發(fā)酵工程【精講精研+能力提升】 高考生物一輪復(fù)習(xí)（新教材新高考）

浙科版2019版總復(fù)習(xí)選擇性必修三第一節(jié)體液調(diào)節(jié)是通過(guò)化學(xué)信號(hào)實(shí)現(xiàn)的調(diào)節(jié)第一節(jié)體液調(diào)節(jié)是通過(guò)化學(xué)信號(hào)實(shí)現(xiàn)的調(diào)節(jié)第二節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)下丘腦控制內(nèi)分泌系統(tǒng)第二節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)下丘腦控制內(nèi)分泌系統(tǒng)第30課時(shí)發(fā)酵工程第十單元生物技術(shù)工程

考點(diǎn)一微生物的基本培養(yǎng)技術(shù)1.培養(yǎng)基需滿足不同微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求，以及微生物生活所需要的能量來(lái)源。異養(yǎng)型生物：培養(yǎng)基中的有機(jī)物（有機(jī)碳源，無(wú)機(jī)碳源不提供能量）自養(yǎng)型生物：光能或者化學(xué)反應(yīng)釋放的能量。(1)某些異養(yǎng)型微生物在有有機(jī)物存在的情況下可同時(shí)將CO2轉(zhuǎn)變?yōu)樽陨淼奈镔|(zhì)，它們只是不以CO2為唯一(或主要的)碳源。(2)自養(yǎng)型微生物也并非不能利用有機(jī)物生長(zhǎng)。例如，紫色非硫細(xì)菌在沒(méi)有有機(jī)物時(shí)可以將CO2轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)物，而當(dāng)有機(jī)物存在時(shí)，它又可以利用有機(jī)物生長(zhǎng)；它在有光照和無(wú)氧條件下可以利用光能生長(zhǎng)，在黑暗和有氧條件下可以利用有機(jī)物生長(zhǎng)。這種營(yíng)養(yǎng)方式的可變性提高了微生物在環(huán)境中的生存能力。許多微生物的代謝方式并不唯一蛋白胨、酵母提取物：為細(xì)菌生長(zhǎng)提供碳源、氮源和維生素（生長(zhǎng)因子）氯化鈉：維持一定的滲透壓瓊脂：凝固劑，不易分解，一般不作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。其在96℃時(shí)融化成液體，冷卻到45℃以下即重新凝固。（LB培養(yǎng)基）LB固、液體培養(yǎng)基：蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、水、瓊脂(固體培養(yǎng)基)豆芽汁、稻草浸汁、牛奶、血清選擇：菌種分離鑒別：菌種鑒定液體培養(yǎng)基：培養(yǎng)基液體狀，沒(méi)加凝固劑，常用于大規(guī)?？焖俜敝衬撤N微生物。固體培養(yǎng)基：培養(yǎng)基固體狀，加了凝固劑（一般是瓊脂）。包括“平板”和“斜面”?！捌桨濉保ň洌┛捎糜诜蛛x、鑒定、活菌計(jì)數(shù)“斜面”常用于菌種保存

菌種短期保存：在無(wú)菌條件下將單菌落用接種環(huán)取出，再用平板劃線法接種在固體斜面上，在37℃下培養(yǎng)24h后，置于4℃冰箱中保存。

菌種長(zhǎng)期保存：甘油冷藏法（

-20℃）

微生物在甘油中生長(zhǎng)和代謝受到抑制達(dá)到保藏的目的。市售6×上樣緩沖液(loadingbuffer)；內(nèi)含甘油可以增加樣品密度，確保DNA能夠沉入加樣孔內(nèi)；含有少許溴酚藍(lán)作為電泳指示劑，電泳時(shí)溴酚藍(lán)遷移速率較快，在其遷移出凝膠前關(guān)閉電泳儀電源。1.將有（為液體狀的固體培養(yǎng)基）培養(yǎng)基的三角瓶和培養(yǎng)皿放到超凈臺(tái)上；2.打開(kāi)超凈臺(tái)的紫外燈和過(guò)濾風(fēng)（注意打開(kāi)紫外燈后人必須離開(kāi)）倒平板3.待固體培養(yǎng)基冷卻到60℃時(shí)（手放上還有些熱的時(shí)候），關(guān)閉紫外燈，點(diǎn)燃酒精燈，用鑷子夾出酒精棉球擦拭桌面，并用酒精棉球擦手。4.在酒精燈火焰旁，將三角瓶中的培養(yǎng)基倒在培養(yǎng)皿里。將培養(yǎng)基分別倒至4個(gè)培養(yǎng)皿中，每倒入一個(gè)培養(yǎng)皿后立即將培養(yǎng)皿置于水平位置上，并輕輕晃動(dòng)，使培養(yǎng)基鋪滿底部，待凝固后即形成平面。凝固后將培養(yǎng)皿倒置。（利于水分蒸發(fā)，防止冷凝水污染培養(yǎng)基）合成培養(yǎng)基：化學(xué)成分完全清楚的培養(yǎng)基，一般用于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的、要求可重復(fù)性強(qiáng)的各項(xiàng)研究工作。天然培養(yǎng)基：成分還不十分清楚或成分不恒定的天然有機(jī)物制成的培養(yǎng)基。成本較低，除了在實(shí)驗(yàn)室常用外，更多被用于大規(guī)模的生物發(fā)酵工業(yè)。如：馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基、麥芽汁蔗糖培養(yǎng)基等。選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基的比較抑制不需要微生物的生長(zhǎng)，促進(jìn)需要的微生物的生長(zhǎng)，從而提高對(duì)該菌的篩選效率不能抑制不需要微生物的生長(zhǎng)。酚紅鑒定分解尿素的菌，不能篩選。選擇培養(yǎng)基的常用設(shè)計(jì)方案加入青霉素的培養(yǎng)基：分離酵母菌、霉菌等真菌。加入青霉素、卡那霉素等抗生素的培養(yǎng)基：分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞。加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基：分離耐鹽的金黃色葡萄球菌。不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基：分離固氮菌。不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基：分離自養(yǎng)型微生物。加入氨基蝶呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基：分離雜交瘤細(xì)胞。提醒：使用選擇培養(yǎng)基對(duì)微生物進(jìn)行篩選時(shí)，需設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)，一般選擇LB全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基作為對(duì)照。實(shí)例：配制可用于培養(yǎng)酵母菌的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)基的配置過(guò)程調(diào)pH值

