胚胎體外培養(yǎng)和胚胎評(píng)估的培訓(xùn)培訓(xùn)課件

胚胎體外培養(yǎng)和胚胎評(píng)估的培訓(xùn)胚胎體外培養(yǎng)胚胎評(píng)估空氣、振動(dòng)、光照…培養(yǎng)箱外環(huán)境人員/操作培養(yǎng)流程℃alarmiauto-start

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％CO2cal90℃auto-startdoor90℃hl37.05.095.0培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境氣體、

濕度、培養(yǎng)皿、油…培養(yǎng)液胚胎體外培養(yǎng)體系培養(yǎng)箱外環(huán)境空氣及污染物振動(dòng)、噪音光照室內(nèi)濕度揮發(fā)性有機(jī)化合物VOC總揮發(fā)性有機(jī)化合物（TVOC）：熔點(diǎn)低于室溫沸點(diǎn)50～260℃揮發(fā)性有機(jī)化合物的總稱(chēng)世界衛(wèi)生組織(WHO,1989)

VOC分類(lèi)苯系物（苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯）二異氰酸酯（TDI）二異氰甲苯酯有機(jī)氯化物（三氯乙烯、三氯甲烷、三氯乙烷）氟里昂類(lèi)石油烴類(lèi)有機(jī)酮、醛、胺、醇、醚、酯、酸等測(cè)定VOC先俘獲、后測(cè)定各種VOC的俘獲方法不同測(cè)定總VOC？目前測(cè)定的“TVOC”：6~13個(gè)碳原子的苯系有機(jī)物其他VOC有各自的俘獲測(cè)定方法未知VOC很難測(cè)定塵埃粒子直徑>0.5um的懸浮粒子十萬(wàn)級(jí)：3500000/m3萬(wàn)級(jí)：350000/m3千級(jí)：35000/m3光照來(lái)源：室內(nèi)照明燈、顯微鏡光源危害：損害線(xiàn)粒體培養(yǎng)液成分分解紫外線(xiàn)產(chǎn)生活性氧，對(duì)所有細(xì)胞有害光照豚鼠卵，超過(guò)一小時(shí)，影響后續(xù)受精和有絲分裂低照度利于人卵的囊胚形成和妊娠有相反的結(jié)論——兔卵進(jìn)行光照20～30分鐘后，隨后的受精率和著床率并未受到明顯影響相對(duì)濕度（RH）1m3空氣25℃23g水蒸氣10g水蒸氣RH=絕對(duì)濕度/飽和濕度30℃30g水蒸氣RH=43.5%RH=33.3%理想的室內(nèi)相對(duì)濕度？設(shè)備抑制霉菌人員減少液體蒸發(fā)010030~60%培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境氣體溫度培養(yǎng)皿液滴培養(yǎng)方式油氣體二氧化碳培養(yǎng)箱CO2℃alarmiauto-start

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％CO2cal90℃auto-startdoor90℃hl37.05.095.0三氣培養(yǎng)箱桌面式培養(yǎng)箱N(xiāo)2氣體純度99.99%?99.995%?99.999%?剩余的0.001%是什么？CO2高濃度氧，胚胎基因表達(dá)異常？低氧培養(yǎng)改善體外胚胎發(fā)育低氧培養(yǎng)，人囊胚細(xì)胞數(shù)增加低氧培養(yǎng)低氧培養(yǎng)部分文獻(xiàn)——不必要低氧?培養(yǎng)液內(nèi)，添加了抗氧化物質(zhì)（?；撬?、丙酮酸）可能消除高氧的不利影響37.05.095.0maxmin℃%CO2%rHdesautozeroauto-startcontrolidesstart/stopIOASRM，2013年支持低氧環(huán)境利于囊胚形成！低氧同樣利于卵裂期胚胎LowoxygenconcentrationsforembryocultureinassistedreproductivetechnologiesStephanBontekoe1,*,EleniMantikou1,MadelonvanWely1,PublishedOnline:11JUL2012Assessedasup-to-date:4NOV2011DOI:

