酶的純化方法

酶的純化方法第一頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二（三）根據(jù)溶解度建立的純化方法1.鹽析法;2.有機溶劑沉淀法;3.共沉淀法;4.選擇性沉淀法;5.等電點沉淀法第二頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二1鹽析法鹽析法是古老的、也是目前仍廣泛采用的方法。鹽析法的原理：球蛋白類在低的鹽濃度溶液中，它的溶解度隨鹽的離子強度升高而增大，表現(xiàn)“鹽溶”特性。但是當鹽濃度繼續(xù)升高，超過某一上限值時，其溶解度又會先后以不同速度下降，分別“鹽析”沉淀析出。鹽析純化法就是根據(jù)酶和雜蛋白在高的鹽濃度溶液中溶解度的差別而建立的一種純化方法。第三頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二鹽析應考慮下述因素：

(1)pH(2)鹽

(3)溫度

(4)蛋白質濃度

(5)其它第四頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二(1)pH

控制pH可以提高純化效果，一般pH可選擇的范圍不大，大多數(shù)情況下，鹽析的適宜pH接近于待純化酶的等電點。有些情況，酶和雜蛋白能形成某種結合，從而干擾鹽析分離，此時如控制pH＜5或＞6，使它們帶相同電荷以減少絡合物形成，這樣鹽析效果常會有所改善，但應注意酶在這種條件下的穩(wěn)定性與鹽的溶解度。第五頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

(2)鹽

在純化的最初階段，鹽的性質產(chǎn)生的影響不一定很明顯，僅是隨著酶溶液純度的提高，鹽的特征效應就可能突出出來。實踐表明，就陽離子來說，一價鹽通常比二價鹽有效；而陰離子則相反，二價鹽比一價鹽好。符合這種條件的鹽有硫酸銨、硫酸鈉等。硫酸銨最常用，它的最大優(yōu)點是溶解度大，溶解的溫度系數(shù)小(0℃，706克／升；25℃，767克／升)即使在低溫下的溶解度范圍內，幾乎所有蛋白質都能鹽析出來。第六頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二(3)溫度

從酶的穩(wěn)定性和溶解度看，鹽析溫度一般以控制℃在30左右為宜。第七頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二(4)蛋白質濃度這是一個很重要的因素，它一方面能影響鹽析效果的重現(xiàn)性，因為蛋白濃度不同，分級分離納范圍也往往會發(fā)生變動；另一方面，蛋白濃度在100μg/ml以下，鹽析一般很因難，有時甚至根本不能形成沉淀。在200μg—1mg／ml范圍內，沉淀雖能生成，但時間校長，而且回收率往往不高。為了獲得較好的鹽析效果，蛋白濃度應在1mg／ml以上。第八頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二(5)其它

鹽析沉淀通常至少要近一小時才能完成，沉淀可通過離心或壓濾和母液分離。鹽濃度低時，離心比較容易，而過濾較難；鹽濃度高時，需要高速離心，但過濾較易。第九頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

鹽析法的優(yōu)點：簡便、安全(大多數(shù)酶在高濃度鹽溶液中相當穩(wěn)定)、重現(xiàn)性好。缺點：分辨率低，純度提高不顯著，同時為了下一步純化有時還需脫鹽。

第十頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二2.有機溶劑沉淀法原理:不同的蛋白質需要加入不同量的有機溶劑才能使它們分別從溶液中沉淀析出。有機溶劑在這個過程的主要作用是降低溶液的介電常數(shù)，因為分子間的靜電引力和溶劑的介電常數(shù)成反比，加入有機溶劑，蛋白質分子問的引力增加，溶解度降低。有機溶劑的另一作用是部分地引起蛋白質脫水而沉淀。但是有機溶劑的濃度和蛋白質溶解度之間目前還沒有一個可用的關系式。第十一頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二有機溶劑沉淀法應考慮的因素是：