混合加熱融化（瓊脂）確定配方及用量滅菌分裝2.滅菌和無(wú)菌操作技術(shù)(1)目的：獲得純凈的微生物培養(yǎng)物。(2)關(guān)鍵：防止雜菌污染。(3)消毒①定義：采用較溫和的物理、化學(xué)方法殺死物體表面或內(nèi)部一部分不需要的微生物。②原理：加熱使蛋白質(zhì)變性、紫外線使菌體的蛋白質(zhì)和核酸變性。③列舉物理方法：煮沸消毒、紫外線照射等。④列舉化學(xué)方法：75%酒精、高錳酸鉀、5%次氯酸鈉、漂白粉等。

(4)滅菌：①定義：采用強(qiáng)烈的物理、化學(xué)方法殺滅物體表面以及內(nèi)部的一切微生物的方法，包括有些菌產(chǎn)生的芽孢結(jié)構(gòu)。（在營(yíng)養(yǎng)缺乏或代謝產(chǎn)物積累的環(huán)境中形成的沒(méi)有繁殖功能的休眠構(gòu)造，與細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同，在休眠期間不進(jìn)行明顯的代謝活動(dòng)，因而對(duì)加熱、紫外線、化學(xué)藥物都具有較強(qiáng)的抵抗能力。）

②高壓蒸汽滅菌法、過(guò)濾除菌、灼燒滅菌的比較

對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行高壓蒸汽滅菌時(shí)，滅菌時(shí)間應(yīng)從達(dá)到設(shè)定的溫度或壓力值時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)。含葡萄糖的培養(yǎng)基也可采用適當(dāng)降低溫度、壓力（500g/cm2、112℃）以及延長(zhǎng)時(shí)間（30min）的高壓滅菌。（防止其焦化）對(duì)于不耐熱的液體培養(yǎng)基，一般可將其轉(zhuǎn)入G6玻璃砂漏斗中，采用抽濾方式可較快地進(jìn)行過(guò)濾滅菌。G6玻璃砂漏斗孔徑最小，細(xì)菌不能濾過(guò)，使用前也要在121℃下用紙包好滅菌，使用后需用1mol/L的HCI浸泡，并抽濾去酸，再用蒸餾水洗至中性，干燥后保存。還有尿素、葡萄糖培養(yǎng)皿、三角瓶、試管、移液器等常用高壓蒸汽法滅菌，且滅菌后的儀器要放在烘箱烘干，使用時(shí)取出放在超凈工作臺(tái)中，然后打開(kāi)紫外燈和過(guò)濾風(fēng)，滅菌30min.接種環(huán)常用灼燒滅菌，（接種環(huán)的環(huán)部、金屬絲、金屬絲與柄的連接部、連接部的上端）冷卻后使用。玻璃刮刀（涂布器）使用前保存在75%的酒精中，使用時(shí)放在酒精燈火焰上（除去殘留酒精），直到熄滅，冷卻后使用。(5)防止雜菌污染的操作。①操作工具的滅菌②操作在酒精燈火焰旁進(jìn)行，操作中超凈臺(tái)需一直打開(kāi)過(guò)濾風(fēng)(風(fēng)吹向操作者)③棉塞拔出后不能放在超凈臺(tái)消毒過(guò)后的臺(tái)面上，打開(kāi)塞子后和塞上塞子前都要將瓶口或者試管口在酒精燈火焰上灼燒滅菌。④打開(kāi)培養(yǎng)皿的皿蓋的正確操作是打開(kāi)一條縫。

