溶血性貧血n課件

第九章溶血性貧血學(xué)習要點1溶血性貧血的定義和臨床表現(xiàn)2溶血性貧血的分類、發(fā)病機制、實驗室檢查和過篩試驗3紅細胞膜缺陷疾病的實驗室檢查及應(yīng)用4紅細胞酶缺陷的實驗室檢查及應(yīng)用5血紅蛋白的實驗室檢查及應(yīng)用編輯制作楊曉斌第一節(jié)概述由于某種原因使紅細胞壽命縮短、破壞增加，超過骨髓造血代償能力所致的一類貧血。溶血性貧血若紅細胞壽命縮短、破壞增加，但尚未超過骨髓造血的代償能力時，臨床上不表現(xiàn)貧血代償性溶血性疾病一、溶血性貧血的類型溶血性貧血按溶血的場所分類血管內(nèi)溶血：RBC多在血液循環(huán)中被破壞血管外溶血：RBC多在單核巨噬細胞中被破壞按溶血的急緩分類急性溶血性貧血慢性溶血性貧血按病因和發(fā)病機制分類遺傳性溶血性貧血：多為RBC內(nèi)在缺陷獲得性溶血性貧血：多為RBC外在缺陷二、溶血性貧血的發(fā)病機制紅細胞過早地被破壞可以發(fā)生在血管外或血管內(nèi)。血管外溶血即紅細胞被脾、肝的單核-巨噬細胞系統(tǒng)吞噬后破壞。血管內(nèi)溶血是紅細胞直接在血循環(huán)中破裂，紅細胞的內(nèi)容物血紅蛋白直接被釋放入血漿。二、溶血性貧血的發(fā)病機制紅細胞在單核-巨噬細胞中破環(huán)在血管內(nèi)破環(huán)血管外溶血血管內(nèi)溶血三、溶血性貧血的診斷方法血管內(nèi)溶血和血管外溶血的鑒別特征血管內(nèi)溶血血管外溶血病因獲得性多見遺傳性多見紅細胞主要破壞場所血管內(nèi)單核-吞噬細胞系統(tǒng)病程多為急性常為慢性，急性加重貧血、黃疸常見常見肝、脾大少見常見紅細胞形態(tài)異常正?；蜉p微異常明顯異常紅細胞脆性改變變化小多有改變血漿游離血紅蛋白增加正常或輕度增高高鐵血紅素白蛋白增加正常血紅蛋白尿常見無或輕度尿含鐵血黃素慢性可見一般陰性骨髓再障危象少見急性溶血加重時可見LDH增高輕度增高冷凝集素綜合征（>1：1000）。間接抗人球蛋白（IAGT）操作步驟示意圖1．血象有輕重不等的貧血，隱匿型可表現(xiàn)正常。2．紅細胞懸液制備被檢者和正常人的紅細胞→洗滌3次→配成50%的紅細胞懸液備用。骨髓有核細胞增生，以幼紅細胞增生為主，粒/紅比例倒置，幼紅細胞可呈巨幼樣變，但血清葉酸及維生素B12測定都在正常范圍。本試驗是目前診斷PNH特異性和敏感性最高且可定量的檢測方法。血紅素是鐵原子和原卟啉Ⅸ的復(fù)合物，是含鐵卟啉衍生物，鐵原子位于原卟啉Ⅸ的卟啉環(huán)中心。二、溶血性貧血的發(fā)病機制【溫抗體型AIHA實驗室檢查分析】被檢血清ml0.4．流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)GPI錨連接蛋白（CD55或CD59）低表達的異常細胞群，支持PNH診斷。正常血紅蛋白由兩對珠蛋白肽鏈和4個亞鐵血紅素構(gòu)成的4個亞基組成的四聚體，形狀近似球形的結(jié)合蛋白。人民衛(wèi)生出版社，2006.多為正細胞性貧血，紅細胞大小不均，有異形和碎片，有時可見靶形紅細胞，網(wǎng)織紅細胞增高。二、溶血性貧血的發(fā)病機制85的甘油緩沖液中比正常紅細胞溶解速度快，導(dǎo)致紅細胞懸液的吸光度降至50%的時間（AGLT50）明顯縮短。