10.1002/14651858.CD008950.pub2薈萃分析，隨機(jī)對(duì)照研究1382名IVF/ICSI患者20%vs5%O2活產(chǎn)率從32%提高到43%溫度鼠胚室溫5分鐘——降低卵裂率15分鐘——囊胚形成率減半人卵母細(xì)胞——低溫?fù)p害紡錘體溫度——紡錘體解聚與恢復(fù)33℃下，5分鐘解聚，10分鐘完全消失37℃后,10分鐘內(nèi)恢復(fù)28℃，解聚加快，恢復(fù)時(shí)間長(zhǎng)，20分鐘不能完全恢復(fù)液滴/培養(yǎng)方式單獨(dú)培養(yǎng)集合培養(yǎng)胚胎自分泌、旁分泌作用減小體積適當(dāng)增加胚胎數(shù)目液滴自分泌旁分泌集合培養(yǎng)——依據(jù)鼠、羊、牛胚胎培養(yǎng)證據(jù)具體旁分泌因子未確定集合培養(yǎng)——方法20～50ul2～5個(gè)胚胎/液滴蓋油（石蠟油、礦物油）液滴礦物油液滴液滴集合培養(yǎng)缺點(diǎn)：不利于單個(gè)胚胎的連續(xù)觀察解決1：按Day3形態(tài)學(xué)評(píng)分分組培養(yǎng)8細(xì)胞碎片0～10％8細(xì)胞碎片20～40％6細(xì)胞碎片20～50％解決2：特殊培養(yǎng)皿液滴培養(yǎng)液培養(yǎng)液種類(lèi)水、離子碳水化合物氨基酸pH值及緩沖物質(zhì)維生素，抗生素螯合劑抗氧化物質(zhì)蛋白質(zhì)，大分子激素，生長(zhǎng)因子培養(yǎng)液種類(lèi)序貫培養(yǎng)液?jiǎn)我慌囵B(yǎng)液序貫培養(yǎng)mmol/LGardner,1998序貫培養(yǎng)葡萄糖不利于分裂期胚胎發(fā)育囊胚主要能量來(lái)源EDTA利于分裂期胚胎發(fā)育抑制囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)發(fā)育氨基酸序貫培養(yǎng)系統(tǒng)Day1~Day3:卵裂期培養(yǎng)液Day3~Day6：囊胚培養(yǎng)液?jiǎn)我慌囵B(yǎng)液？單一培養(yǎng)：簡(jiǎn)化流程，形成率類(lèi)似Day3換液Day3不換液！pH值與緩沖物質(zhì)pH：代表氫離子濃度pH與細(xì)胞各種生理功能關(guān)系極密切pH指示劑：酚紅緩沖物質(zhì)：維持pH穩(wěn)定，成對(duì)或一種：碳酸鹽緩沖對(duì)、MOPS、HEPES1pH值147pH值與CO2濃度最重要的緩沖對(duì)碳酸鹽緩沖對(duì)：HCO3-/H2CO2pH=pKa+lg（————）〔HCO3﹣〕〔H2CO3〕培養(yǎng)系統(tǒng)的pH值7.2-7.4碳酸鹽體系不穩(wěn)定！暴露空氣會(huì)使PH迅速升高蓋油減少培養(yǎng)基氣體交換CO2濃度影響因素設(shè)定值：5%？6%傳感器類(lèi)型培養(yǎng)箱開(kāi)門(mén)方式溫度、濕度無(wú)機(jī)離子參與滲透壓形成高濃度氯化鈉不利于鼠囊胚形成胞外鎂和鈣的水平與早期胚胎細(xì)胞對(duì)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)能力有關(guān)磷在含有葡萄糖的簡(jiǎn)單培養(yǎng)基例如HTF或Earl’s抑制人胚胎的發(fā)育無(wú)機(jī)離子銨氨基酸代謝及自然分解產(chǎn)生的氨會(huì)導(dǎo)致胚胎毒性物質(zhì)-銨離子的積累銨離子可以改變胚胎分化、代謝及基因表達(dá)會(huì)嚴(yán)重降低移植后種植率及胎兒發(fā)育率抗生素培養(yǎng)基中一般均含抗生素例如青霉素、鏈霉素和慶大霉素主要作用時(shí)防止培養(yǎng)基的細(xì)菌污染蛋白質(zhì)/大分子物質(zhì)白蛋白可以降低配子和胚胎表面電荷，避免其粘到玻璃或塑料上便于操作，且可以抵消毒性效應(yīng)如：人血清蛋白（HSA）和牛血清蛋白、人血漿蛋白粉、5%血漿蛋白注射液、及合成血清替代品（sss）阻止培養(yǎng)液的蒸發(fā)及培養(yǎng)基pH的變化種類(lèi)：礦物油石蠟油油培養(yǎng)液儲(chǔ)運(yùn)冷鏈運(yùn)輸，2~8℃保持容器密封，有泄漏的容器導(dǎo)致培養(yǎng)液堿化，鎂離子沉淀減少細(xì)菌污染風(fēng)險(xiǎn)分裝目的：減少開(kāi)瓶次數(shù)分裝量：根據(jù)使用情況，一次一支分裝容器，與量匹配標(biāo)記分裝日期胚胎移植－移植時(shí)期廣泛采用D3（約8-cell）胚胎移植在體內(nèi)此時(shí)的胚胎是在輸卵管內(nèi)，而不是在子宮內(nèi)卵裂期移植的妊娠率低于D4及囊胚移植囊胚培養(yǎng)進(jìn)一步篩選胚胎靈活的移植時(shí)間便于PGD/PGS減少異位妊娠囊胚的整倍體率年齡與囊胚的整倍體率BarisAta2012年齡人員及操作人員數(shù)量適當(dāng)每項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)均至少2人能熟練實(shí)施確保足夠人力實(shí)現(xiàn)雙人復(fù)核衛(wèi)生部（衛(wèi)科教[2003]176號(hào)文件）規(guī)定，實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員不得少于3人。