⑤接種前后接種環(huán)都需要灼燒滅菌。

⑥接種間、培養(yǎng)間定期采用紫外線或藥物熏蒸滅菌或消毒，所有使用過(guò)的器皿、廢棄物、培養(yǎng)基都必須先高壓滅菌后再洗滌或傾倒。(5)防止雜菌污染的操作。3．微生物的分離與純化(1)接種：微生物進(jìn)入培養(yǎng)基質(zhì)的過(guò)程，包括自然接種和人為接種。(2)單菌落：固體培養(yǎng)基上通過(guò)接種、培養(yǎng)獲得的由一個(gè)細(xì)胞分裂形成的、肉眼可見(jiàn)的、有一定形態(tài)構(gòu)造的子細(xì)胞集團(tuán)。接種方法（獲得單菌落的方法）：平板劃線法和稀釋涂布平板法(3)平板劃線法與稀釋涂布平板法的比較轉(zhuǎn)移液體用微量移液器（管）4.活動(dòng)

接種、培養(yǎng)并分離酵母菌(1)目的要求①用平板劃線法或稀釋涂布平板法接種酵母菌。②用液體培養(yǎng)基大量擴(kuò)增酵母菌。(2)方法步驟①制作平板：對(duì)兩個(gè)直徑為90mm的培養(yǎng)皿進(jìn)行標(biāo)記（底部或側(cè)面），分別向其中倒入未凝固的固體培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基鋪滿培養(yǎng)皿底部，厚度約2mm。

②接種

用接種環(huán)蘸菌液____次，在固體培養(yǎng)基表面劃線，下一次劃線應(yīng)從上一次劃線的______開(kāi)始。每次劃線前接種環(huán)要

，聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以在劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的

。若共劃線五次，接種環(huán)要燒灼____次。另外：每次劃線都不能與之前的線條_____；不能將最后一次劃線與第一次劃線相連；不能_____培養(yǎng)基。培養(yǎng)基需

后，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。劃破重疊6末端1例題1滅菌單菌落

倒置注意：1.無(wú)論是何種劃線法，蘸取菌種前和劃線后，接種環(huán)都要灼燒滅菌。2.無(wú)論是何種劃線法，菌種只蘸取一次。

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？思考：

操作的第一步灼燒接種環(huán)：是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)：是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到單菌落。劃線結(jié)束后仍灼燒接種環(huán)：能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開(kāi)始劃線？以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開(kāi)始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。菌種的活化：用無(wú)菌水沖洗掉菌苔接種到液體培養(yǎng)基短時(shí)培養(yǎng)。菌落：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基表面形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的具有一定形態(tài)的子細(xì)胞群體。菌苔：多個(gè)同種細(xì)胞群體連成一片。兩者都只有一種微生物。③培養(yǎng)。將所有培養(yǎng)容器置于25℃下培養(yǎng)24h。④觀察培養(yǎng)結(jié)果。獲得單菌落后，可繼續(xù)挑取菌落，利用劃線法接種至斜面培養(yǎng)基中。5．統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的方法(1)稀釋涂布平板法①原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)單菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌，通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。

②計(jì)數(shù)要求：在同一稀釋度下涂布3個(gè)(或3個(gè)以上)平板。統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目要少，因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。③.過(guò)程：稀釋菌液（10-5~10-7倍）涂布培養(yǎng)

用移液器吸取1ml細(xì)菌培養(yǎng)液加入另一個(gè)盛有9ml無(wú)菌水的試管中，混合均勻，以此制成10-1倍的稀釋液，依次方法得到10-5~10-7倍稀釋液。用移液器取0.1ml稀釋度不同的菌液，加在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上。再將涂布器放在酒精燈火焰上灼燒，待冷卻后，在酒精燈旁打開(kāi)培養(yǎng)皿，將菌液涂布到整個(gè)平面上。將培養(yǎng)皿倒置，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24~48h。分離、計(jì)數(shù)微生物——稀釋涂布平板法無(wú)法計(jì)數(shù)1591720無(wú)法計(jì)數(shù)1411310無(wú)法計(jì)數(shù)15011319ml無(wú)菌水加入0.1ml稀釋液（移液器）例：將1g土樣加到盛有99ml無(wú)菌水的三角瓶中，如圖進(jìn)行稀釋，每個(gè)稀釋度涂布三個(gè)平板，根據(jù)結(jié)果計(jì)算1g土樣中菌的數(shù)量？注意：1.分離得到單菌落一般以培養(yǎng)皿中有20個(gè)以內(nèi)菌落為宜。2.計(jì)算微生物數(shù)量一般以培養(yǎng)皿中有30~300個(gè)菌落為宜。（159+141+150）÷3×10×105=1.5×108個(gè)/g

現(xiàn)取5mL陳泡菜汁用于測(cè)定其中的乳酸菌含量,可采取

方法進(jìn)行操作:取0.5mL泡菜汁逐級(jí)稀釋至10-5,取10-4、10-5稀釋液各0.ImL,分別接種到固體培養(yǎng)基,置于特定環(huán)境培養(yǎng)48h后，菌落計(jì)數(shù)。若培養(yǎng)結(jié)果如下圖所示，則5mL陳泡菜汁中乳酸菌約