(1)溫度

(2)pH(3)離子強度

(4)有機溶劑

第十二頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二(1)溫度

這是非常重要的因素，因為大多數(shù)蛋白質遇到有機溶劑都很不穩(wěn)定，特別是溫度較高的情況(例如室溫)下，極易變性失效，故操作過程通常應控制在0℃以下。而且有機溶劑必須預先冷卻到-15—-20℃，然后在攪拌下緩慢地加入。沉淀析出后應盡快地在低溫下離心分離，獲得的沉淀也應立即用冷的緩沖液溶解，以降低有機溶劑濃度。個別情況下，酶對有機溶劑比較穩(wěn)定，此時操作可在較高溫度(例如室溫)下進行，這樣有利于除去較多的雜蛋白。第十三頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二(2)pH

蛋白質在等電點的溶解度最低，有機溶劑沉淀通常也多選在盡可能靠近待純化酶的等電點pH條件下進行。如肌肉酶的分離在pH6.5效果一般較好，pH調整可用0.05M的緩沖液。第十四頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二(3)離子強度

中性鹽大多能增大蛋白質的溶解度，并能減少變性影響。在進行有機溶劑分級沉淀時，如果添加適當濃度的中性鹽，如5—10％的硫酸銨，往往有助于提高分離效果。但鹽的濃度一般不宜超過0.05M，否則沉淀不好，甚至沉淀全無，同時有機溶劑耗費也大。第十五頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二(4)有機溶劑

丙酮的分離效果一般最好，引起失效的情況與程度也較少(小)。除了丙酮外，乙醇和甲醇等也常用。第十六頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

3共沉淀法

原理:這是利用離子型表面活性劑如SDS(十二烷基磺酸鈉)、非離子型聚合物如聚乙二醇、聚乙烯亞胺以及丹寧酸、硫酸鏈霉素等，在一定條件下能與蛋白質直接或間接形成絡合物，使蛋白質沉淀析出．然后再用適當方法使需要的酶溶解出來，除去雜蛋白和沉淀劑，從而達到純化目的的方法。第十七頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二4選擇性沉淀法

原理:某些多聚電解質如聚丙烯酸、硫酸糊精以及磷、砷、硅的鎢、鉬、釩等的雜多酸常能在極低的濃度條件下，選擇性地和某種或某類酶結合沉淀析出，其選擇性的機制尚不清楚。以聚丙烯酸(PAA)為例，它的分子量近9000或近300,000的聚合物對某些蛋白酶、磷酸酯酶和溶菌酶等有選擇性沉淀效果，故可用于這些酶的純化.第十八頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

5等電點沉淀法原理：蛋白質的溶解度隨分子間引力增大而變小，當其它條件相同時，分子間的引力以蛋白質處于等電點狀態(tài)最大，因而容易析出沉淀。不過由于蛋白質在等電點時仍有一定的溶解度，故沉淀往往不完全，一般很少單獨使用，更多的是作為其它沉淀法中的一個組合條件。但是，這種方法有時可用于對付雜蛋白種類較多的樣品，因為將這種樣品的pH調整至某一值后，不僅會使處于等電點狀態(tài)的蛋白質沉淀，也可使處于等電點兩側帶相反電荷的雜質形成復合物而沉淀，從而可除去大量雜蛋白。第十九頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二（四）根據(jù)分子大小的建立純化方法：１.膠過濾(層析)法；２.篩膜分離法；３.超離心法分離。第二十頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二１.膠過濾(層析)法原理：必須以層析的方式進行．柱中填充分子篩介質,用于生物大分子分離的分子篩介質是具有一定孔徑的球狀凝膠物質.層析柱中裝入某種孔徑的凝膠物質以后,再加入待純化樣品,然后用適當?shù)娜軇┗蚓彌_液使該樣品自上而下地擴展.這樣,樣品中的各種分子就將按其分子大小表現(xiàn)不同的層析性態(tài)而分離.大于凝膠孔徑的分子不能進入膠粒內,它們只能沿膠粒間隙擴展,因而“走”的是一條較“直”的“路”,表現(xiàn)出較快的移動速度;反之,小于凝膠孔徑的分子,由于它們能自由進出膠粒內外,按照分子熱運動的規(guī)律,其運動軌跡“迂回曲折”,因此,表現(xiàn)較慢的下移速度.所以只要待純化樣品通過一定長度的層析柱后,不同大小的分子就將按先后顧序依次流出,彼此分開.第二十一頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二膠過濾(層析)法原理第二十二頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二膠過濾(層析)法應考慮的因素:(1)膠的選擇（葡聚糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖凝膠）;(2)柱層析的過程與要求；