G-6-PD-CNSHAHbE病是出現(xiàn)血紅蛋白E的常染色體不完全顯性遺傳性血紅蛋白病，為我國最常見的血紅蛋白病。直接抗人球蛋白試驗陽性，主要為抗IgG型；冷凝集素綜合征是冷誘導(dǎo)因素導(dǎo)致的冷凝集素IgM抗體引起的自身免疫性慢性溶血性貧血和微循環(huán)阻塞為特征的一組疾病，又叫“冷血凝集素病”。部位溶血性貧血疾病名稱篩選/排除試驗確診試驗血管外溶血遺傳性球形紅細胞增多癥紅細胞形態(tài)檢查高滲冷溶血試驗遺傳性橢圓形紅細胞增多癥滲透脆性試驗、酸化甘油溶血試驗?zāi)さ鞍纂娪痉治觥⒛ぶ|(zhì)分析遺傳性口形紅細胞增多癥自身溶血試驗、紅細胞腺苷三磷酸活性、Coombs試驗?zāi)さ鞍谆蚍治觥⒓蚁嫡{(diào)查G-6-PD-CNSHA高鐵血紅蛋白還原試驗、G-6-PD熒光斑點試驗、硝基四氮唑藍試驗、Heinz小體生成試驗紅細胞G-6-PD活性測定基因分析丙酮酸激酶缺乏癥

紅細胞形態(tài)檢查、PK熒光斑點試驗PK活性定量測定嘧啶-核苷酶缺乏癥紅細胞形態(tài)檢查、Ret、嘧啶核苷酸比率中間代謝產(chǎn)物測定、嘧啶-核苷酶活性測定珠蛋白生成障礙性貧血、血紅蛋白病紅細胞形態(tài)檢查、紅細胞包涵體試驗、異丙醇沉淀試驗、熱變性試驗、Heinz小體生成試驗紅細胞鐮變試驗、血紅蛋白電泳、珠蛋白肽鏈分析、基因分析、吸收光譜測定溫抗體型自身免疫性溶貧紅細胞形態(tài)檢查Coombs試驗冷凝集素綜合征紅細胞形態(tài)檢查、Coombs試驗冷凝集素試驗藥物致免疫性溶血性貧血紅細胞形態(tài)檢查、Coombs試驗加藥后IAGT新生兒同種免疫性溶血癥紅細胞形態(tài)檢查、Ret、膽紅素代謝檢查、血型鑒定Coombs試驗、孕婦產(chǎn)前免疫性抗體檢查遲發(fā)性溶血性輸血反應(yīng)紅細胞形態(tài)檢查、Ret、血型鑒定

Coombs試驗、凝聚胺試驗血管內(nèi)溶血PNHRous試驗、尿隱血試驗、蔗糖溶血試驗Ham試驗、蛇毒溶血因子試驗、補體敏感性試驗蠶豆病高鐵血紅蛋白還原試驗、G-6-PD熒光斑點試驗、硝基四氮唑藍試驗、Heinz小體生成試驗紅細胞G-6-PD活性測定、基因分析陣發(fā)性冷性血紅蛋白尿癥Rous試驗、Coombs試驗冷熱溶血試驗藥物致免疫性溶血性貧血Coombs試驗IAGT及加藥后的IAGT急發(fā)性溶血性輸血反應(yīng)Coombs試驗血型鑒定及不同方法的交叉配血試驗微血管病性溶血性貧血紅細胞形態(tài)檢查、Ret、血小板計數(shù)、血漿游離血紅蛋白測定等止血與血栓實驗室檢查及其他相關(guān)檢查不同類型溶血性貧血試驗選擇四、溶血性貧血的過篩試驗常用的溶血性貧血的過篩試驗游離血紅蛋白血清結(jié)合珠蛋白尿含鐵血黃素高鐵血紅素蛋白以鑒別溶血的部位是血管內(nèi)溶血還是血管外溶血？（一）血漿游離血紅蛋白測定常用鄰-甲苯胺法檢測，血紅蛋白結(jié)構(gòu)中的亞鐵血紅素有類似過氧化物酶的作用，催化過氧化氫釋放新生態(tài)氧，使無色的鄰-聯(lián)甲苯胺氧化為藍色。根據(jù)顯色深淺，即可測出血漿游離血紅蛋白的量。