個(gè).稀釋涂布平板法7x107例2。(2)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法）①原理：利用特定血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定體的樣品中微生物的數(shù)量。②方法：用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。（每個(gè)計(jì)數(shù)板的正中央有兩個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)）玻片中部有四條下凹的槽，將玻片中部分割成三個(gè)平臺(tái)，中央平臺(tái)比兩側(cè)平臺(tái)低0.1mm③顯微鏡下觀察a.大方格：9個(gè)。長(zhǎng)、寬各1mm。液體體積＝1mm2×0.1mm＝0.1mm3。計(jì)數(shù)區(qū)正中間的大方格為紅細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)。四角的四個(gè)大方格是白細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)。b．中方格：紅細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)又用雙線分成25(或16)個(gè)中方格。c．小方格：每個(gè)中方格再用單線劃分為16(或25)個(gè)小方格。④計(jì)數(shù)時(shí)的幾個(gè)注意點(diǎn)先將專用的蓋玻片蓋在計(jì)數(shù)板上，再用吸管在中央平臺(tái)蓋玻片邊緣滴加搖勻（計(jì)數(shù)準(zhǔn)確）的酵母菌懸液，讓菌液滲入蓋玻片下直至充滿計(jì)數(shù)區(qū)。滴加菌液要避免菌液滴到蓋玻片上并防止產(chǎn)生氣泡，以免影響計(jì)數(shù)結(jié)果；對(duì)有25個(gè)中方格的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)可采用“五點(diǎn)取樣”對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)；在計(jì)數(shù)每一小方格中的細(xì)胞數(shù)時(shí)，為了避免重復(fù)計(jì)數(shù)壓在小方格邊緣線上細(xì)胞的數(shù)目，應(yīng)“數(shù)上不數(shù)下”“數(shù)左不數(shù)右”；為了保證結(jié)果的可信度，消除誤差，應(yīng)對(duì)同一紅細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)中的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行3次計(jì)數(shù)后取平均值，再按比例（1個(gè)大格液體體積為0.1mm3，1ml=1000mm3）進(jìn)行換算。小思考：顯微鏡直接計(jì)數(shù)法有什么缺點(diǎn)嗎？【答案】不能區(qū)分死菌和活菌；個(gè)體小的菌體在顯微鏡下難以進(jìn)行觀察。例3：回答下列相關(guān)問(wèn)題。（1）用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)酵母菌計(jì)數(shù)時(shí)，吸取培養(yǎng)液前要輕輕振蕩幾次試管的目的是_________________________________。（2）若計(jì)數(shù)室為1mm×1mm×0.1mm方格，由400個(gè)小方格組成，如果一個(gè)小方格內(nèi)酵母菌過(guò)多,難以計(jì)數(shù),應(yīng)先_______后再計(jì)數(shù)。若多次重復(fù)計(jì)數(shù)后，算得每個(gè)小方格中平均有5個(gè)酵母菌，則10mL該培養(yǎng)液中酵母菌總數(shù)有________個(gè)。計(jì)數(shù)微生物——顯微鏡計(jì)數(shù)法使酵母菌分布均勻，計(jì)數(shù)準(zhǔn)確稀釋2×108影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差分析及改進(jìn)辦法

例題4.紅細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)由25×16=400個(gè)小方格組成,容納液體的總體積為0.1mm3?，F(xiàn)將1mL酵母菌樣品加99mL無(wú)菌水稀釋,用無(wú)菌吸管吸取少許搖勻的酵母菌懸液滴在蓋玻片邊緣,使其自行滲入計(jì)數(shù)區(qū),并用濾紙吸去多余菌液。現(xiàn)觀察到圖中所示a、b、c、d、e5個(gè)中方格內(nèi)共有酵母菌44個(gè),則上述1mL酵母菌樣品中約有菌體(

)A.2.2×108個(gè)

B.2.2×107個(gè)C.2.2×106個(gè)

D.2.2×104個(gè)A思考：測(cè)定谷氨酸棒狀桿菌的數(shù)目可采用的計(jì)數(shù)方法有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法和___________________，前者計(jì)數(shù)的結(jié)果比后者計(jì)數(shù)的結(jié)果值偏______(填“大”或“小”)，原因是稀釋涂布平板法

前者死、活菌體一起計(jì)數(shù)，后者只計(jì)數(shù)活菌數(shù)，且可能有多個(gè)菌體形成同一個(gè)菌落。大6．能分解尿素的微生物的分離與計(jì)數(shù)(1)實(shí)驗(yàn)原理①當(dāng)培養(yǎng)基中只有尿素作為氮源時(shí)，只有能分泌脲酶（分泌蛋白）的微生物才能在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。（還包括固氮菌）②微生物分解尿素產(chǎn)生的氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，若在培養(yǎng)基中加入在酸性情況下呈黃色、堿性情況下呈紅色的酚紅指示劑，就可根據(jù)菌落周圍培養(yǎng)基是否出現(xiàn)紅色區(qū)域，進(jìn)一步鑒定尿素分解菌。