(3)膠過濾中膠的用量（與樣品體積有關）;(4)其它有關問題(樣品，洗脫液，膠的再生與保存）．第二十三頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

(1)膠的選擇

作為分子篩的凝膠是由親水的線狀聚合物通過交聯(lián)劑交聯(lián)、或通過聚合物自身締合組成具有網(wǎng)眼結構的膠粒物質。網(wǎng)眼孔徑大小由交聯(lián)程度或聚合物的濃度決定。最常用的凝膠有:(i)葡聚糖凝膠

(ii)聚丙烯酰胺凝膠

(iii)瓊脂糖凝膠第二十四頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

葡聚糖凝膠：這是分子量從幾萬到幾十萬的葡聚糖通過環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結構物質?？捎糜诜蛛x分子量1000—500，000的分子。以商品SephdexG—為例，G—以后的數(shù)字為膠膨潤時吸水量的10倍，如Ｇ—25就表示該膠物質每1g能吸水2.5m1，這個數(shù)字越大說明吸水量越高，孔徑也越大，更適于分離較大的分子.此外,還有SephdexLH—，是兼具親脂性和親水性的凝膠，可用于脂類化合物的分離；SephacylS—可用于水溶液和有機溶劑系統(tǒng)，或高濃度氫鍵解離試劑存在的系統(tǒng)．第二十五頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二各種葡聚糖凝膠G第二十六頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二(2)柱層析的基本過程與要求

過程：層析介質的平衡；裝柱；加樣；擴展(包括洗滌和洗脫)以及與此同時進行流出液成分(蛋白質或酶活性)的檢測和分部收集。

分離效果的標準：分辨率高，回收率高；稀釋度小和速度快。其中分辨率可用Rs權衡：

Rs＝兩峰帶間距離／峰帶寬當Rs＝1.2時，通常認為基本上達到了分離要求.第二十七頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二膠過濾法的特點:

不受pH、鹽和溫度等的影響；操作條件溫和、簡便，勿需特殊的再生處理，適于各種分子的分離．第二十八頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

2.篩膜分離法

原理:篩膜分離法也即超過濾分離法，它是利用微孔超濾膜僅能選擇性地透過一定大小的分子而達到分離目的一類方法。

特點:它操作比較簡單，條件也溫和，但是只能達到粗分的要求。第二十九頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

3超離心分離法

原理:這是利用樣品中不同大小的分子在相對離心力場達80，000一250，000g的條件下分布不同而進行分離純化的一種方法。

應用:此法主要用于病毒、細胞顆粒體等的制備，對分子量較小的酶或蛋白質分離效果一般不佳，分辨率不高而且費時.第三十頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二五.根據(jù)解離電學性質的特點建立的純化方法:1.吸附交換(層析)法;2.電泳法;3.聚焦層析法。第三十一頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

1吸附交換(層析)分離法這是最常用的一類純化方法。

原理:利用待純化樣品中不同的分子和吸附劑間的吸附與解吸性質的不同而達到分離。這類分離或以靜態(tài)吸附方式進行，或以層析吸附方式進行。過程:有三個主要環(huán)節(jié)：加樣吸附、洗滌和洗脫。實際上每一個環(huán)節(jié)都包含目的酶和雜蛋白的分離，因此是一種十分有效的純化方法。第三十二頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二吸附交換分離法原理示意第三十三頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

吸附劑:根據(jù)吸附機制的不同可分為三種類型：

1.“傳統(tǒng)”的物理吸附劑;2.羥基磷灰石;3.離子交換吸附劑。第三十四頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