年周期超過(guò)1000個(gè)周期的中心需要適當(dāng)增加技術(shù)人員每名全職胚胎學(xué)家完成250~400周期/年人員及操作操作時(shí)間對(duì)卵、胚胎的應(yīng)激核對(duì)胚胎體外培養(yǎng)胚胎評(píng)估卵巢刺激后獲得的胚胎發(fā)育潛能不一致減少移植胚胎數(shù)，挑選正確的胚胎！胚胎評(píng)估、胚胎選擇是IVF實(shí)驗(yàn)室技術(shù)中的核心常規(guī)胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估始于第一例IVF-ET1981年Edwards闡述了形態(tài)學(xué)評(píng)估的方法胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估多種評(píng)分體系可進(jìn)行胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估缺點(diǎn)依賴(lài)操作者主觀能力優(yōu)勢(shì)快速而有效Alpha“Toadvancetheartandscienceofclinicalembryologyforthebenefitofthepublicworldwide,throughinternationalpromotionofeducation,communication,andcollaboration.”objectives唯一由資深胚胎學(xué)家組成的國(guó)際組織Alpha共識(shí)embryomorphologycryopreservationKPIsTheProfessionalStatusoftheClinicalEmbryologistIstanbulconsensusworkshoponembryoassessment:proceedingofanexpertmeeting2010胚胎的形態(tài)學(xué)指標(biāo)透明帶極體卵周隙胚胎形狀裂球數(shù)量裂球形狀裂球排列原核碎片多核顆?？张葜旅芑遗咔淮笮CM形狀TE細(xì)胞數(shù)早卵裂Righttime，rightembryo！評(píng)估時(shí)間觀察內(nèi)容受精后時(shí)間Expectedstageofdevelopment受精17±1hPronuclearstageSyngamycheck23±1hUpto50%insyngamy(upto20%atthe2-cellstage)早卵裂26±1hpost-ICSI28±1hpost-IVF2-cellstageDay244±1h4-cellstageDay368±1h8-cellstageDay492±2hMorulaDay5116±2hBlastocyst原核期評(píng)分1998年前后提出原核核仁的數(shù)量，排列原核大小及排列胞漿狀態(tài)2001年,原核期評(píng)分能夠預(yù)測(cè)囊胚形成，與妊娠率相關(guān)近10余年一直存在爭(zhēng)議，研究多為回顧性2011年time-lapse：對(duì)評(píng)分方法提出質(zhì)疑原核期評(píng)分GradeRatingDescription1SymmetricalEquivalenttoZ1andZ22Non-symmetricalOtherarrangements,includingperipherally-sitedpronuclei3AbnormalPronucleiwith0or1NPB早卵裂24～27小時(shí)的第一次分裂Shoukir，1997年提出早卵裂是發(fā)育能力的重要標(biāo)志后多人研究證實(shí)分裂對(duì)稱(chēng)性卵裂球均等性012012Day2卵裂期評(píng)分Day3細(xì)胞數(shù)Edwards提出人早期胚胎有相對(duì)固定的發(fā)育速度超出或低于此速度，均影響后續(xù)發(fā)育大量文獻(xiàn)：細(xì)胞數(shù)——種植率、囊胚形成率！[i]