③在相同培養(yǎng)條件下，圓形紅色區(qū)域愈大，表明這種菌利用尿素的能力愈強(qiáng)。（NH2）2C=O+H2O2NH3+CO2脲酶(2)實(shí)驗(yàn)步驟不按照稀釋度由大到小的順序依次操作會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果先取用稀釋度小的溶液，微生物濃度大，再用同一移液器吸取稀釋度大的菌液，就會(huì)提高后者的細(xì)菌數(shù)目，從而導(dǎo)致較大的統(tǒng)計(jì)誤差。

既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。注意事項(xiàng)：(1)尿素固體培養(yǎng)基中瓊脂糖替代瓊脂的原因是：瓊脂是未被純化的混合物，內(nèi)含一定量的含氮化合物，可能為細(xì)菌生長(zhǎng)提供氮源，不利于以尿素為氮源的細(xì)菌的篩選；培養(yǎng)基注意點(diǎn)(2)尿素固體培養(yǎng)基既是選擇培養(yǎng)基也是鑒別培養(yǎng)基的原因是：培養(yǎng)基中尿素作為唯一氮源，則為選擇培養(yǎng)基；培養(yǎng)基中含有酚紅指示劑，則可鑒別篩選出的微生物能分解尿素；(3)培養(yǎng)基中各種物質(zhì)并不都是通過(guò)高壓蒸汽滅菌法進(jìn)行滅菌的，如尿素遇高溫會(huì)分解，所以需進(jìn)行過(guò)濾除菌，然后加入經(jīng)高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基中操作注意點(diǎn)(1)取樣的地點(diǎn)最好選擇尿素含量豐富的區(qū)域，如哺乳動(dòng)物經(jīng)常排泄的區(qū)域；(2)土樣必須用無(wú)菌水進(jìn)行稀釋，否則無(wú)法判斷最后菌種來(lái)源于未滅菌的水還是土壤；(3)每次稀釋前，試管需進(jìn)行充分振蕩處理，目的是使菌體分布均勻，取上清液1ml，轉(zhuǎn)移至盛有99ml無(wú)菌水的試管中（土壤中一般為好氧菌）。結(jié)果分析注意點(diǎn)(1)設(shè)置LB固體培養(yǎng)基的目的是說(shuō)明土壤中存在大量微生物，但能分解尿素的微生物比例低；(2)尿素固體培養(yǎng)基中若形成菌落，無(wú)法說(shuō)明活動(dòng)成功，因?yàn)橛行┕痰苤苯永每諝庵械牡獨(dú)膺M(jìn)行繁殖，最后形成菌落，所以還需觀察菌落周圍是否出現(xiàn)紅色區(qū)域；(3)若培養(yǎng)基中出現(xiàn)5個(gè)帶有紅色區(qū)域的菌落，不能說(shuō)明都是同一種微生物，可能是5種微生物，但都能合成脲酶，分解尿素。

考點(diǎn)二發(fā)酵工程及其應(yīng)用1.傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)與發(fā)酵工程2.發(fā)酵食品的不同風(fēng)味由多種因素造成(1)不同微生物或同種微生物在不同環(huán)境條件下進(jìn)行的代謝活動(dòng)所形成的代謝產(chǎn)物不同，制成的發(fā)酵食品的風(fēng)味也就不同。(2)不同的微生物、不同的菌株能夠分泌的酶種類不同，分解大分子有機(jī)物后形成的產(chǎn)物也就不同。(3)菌株遺傳上的差異會(huì)造成發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味不同。(4)混菌發(fā)酵也影響發(fā)酵食品的風(fēng)味。菌種微生物的種類、代謝特點(diǎn)、種間關(guān)系等都是造成不同發(fā)酵制品風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有差異的原因。3．活動(dòng)：體驗(yàn)傳統(tǒng)發(fā)酵——利用酵母菌、醋酸菌制作果酒和果醋

(1)制作原理與發(fā)酵條件當(dāng)氧氣、糖源都充足時(shí)，醋酸菌將葡萄汁中的糖分解成醋酸，反應(yīng)式：C6H12O6+2O2→2CH3COOH+2CO2+2H2O+能量一是提供部分氧氣促進(jìn)酵母菌的需氧呼吸,進(jìn)而促進(jìn)酵母菌的大量繁殖,提供更多的菌種;二是保證發(fā)酵過(guò)程中不會(huì)有葡萄汁溢出。提高酒精的產(chǎn)量，更多底物，可加速反應(yīng)，便于直觀觀察。（制醋需要足夠的酒精）制作果酒時(shí),哪些措施保證了無(wú)氧條件用凡士林密封吸管與小洞的連接處;吸管的長(zhǎng)臂插入水中阻止氧氣進(jìn)入（2）制作步驟（1）制備裝置：在礦泉水瓶蓋上戳一個(gè)小洞，將可彎折吸管的短臂插入小洞，再用凡士林密封吸管與小洞的連接處。待裝入葡萄、蓋好蓋子后，再將吸管長(zhǎng)臂插入水中阻止氧氣進(jìn)入