(1)物理吸附

傳統(tǒng)的物理吸附劑常用的有白土、氧化鋁和磷酸鈣膠等。其中白土是以硅酸鋁為主要成分的具有強吸附力的一類粘土，包括皂土、高嶺土和活性白土等；氧化鋁根據(jù)制備方法不同有多種成品，磷酸鈣膠可從氧化鈣和磷酸三鈉直接制備。物理吸附的原理:

一般認為它是由于吸附劑界面分子和樣品分子間相互作用的范德華力所引起；因而選擇性不強預見性較小，往往需要通過實驗加以確定。這類吸附劑應用很早，但沒有得到更大的發(fā)展，原因可能也就在于此。第三十五頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二(2)羥基磷灰石吸附：近年來應用羥基磷灰石作為吸附劑的日期增多，它是一種微晶型的磷酸鈣制品。原理:

一般認為是，這種晶體表面的鈣離子能和蛋白質的負電性基團相互作用，而磷酸基團則能和正電性基團結合。如果在系統(tǒng)中有對鈣親和力更強的離子(如檸檬酸鹽)存在時，羥基磷灰石對蛋白質的吸附能力就會顯著下降，但是其它鹽如NaCl等，即使?jié)舛群芨?，也不會影響蛋白質的負電性基團和鈣之間的結合。反之，這些鹽可以大大降低正電性基團的作用，也就是說在鹽濃度很高的溶液，羥基磷灰石可用來吸附酸性或中性蛋白，而排除堿性蛋白，這樣就可以省去吸附前的脫鹽透析平衡。羥基磷灰石對蛋白質的吸附容量比較高，在一般吸附操作條件下約50克／升床體積。第三十六頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

(3)離子交換吸附原理:這類吸附是在蛋白質的解離基團與離子交換劑的解離基團之間的解離交換過程中進行的。由于各種蛋白質和離子交換劑在不同條件下有相應不同的解離狀態(tài)，因此通過選擇適當?shù)慕粨Q劑、控制交換和洗脫條件，就可將酶和雜蛋白分離開來。第三十七頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

分類:離子交換劑包括兩個部分：載體和離子交換基團。常用的吸附劑有：離子交換樹脂、離子交換纖維素和離子交換凝膠。離子交換樹脂是以交聯(lián)的聚苯乙烯樹脂等為載體，再導入相應的解離基團而成;離子交換纖維素是目前酶的純化工作中用得最多的交換劑，它是以親水的纖維素為載體，在引入相應的交換基團后制成的;離子交換凝膠以葡聚糖凝膠或瓊脂糖凝膠為載體，導入相應的交換基團后制成。第三十八頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

按離子交換基團分類:

離子交換基團是交換劑表現(xiàn)功能的基礎，它的性質決定交換劑的類型與強弱。帶陽電荷解離基的交換劑在離子交換過程中能吸附荷陰電的離子，故稱為陰離子交換劑；反之，帶陰電荷解離基的交換劑可對付荷陽電離子，稱為陽離子交換劑。第三十九頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

離子交換劑的選擇依據(jù)：首先是待分離酶(或蛋白)的穩(wěn)定性;

其次是強型和弱型交換劑的選擇;

第三是交換容量,交換容量有兩方面的含義,一為總的交換容量；一為實效交換容量。前者是指每克干離子交換劑上帶有的總交換基數(shù)目，其中包括潛在的交換基；后者是指特定的實驗條件下實際可用于交換的交換基數(shù)目;

第四是流速,纖維素柱的流速一般低于凝膠。第四十頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

待分離酶(或蛋白)的穩(wěn)定性的選擇:(i)如果待分離的酶在低于其pI的pH條件下穩(wěn)定，則可選用陽離子交換劑;(ii)如果待分離的酶在高于其pI的pH條件下穩(wěn)定，則采用陰離子交換劑;(iii)如果待分離的酶在高于和低于其pI的pH條件下都穩(wěn)定，則兩種交換劑都可以考慮。第四十一頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

