作試驗。因為某些菌株在液體石蠟下生長還十分明顯，有些菌株如某些假絲酵母還會同化液體石蠟，也有的對液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏。為了預(yù)防不測，一般保藏株2～3年也應(yīng)做一次存活試驗。當前第31頁\共有47頁\編于星期五\22點2.4載體法

實驗原理：使生長合適的微生物吸附在一定的載體上進行干燥。常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠和濾紙片等。當前第32頁\共有47頁\編于星期五\22點操作方法（砂土管保藏法）（1）河砂處理取河砂若干加入鹽酸10%，加熱煮沸30min除去有機機質(zhì)。倒去鹽酸溶液，用自來水沖洗至中性，最后一次用蒸鎦水沖洗，烘干后用40目篩子過篩，棄去粗顆粒，備用。（２）土壤處理取非耕作層不含腐殖質(zhì)的痩黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。烘干后碾碎，用100目篩子過篩，粗顆粒部分丟掉。

(3)砂土混合處理妥當?shù)暮由芭c土壤按3：1的比例摻合(或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均勻后，裝入10x100mm的小試管或安瓿管中，每管分裝1g左右，塞上棉塞，進行滅菌(通常采用間歇滅菌2--3次)，最后烘干。當前第33頁\共有47頁\編于星期五\22點2.4

基因工程菌的保藏由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒復(fù)制子。質(zhì)粒基因通常為宿主細胞生長非必需。一般情況下當細胞丟失這些質(zhì)粒時，生長速度會加快。當前第34頁\共有47頁\編于星期五\22點當培養(yǎng)基中加入抗生素時，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細胞群體的極有用的生長選擇壓。而且在運用基因工程菌進行發(fā)酵時，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)。我們建議基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。當前第35頁\共有47頁\編于星期五\22點不同菌種保藏方法比較當前第36頁\共有47頁\編于星期五\22點細菌的保藏當前第37頁\共有47頁\編于星期五\22點放線菌菌種的保藏保藏方法主要有：

沙土管法、冷凍干燥法、液氮冷凍法

放線菌菌種的長期保藏依保藏放線菌的分生孢子為主要方式。當前第38頁\共有47頁\編于星期五\22點2.5微生物活力和穩(wěn)定性測定

所有保藏菌種的方法都必須是長期可靠地保持菌種的優(yōu)良性狀不變。在保藏時定期檢測菌種活力，以確定保藏培養(yǎng)物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及確定在實際保藏過程中出現(xiàn)的細胞死亡程度和遺傳穩(wěn)定性。當前第39頁\共有47頁\編于星期五\22點對工業(yè)微生物生產(chǎn)菌種來說，建議保藏菌種的形態(tài)學(xué)和生化特征(如代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、酶活力、遺傳特征及生化指標)應(yīng)在保藏后加以檢測和確定。當前第40頁\共有47頁\編于星期五\22點加速保藏試驗可用于預(yù)測保藏過程中保藏培養(yǎng)物的穩(wěn)定性。在一給定溫度下通過對高溫下短期活力喪失程度檢測，可以用來預(yù)測嗜酸乳桿菌的穩(wěn)定性。成功的菌種長期保藏方法之有價值的指標包括在保藏6個月、1年或更長時間后存活百分率(或存活單位)。細胞群體的形態(tài)學(xué)特征或一些特別的生化特征應(yīng)在菌種保藏前后保持同一性，以及實驗室中、中試車間中和生產(chǎn)發(fā)酵中產(chǎn)品滴度的穩(wěn)定性，后者極為重要。當前第41頁\共有47頁\編于星期五\22點第十節(jié)菌種的衰退與復(fù)壯

在生物進化的歷史長河中，遺傳性的變異是絕對的，而它的穩(wěn)定性反而是相對的；退化性的變異是大量的，而進化性的變異卻是個別的。在自然情況下，個別的適應(yīng)性變異通過自然選擇就可保存和發(fā)展，最后成為進化的方向；在人為條件下，人們也可以通過人工選擇法去有意識地篩選出個別的正變體用于生產(chǎn)實踐中。相反，如不自覺、認真地去進行人工選擇，大量的自發(fā)突變菌株就會趁機泛濫，最后導(dǎo)致菌種的衰退（degeneration）。

當前第42頁\共有47頁\編于星期五\22點在長期接觸菌種的實際工作人員中，都有這樣的體會，即如果對菌種工作長期放任自流，不搞純化、復(fù)壯（rejuve-nation）和育種，則菌種就會對你進行“懲罰”，反映到生產(chǎn)上就會出現(xiàn)持續(xù)的低產(chǎn)、不穩(wěn)產(chǎn)。這說明菌種的生產(chǎn)性狀也是不進則退的。當前第43頁\共有47頁\編于星期五\22點菌種衰退的表現(xiàn)對產(chǎn)量性狀來說，菌種的負變就是衰退。其他原有的典型性狀變得不典型時，也是衰退。最易覺察到的是菌落和細胞形態(tài)的改變。生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少。代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生能力的