（2）處理材料：將葡萄用清水洗凈、晾干后，連皮擠碎后分別放入編號(hào)為1、2的兩個(gè)礦泉水瓶中。所放入的葡萄體積不要超過(guò)礦泉水瓶的1/2。為提高酒精產(chǎn)量可在兩個(gè)礦泉水瓶中適當(dāng)添加白糖制備裝置處理材料思考：1.將吸管的長(zhǎng)臂端插入水中制作果醋時(shí)，為什么要給發(fā)酵好的果酒通入空氣？

2.打洞的位置應(yīng)盡量避免開(kāi)口向上，也不要把洞開(kāi)得過(guò)大？發(fā)酵：(1)將少量干酵母用溫水調(diào)勻后放入1號(hào)礦泉水瓶中，2號(hào)礦泉水瓶中，不加干酵母，其他處理同1號(hào)。蓋好蓋子后，將吸管長(zhǎng)臂插入水中以阻止氧氣進(jìn)入。(2)將兩個(gè)礦泉水瓶放在25℃左右的環(huán)境中發(fā)酵。每天定時(shí)觀察礦泉水瓶?jī)?nèi)葡萄的變化以及吸管長(zhǎng)臂排出氣泡的速度。7~10天后，待不再有氣體產(chǎn)生時(shí)，停止發(fā)酵。用小刀在發(fā)酵液面以上將瓶壁戳一個(gè)小洞，將瓶中的上清液倒入相同編號(hào)的另一干凈礦泉水瓶中，置于冰箱4℃冷藏室中靜置保存，即得到自制的葡萄果酒.(3)選取酒味較重的一瓶，用小刀在礦泉水瓶壁（液面之上）戳一小洞，放置在溫暖的環(huán)境中（

30℃左右）。24h后打開(kāi)瓶蓋就會(huì)聞到果酒在有氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生的果醋的氣味.將空氣通入果酒時(shí)，空氣中的醋酸菌進(jìn)入發(fā)酵液，在有氧條件下將乙醇氧化成醋酸，進(jìn)而制作果醋。這樣既可以減少環(huán)境中其他微生物的進(jìn)入，也可以減少所產(chǎn)生的醋味逸散。特別提醒制作果酒、果醋的注意事項(xiàng)(1)果酒發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的部分CO2會(huì)溶于發(fā)酵液而使發(fā)酵液的pH下降。(2)由于果酒發(fā)酵旺盛期CO2產(chǎn)生量大,因此需及時(shí)排氣,以防止發(fā)酵瓶爆裂。(3)在缺氧、呈酸性的發(fā)酵液中,酵母菌可以生長(zhǎng)繁殖,而絕大多數(shù)其他微生物因無(wú)法適應(yīng)這一環(huán)境而受到抑制。(4)乙醇與酸性條件下的重鉻酸鉀反應(yīng)形成灰綠色,可對(duì)乙醇進(jìn)行檢測(cè);聞味(出現(xiàn)酸味)可判斷是否產(chǎn)生醋酸。(5)當(dāng)氧氣、糖源都充足時(shí),醋酸菌將葡萄中的糖分解成醋酸;當(dāng)缺少糖源時(shí),醋酸菌將乙醇變?yōu)橐胰?再將乙醛變?yōu)榇姿?。制果醋一般不直接利用葡萄糖氧化生成醋?而是借助酒精發(fā)酵的產(chǎn)物進(jìn)行。因?yàn)樵诰凭l(fā)酵過(guò)程中，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等其他有機(jī)物被分解為口味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富的小分子有機(jī)物，使食醋獨(dú)具特色，且發(fā)酵過(guò)程不易遭受雜菌污染原理：泡菜是利用附生在蔬菜表面的植物乳桿菌、短乳桿菌和明串珠菌等發(fā)酵制成的。制作步驟(1)處理材料：將圓白菜、白蘿卜等洗凈，切成3～4cm長(zhǎng)的小塊；將泡菜壇洗凈，用開(kāi)水清洗壇子內(nèi)壁2次，確保沒(méi)有油脂附著在內(nèi)壁上（否則泡菜水會(huì)“生花”長(zhǎng)出白色霉點(diǎn)）。(2)腌制泡菜

①用鹽和冷開(kāi)水配制成6%的鹽水：取6g食鹽，溶于100mL冷開(kāi)水中，按此比例配制成所需體積的鹽水。4.活動(dòng):體驗(yàn)傳統(tǒng)發(fā)酵——利用乳酸菌發(fā)酵制作泡菜