交換劑類型的選擇:(i)如果待分離酶的pI偏向極端(小于6或大于9)一般應考慮強型交換劑，因強型交換基能在廣泛的pH范圍內保持解離狀態(tài)，而弱型的交換基的解離和pH條件密切相關;弱型陽離子交換劑在pH6以下，陰離子交換劉在pH9以上開始不帶電荷失去交換能力。

(ii)如果待分離的酶既可應用強型交換劑，也可用弱型交換劑，但是酶不穩(wěn)定，此時應優(yōu)先考慮選擇弱型。第四十二頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

優(yōu)點:

離子交換吸附法是目前僅次于鹽析的一種常用的純化方法。它的適用面廣，幾乎所有的蛋白都可用此法分離；其次是它具有很高的分辨率和回收率。第四十三頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

2電泳分離法原理:

這是根據(jù)各種蛋白質解離、電學性質上的差異，利用它們在電場中的遷移方向與遷移速度不同而進行純化的一類方法。特點:這類方法可以達到很高的分辨效果，但在實驗放大和樣品回收方面有一定困難，因此目前主要用于蛋白質的分析和小規(guī)模制備。第四十四頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

常用的電泳方法可大致分為以下幾種類型：

(1)自由界面電泳它需要復雜的設備，而且待分離物質往往不能完全分開，故現(xiàn)在僅用于純酶均一性的檢定。

(2)區(qū)帶電泳

這是在惰性支持物上進行的一類電泳分離分析法。和前一類相比，它具有簡便靈活，無對流擴散，可達到完全分離等優(yōu)點。第四十五頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二區(qū)帶電泳分類:

第一種最簡單的是膜電泳，它以濾紙、醋酸纖維素薄膜為支持物，簡易快速，但分離量很低，只能用于蛋白質粗分析。第二種區(qū)帶電泳是粉末電泳，常用的支持物為淀粉與醇化的纖維素。

第三種是凝膠電泳，這種電泳兼具分子篩效應，因而可達到很高的分辨率。早期用的支持物為淀粉膠，近年來主要應用聚丙烯酰胺凝膠，這種膠能更嚴格地控制膠孔徑。第四十六頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二SDS第四十七頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二(3)等電聚焦電泳

這是利用兩性電解質載體--一種多乙烯多胺與丙烯酸加合反應得到的同系多異構體混合物，它們具有相近的pK值與pI值—在電場作用下能形成連續(xù)平滑的pH梯度，待分離樣品中各組份在電泳過程中，又能按照各自的等電點聚焦到相應的pH梯度位置上從而達到分離目的。第四十八頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二等電聚焦圖譜第四十九頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二3聚焦層析

特點:聚焦層析是根據(jù)蛋白質的等電點差別進行層析分離的純化方法。它不需要特別的聚焦電泳裝置，但兼具等電聚焦電泳的高分辨率和柱層析的簡便性兩種特點。

原理:當用特定的多緩沖液滴定和淋洗填裝在層折柱中的特定多緩沖交換劑時，隨著這種緩沖液的擴展，就會在層析柱中自上而下地建立起pH梯度；而該層析柱中的蛋白質也將隨多緩沖液的擴展按各自的等電點聚焦于相應的pH區(qū)段，并隨擴展過程pH梯度的逐漸下移而下移，最后分別從層析柱先后洗出，達到分離純化的目的。第五十頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

六．利用穩(wěn)定性的差異建立的純化方法:

選擇性變性法就是根據(jù)酶和雜蛋白在某種條件下穩(wěn)定性的差別，而采取的一類可一舉除去大量雜蛋白的簡便純化方法。

1.選擇性熱變性法;2.選擇性酸堿變性法;3.選擇性表面變性法。第五十一頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

1選擇性熱變性如果待分離的酶相當耐熱，那末就可在嚴格控制的條件下，將酶溶液迅速升溫到它穩(wěn)定的溫度(如50-70℃)，并保溫一定時間(如5-15分鐘)，而后迅速冷卻，這樣大量不耐熱的雜蛋白就將變性析出，離心除去后，酶的比活力就將大大提高，而總活力損失很少或者根本不損失，有時甚至還可能有所提高。第五十二頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