AlikaniM.HumReprod2000碎片碎片：無(wú)細(xì)胞核，細(xì)胞膜包裹的細(xì)胞外胞漿結(jié)構(gòu)（Alikani，1999）細(xì)胞代謝或分裂過(guò)程異常造成的凋亡過(guò)程染色體異常造成碎片？?jī)H僅是目前我們對(duì)碎片的認(rèn)識(shí)“細(xì)胞”大小與DNADay2胚胎，卵裂球65-70um小于45um——2％有DNA大于45um——67％有DNADay3胚胎，卵裂球55-60um小于40um——3％有DNA大于40um——66％有DNA45um35um碎片對(duì)胚胎發(fā)育的后續(xù)影響——局部融合Day4可能發(fā)生局部融合部分卵裂球和碎片排除在外局部融合——囊胚質(zhì)量下降卵裂球?qū)ΨQ(chēng)性文獻(xiàn)非常少卵裂球嚴(yán)重不均勻的胚胎種植率下降Hardarson，2001多核現(xiàn)象可能與染色體異常有關(guān)囊胚形成率下降種植率下降妊娠率下降VanRoyen，2003Magli，2007Day3胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)細(xì)胞數(shù)與碎片含量，哪個(gè)指標(biāo)更重要？在所有形態(tài)學(xué)指標(biāo)中，細(xì)胞數(shù)是最重要的獨(dú)立的預(yù)測(cè)胚胎活性的指標(biāo)！RonitMachtinger，2013細(xì)胞數(shù)與囊胚形成率北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科PUMCH－OBGYN碎片、細(xì)胞數(shù)與day6囊胚形成北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科PUMCH－OBGYN卵裂期胚胎評(píng)估細(xì)胞數(shù)少于8個(gè)＝種植能力下降多于8個(gè)＝種植率可能下降碎片:定義:d2<45μm;d3<40μm分級(jí)：少量(<10%);中等(10–25%);大量(>25%)不需要記錄碎片位置多核現(xiàn)象:一個(gè)卵裂球內(nèi)超過(guò)一個(gè)細(xì)胞核;d2評(píng)估細(xì)胞大小:2-,4-,和8-cell階段應(yīng)均勻卵裂期胚胎分級(jí)GradeRatingDescription1Good<10%fragmentationstage-specificcellsizenomultinucleation2Fairupto25%fragmentationstage-specificcellsizeformajorityofcellsnoevidenceofmultinucleation3Poorseverefragmentation(>25%)cellsizenotstage-specificevidenceofmultinucleationday4胚胎形態(tài)（桑葚胚）相關(guān)文獻(xiàn)很少GradeA~F(2011)致密化與滋養(yǎng)層的形成有重要關(guān)系致密化非常重要Day4胚胎分級(jí)GradeRatingDescription1GoodEnteredintoa4throundofcleavageEvidenceofcompactionthatinvolvesvirtuallyalltheembryovolume2FairEnteredintoa4throundofcleavageCompactioninvolvesthemajorityofthevolumeoftheembryo3PoorDisproportionatecompactionof<?embryo,withsomecellsremainingasdiscreteblastomeres囊胚質(zhì)量評(píng)價(jià)Gardner評(píng)分方法1～6期6期5期4期3期2期ABCABC囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)估滋養(yǎng)細(xì)胞層重要？?jī)?nèi)細(xì)胞團(tuán)重要？第5天新鮮SET的回顧性研究形態(tài)學(xué)指標(biāo)（擴(kuò)張程度、ICM和TE