冷開(kāi)水是煮沸后冷卻的水。煮沸有兩大作用,一是除去水中的氧氣,二是殺滅水中的微生物。冷卻是為了防止水溫度過(guò)高殺死蔬菜表面的乳酸菌。②將蔬菜、花椒、八角、白酒等放入壇內(nèi)。白酒作用：抑制泡菜表面雜菌生長(zhǎng)，調(diào)味劑增加醇香③將鹽水加入壇中，沒(méi)過(guò)蔬菜，基本裝滿泡菜壇。④蓋上泡菜壇蓋，用水封住壇口，防止外界空氣進(jìn)入。在腌制過(guò)程中須隨時(shí)加滿水。作用：造成無(wú)氧環(huán)境的方法，這樣，壇內(nèi)可利用蔬菜中天然存在的乳酸菌進(jìn)行乳酸發(fā)酵。如不封閉，則會(huì)有許多需氧腐生菌生長(zhǎng)，蔬菜會(huì)腐爛變質(zhì)。⑤蔬菜在泡菜壇內(nèi)腌制7天左右即可食用。取出腌制好的泡菜后，可以再加入新鮮蔬菜繼續(xù)腌制。陳泡菜汁可以縮短腌制時(shí)間？（發(fā)酵菌）小思考：1.制作泡菜過(guò)程中，鹽的作用是什么？

在制作泡菜過(guò)程中，鹽的作用是調(diào)味和抑制微生物生長(zhǎng)若鹽含量過(guò)低，則易造成細(xì)菌污染。

2.在泡菜腌制過(guò)程中,泡菜壇中冒出氣體說(shuō)明什么?

蔬菜上存在酵母菌,氣泡是酵母菌等微生物進(jìn)行細(xì)胞呼吸產(chǎn)生CO2形成的。核心歸納：1．泡菜制作的注意事項(xiàng)(1)材料的選擇及用量①蔬菜應(yīng)新鮮，若放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，蔬菜中的硝酸鹽易被還原成亞硝酸鹽。（亞硝酸鹽含量低）②用鹽和冷開(kāi)水配制成6%的鹽水。(2)防止雜菌污染：每次取樣用具要洗凈，要迅速封口。(3)氧氣需求①泡菜壇要選擇透氣性差的容器，以創(chuàng)造無(wú)氧環(huán)境，有利于乳酸菌發(fā)酵，防止蔬菜腐爛。②將泡菜壇壇蓋邊沿的水槽內(nèi)注滿水，以保證壇內(nèi)乳酸菌發(fā)酵所需的無(wú)氧環(huán)境，并注意在發(fā)酵過(guò)程中經(jīng)常向水槽中補(bǔ)水(4)控制適宜的溫度：控制在室溫即可，溫度偏高有害菌活動(dòng)能力強(qiáng)，溫度偏低不利于乳酸發(fā)酵。腌制過(guò)程中,要注意控制時(shí)間、溫度和食鹽用量,防止雜菌的大量繁殖和亞硝酸鹽含量過(guò)高（亞硝酸鹽含量的影響因素）(5)泡菜腌制及質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)：成功的關(guān)鍵是營(yíng)造無(wú)氧環(huán)境。檢測(cè)指標(biāo)有乳酸的含量、泡菜的色澤和風(fēng)味，在初期發(fā)酵的末期和中期發(fā)酵階段，泡菜的乳酸含量為0.4%～0.8%，風(fēng)味品質(zhì)最好，因此，常把這個(gè)階段作為泡菜的成熟期。也可以在顯微鏡下觀察乳酸菌形態(tài)，比較不同時(shí)期泡菜壇中乳酸菌的含量。2.泡菜發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌、乳酸和亞硝酸鹽含量的變化項(xiàng)目乳酸菌乳

酸亞硝酸鹽初期少(有氧氣,乳酸菌活動(dòng)受抑制)少增加(硝酸鹽還原菌的作用)中期最多(乳酸抑制其他菌活動(dòng))增多,pH下降下降(硝酸鹽還原菌受抑制,部分亞硝酸鹽被分解)后期減少(乳酸繼續(xù)積累,pH繼續(xù)下降,抑制自身活動(dòng))繼續(xù)增,pH繼續(xù)下降下降至相對(duì)穩(wěn)定(硝酸鹽還原菌被完全抑制)

注意：亞硝酸鹽是硝酸鹽還原菌促進(jìn)硝酸鹽還原形成的，而

不是硝化細(xì)菌氧化氨形成的。據(jù)圖乙分析,泡菜在什么時(shí)間食用比較合適?為什么?乳酸菌、乳酸和亞硝酸鹽的含量變化11

d以后,此時(shí)亞硝酸鹽含量已經(jīng)降到較低的水平。例題5.回答下列有關(guān)泡菜制作的問(wèn)題。(1)制作泡菜時(shí),所用水要煮沸,其目的是

。為了縮短制作時(shí)間,有人還會(huì)在鹽水中加入少量陳泡菜液,加入陳泡菜液的目的是

。

(2)泡菜制作過(guò)程中,乳酸發(fā)酵過(guò)程即乳酸菌進(jìn)行

的過(guò)程。該過(guò)程發(fā)生在乳酸菌的

中。

(3)泡菜制作過(guò)程中影響亞硝酸鹽含量的因素有

、

和

等。

(4)從開(kāi)始制作到泡菜質(zhì)量最佳這段時(shí)間內(nèi),泡菜液逐漸變酸,這段時(shí)間內(nèi)泡菜壇中乳酸菌和其他雜菌的消長(zhǎng)規(guī)律是