2酸堿變性法如果能嚴格地將酶溶液控制在酶穩(wěn)定的pH范圍內用酸堿處理一定時間，進行選擇性變性，同樣也可達到有效的純化目的。

和選擇性熱變性相比，酸堿變性應用得不多，主要原因可能在于操作較為復雜，而且純化效果較差。第五十三頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

3表面變性法利用酶溶液和惰性液體(如氯仿)混合振蕩，造成選擇性表面變性來制備過氧化氫酶、醇脫氫酶和α-淀粉酶等。振蕩處理后通常分成三層：上層為未變性蛋白；第二層為乳濁狀變性蛋白；下層為氯仿。這種處理時間不宜長，否則將導致所有蛋白質變性。第五十四頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二七根據(jù)專一的親和作用建立的純化方法

1.親和層析法;2.親和電泳法第五十五頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二1親和層析法親和層析法是據(jù)生物分子間某種特有的親和力而建立的一種新型純化方法。

原理:酶和它的底物(包括輔助因子)、底物類似物或競爭性抑制劑通常都具有較高的親和力，能專一而可逆地形成酶—配基絡合物。因此，如果將這類配基偶聯(lián)固定于樣品中，那么，它就能迅速而有選擇性地將相應的酶分子從溶液中分離出來，達到和其它雜蛋白分離的目的，這就是親和吸附。第五十六頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二2.親和電泳法:

親和電泳法是將親和層析和聚丙烯酰胺膠電泳結合在一起的高分子分離分析方法。

原理：當相應的親和配基共價偶聯(lián)于電泳膠(即載體，通常多用聚丙烯酰胺)上以后，由于具有親和作用的待分離分析成份和配基具有結合力，在電泳過程中不會移動，而不具親和性的成份將按各自的電泳速度而分離開來。

第五十七頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

八結晶所謂結晶，是指分子通過氫鍵、離子鍵或分子間力，按規(guī)則且周期性排列的一種固體形式。

由于各種分子形成結晶的條件不同，也由于變性的蛋白質和酶不能形成結晶，因此，結晶既是一種酶是否純凈的標志，也是一種酶和雜蛋白分離純化的手段。第五十八頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

為了獲得純凈、粒大、收得率高的結晶應注意：

(1)酶溶液應該達到相當?shù)募兌瘸松贁?shù)例外，不純的溶液是不能得到結晶的。

(2)酶的濃度要恰到好處一般以1—5％為宜，不宜小于0.2％，濃度高雖然較易結晶，但如果過于飽和，只能獲得大量微晶，難以形成大晶體。第五十九頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二結晶方法：1.鹽析結晶2.有機溶劑結晶3.透析平衡結晶4.等電點結晶第六十頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二九.濃縮與干燥1.濃縮真空濃縮2.干燥方法真空干燥冷凍干燥噴霧干燥氣流干燥吸附干燥第六十一頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二四酶的純度和產(chǎn)量

（一）活力測定在酶的抽提和純化過程中，為了了解所選擇的方法和條件是否適宜，每一步驟前后都應進行酶的活力測定，作出總活力與比活力的比較。第六十二頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

如何進行酶的活力測定：

(1)如果待分離的酶已有報導，可參考它所采用的測定方法和條件；

(2)如果需要另建新的測定系統(tǒng)，那么就得先對該酶的作用、動力學性質等有所了解，據(jù)此來選擇合適的底物和底物濃度、以及最適的反應pH和溫度等，同時確定一種相應的測定方法。第六十三頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二測酶活時的注意事項:

一是測定用的酶反應時間應選擇在酶反應的初速度范圍內；二是測定用的酶量必須和測得的活性有線性關系。

第六十四頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二純化過程中的酶活力測定還應考慮三個問題：

(1)由于測定工作量校大，而且有時“立等”結果，所以要求測定方法快速、簡便，而準確度在一定程度上比較次要，甚至可容許5—10％的誤差，故常用分光光度法、電學測定法等測定;(2)由于分離純化過程可能丟失輔助因子，因此有時需要在反應系統(tǒng)中加入相應的物質，如煮沸過的抽提液、輔酶、鹽或半脫氨酸等；