,原因是

。

腌制時(shí)間食鹽用量乳酸菌數(shù)量增多,雜菌數(shù)量減少乳酸菌比雜菌更耐酸殺滅水中的微生物并除去水中氧氣增加乳酸菌的數(shù)量厭氧呼吸細(xì)胞溶膠溫度（1）．微生物工業(yè)發(fā)酵的基本過(guò)程滅菌離心5.發(fā)酵工程及其應(yīng)用（2）．選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的菌種是發(fā)酵工業(yè)的前提條件。發(fā)酵工業(yè)菌種需滿足條件：(1)應(yīng)選擇高產(chǎn)的菌種，使菌種的發(fā)酵產(chǎn)物中，需要的產(chǎn)物多，不需要的產(chǎn)物少。(2)培養(yǎng)基來(lái)源充足且廉價(jià)，被轉(zhuǎn)化的效率高。(3)菌種發(fā)酵產(chǎn)物易于分離。(4)菌種對(duì)環(huán)境沒(méi)有明顯或潛在的危害。(5)菌種的遺傳特性和生產(chǎn)能力穩(wěn)定。（3）．發(fā)酵過(guò)程中注意事項(xiàng)（1）菌種的選育：要得到符合要求的菌種，需要篩選并不斷地選育或改良菌種，以保持菌種健壯旺盛的生命力。減少菌種的傳代次數(shù)能減小菌種發(fā)生自發(fā)突變的概率。對(duì)于已出現(xiàn)衰退跡象的菌種要進(jìn)行分離篩選，保留高產(chǎn)的菌株。（2）菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)：將菌種多次擴(kuò)大培養(yǎng)，達(dá)到一定數(shù)量再接種，才能滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需要?？梢钥s短菌種在發(fā)酵罐中發(fā)酵的時(shí)間。（3）控制發(fā)酵過(guò)程：控制發(fā)酵過(guò)程是保證發(fā)酵生產(chǎn)高效順利進(jìn)行的重要措施。監(jiān)控營(yíng)養(yǎng)供給、PH、氧氣、溫度等變化。（PH改變：代謝產(chǎn)物的積累或酸堿物質(zhì)消耗不均等。調(diào)節(jié)和控制培養(yǎng)液pH的方法:在培養(yǎng)基中添加緩沖液,在發(fā)酵過(guò)程中加酸或堿。）培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度及比例都會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)(1)過(guò)高的蔗糖濃度會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)，過(guò)低的蔗糖濃度又不能滿足微生物生長(zhǎng)的需要。(2)在利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時(shí)，培養(yǎng)基中的C/N為4∶1時(shí)菌體大量繁殖，當(dāng)比值降為3∶1時(shí)，菌體繁殖減緩。(3)培養(yǎng)基中不同的N/P也會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)繁殖。冷卻水：下進(jìn)上出使培養(yǎng)基充分接觸空氣，充分冷卻葉輪：使氣泡與發(fā)酵液混合，同時(shí)使微生物細(xì)胞與發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充分接觸。高壓空氣分布器：將無(wú)菌空氣分散成極小的氣泡，使氧從氣泡中進(jìn)入發(fā)酵液，增加溶氧。（4）

環(huán)境不同，同種微生物的代謝產(chǎn)物可能不同。谷氨酸棒狀桿菌在發(fā)酵過(guò)程中要不斷地通入無(wú)菌空氣，并通過(guò)攪拌使空氣形成細(xì)小的氣泡，迅速溶解在培養(yǎng)液中，當(dāng)培養(yǎng)液中的碳氮比為4∶1時(shí)，菌體大量繁殖而產(chǎn)生的谷氨酸少；當(dāng)碳氮比為3∶1時(shí)，菌體繁殖受抑制，但谷氨酸的合成量大增。在無(wú)氧條件下，谷氨酸棒狀桿菌的代謝產(chǎn)物是乳酸或琥珀酸（5）

菌種在不同的發(fā)酵階段要求的環(huán)境條件是不同的。當(dāng)菌種進(jìn)入新鮮的培養(yǎng)基后，細(xì)胞吸收各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，代謝產(chǎn)生維持生命活動(dòng)的氨基酸、核苷酸、多糖、脂類等各種物質(zhì)（初生代謝產(chǎn)物）。這些物質(zhì)的積累與轉(zhuǎn)化使微生物細(xì)胞具備細(xì)胞分裂的能力，使微生物群體進(jìn)入一段快速生長(zhǎng)和繁殖的階段。在微生物生長(zhǎng)到一定的階段后，會(huì)在細(xì)胞代謝的基礎(chǔ)上進(jìn)一步合成一些結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的生物堿、抗生素、毒素等化合物（