(3)由于純化過程中引入的某些物質可能對酶的反應和測定有影響或干擾，故有時還應在測定前進行透析或加入螯合劑等。第六十五頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

測定酶活力的表示方法:

酶的活力通常采用國際酶學委員會規(guī)定的單位表示，但是在純化工作中，為了方便，也可采用自行規(guī)定的單位，如直接以光密度值表示.從酶的活力測定得到的直接結果是樣品中酶的濃度，即單位數(shù)／毫升。由此進一步算出樣品中總的單位數(shù)，即總活力;以及單位重量的蛋白質中酶的單位數(shù)，即比活力，如單位數(shù)／毫克蛋白，或單位數(shù)／毫克蛋白氮。

第六十六頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

測蛋白含量常用的方法有：

(1)紫外吸收法，此法簡便快速，不損耗樣品，但干擾因素很多；

(2)雙縮脲法,較簡單；

(3)酚試劑法,較復雜，但靈敏度、準確度都比較高。

(4)蛋白質通常采用凱氏定氮法。一般比活力愈高，酶的純度也較好，但是它不能說明實際的純凈程度是多少。第六十七頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

（二）純化方法與條件的比較標準在酶的分離工作中，總活力用于計算某一抽提或純化步驟后酶的得率或回收率(y)；比活力則用于計算某一純化步驟的純化效果，即純度的提高(e)。第六十八頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二y(收率)=——————————某步驟前的總活力某步驟后的總活力e(純度提高)=——————————某步驟前的比活力某步驟后的比活力第六十九頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

抽提或純化某步中，如果有多種方法或條件可供選擇時，一般采用下式進行權衡：

loge＝logE·logy／logYe和y分別表示用某種方法或條件進行一次純化后純度的提高與回收率；G和Y分別表示用上述方法或條件重復多次后總的純度提高與總的回收率，這兩項是推算出來的。第七十頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

例如，有A、B二種方法或條件可供選擇，用A法重復n次以后可得到Ea和Ya；以Ea為標準，用B法要得到同樣的Ea，需要重復n次，由此就可算出相應的Yb．比較Ya和Yb就能作出判斷。第七十一頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

三純度的標準純度提高和回收率的鑒定能幫助我們選擇純化方法與純化條件。但是經(jīng)過一定的純化步驟后，為了了解所獲得的樣品是否均一純凈還要進行純度鑒定。第七十二頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二酶均一純凈性的鑒定有以下幾種方法:1．溶解度法這是老方法，由于所需樣品量較大，已很少采用．2.電泳法常用的有醋酸纖維素薄膜電泳、聚丙烯酰胺不連續(xù)膠電泳和聚焦膠電泳，特別是后二者有極高的分辨力。3.超離心法

在高達65，000rpm的離心力場情況下觀測離心譜帶，根據(jù)沉降峰帶是否分裂、是否有“肩”、是否對稱等可以作出均一與否的判斷。第七十三頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二4．免疫學法純化的酶樣品在瓊脂膠上與相應的抗體進行免疫反應，根據(jù)得到的沉降線可以判斷樣品的純度。如果此法以免疫電泳的方式進行，則更為靈敏。第七十四頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二第四節(jié)酶的劑型與保存為適應各種需要，并考慮到經(jīng)濟和應用效果，酶制劑常以四種劑型供應：

1.液體酶制劑

2.固體粗酶制劑

3.純酶制劑

4.固定化酶制劑第七十五頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

一.液體酶制劑制備與應用:

這包括稀酶液和濃縮酶液。一般在除去菌體等雜質后，不再純化而直接制成或加以濃縮。只適于就近的某些工業(yè)部門如紡織工業(yè)等直接應用．特點:

比較經(jīng)濟，但不穩(wěn)定，而且成份繁雜.第七十六頁，共八十二頁，編輯于2023年，星期二

二.固體粗酶制劑

制備