血紅蛋白結(jié)構(gòu)中的亞鐵血紅素有類似過氧化物酶的作用H2O2新生態(tài)O無色的鄰-聯(lián)甲苯胺氧化為藍色【參考區(qū)間】0～40mg/L【應(yīng)用評價】正常情況，血漿中血紅蛋白大部分與結(jié)合珠蛋白結(jié)合，僅有微量游離血紅蛋白。測定血漿游離血紅蛋白可判斷紅細胞的破壞程度。增高是判斷血管內(nèi)溶血的指征。蠶豆病、PNH、陣發(fā)性寒冷性血紅蛋白尿、冷凝集素綜合征、溶血性輸血反應(yīng)等明顯增高；自身免疫性溶血性貧血、珠蛋白生成障礙性貧血可輕到中度增高。不增高血管外溶血、紅細胞膜缺陷不增高。（一）血漿游離血紅蛋白測定（二）血清結(jié)合珠蛋白測定結(jié)合珠蛋白（Hp）是由肝臟合成的一種α2糖蛋白，合成速度較慢；Hp具有結(jié)合游離血紅蛋白的能力，在血紅蛋白降解為膽紅素的代謝過程中具有重要的作用，在此過程中Hp本身也被分解，溶血性貧血時Hp因消耗而降低。用醋酸纖維薄膜電泳法檢測，由于Hp具有結(jié)合游離血紅蛋白的能力，故在測定血清Hp時，于待測血清中加入一定量的血紅蛋白液，使之與待測血清中的Hp形成Hp-Hb復(fù)合物；再通過電泳法將結(jié)合的Hp-Hb復(fù)合物與未結(jié)合的Hb分開，測定Hp-Hb復(fù)合物的量，可測得血清中Hp的含量。【參考區(qū)間】0.5～1.5gHb/L【應(yīng)用評價】正常情況下，血漿中的血紅蛋白與結(jié)合珠蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，在單核-巨噬細胞系統(tǒng)和肝內(nèi)清除。溶血時血漿中的血紅蛋白與Hp結(jié)合增多，使血清中結(jié)合珠蛋白減少，測定血清中結(jié)合珠蛋白的含量可反映溶血的情況。減低常見于各種溶血，尤其是血管內(nèi)溶血。但嚴重肝病、先天性無珠蛋白血癥、傳染性單核細胞增多癥等Hp也明顯減低，故注意鑒別增高常見于感染、創(chuàng)傷、SLE、惡性腫瘤、類固醇治療、妊娠、膽道阻塞等（Hp為急性時相反應(yīng)蛋白）。此時如Hp正常，不能排除合并溶血的可能。（二）血清結(jié)合珠蛋白測定（三）尿含鐵血黃素試驗當游離血紅蛋白在血液中增多時，血紅蛋白通過腎臟濾過形成血紅蛋白尿；在此過程中，血紅蛋白被腎小管上皮細胞部分或全部吸收，部分鐵離子以含鐵血黃素的形式沉積于上皮細胞，并隨尿液排出?！緟⒖紖^(qū)間】正常人為陰性含鐵血黃素是不穩(wěn)定的鐵蛋白聚合體，為含鐵質(zhì)的棕色色素，其中的高鐵離子與亞鐵氰化鉀作用，在酸性環(huán)境下產(chǎn)生藍色的亞鐵氰化鐵沉淀，此反應(yīng)稱為普魯士藍反應(yīng)。用顯微鏡檢查尿沉渣，細胞內(nèi)外可見直徑1～3μｍ的藍色顆粒。【應(yīng)用評價】尿含鐵血黃素試驗陽性提示慢性血管內(nèi)溶血。無論有無血紅蛋白尿，只要存在慢性血管內(nèi)溶血如PNH，本試驗即呈陽性，并可持續(xù)數(shù)周。但在溶血初期，雖然有血紅蛋白尿，上皮細胞內(nèi)尚未形成可檢出的含鐵血黃素，此時本試驗可呈陰性反應(yīng)。（三）尿含鐵血黃素試驗血紅蛋白與Hp結(jié)合成Hb-Hp肝臟降解清除過剩的Hb珠蛋白血紅素與白蛋白結(jié)合與血紅素結(jié)合蛋白結(jié)合高鐵血紅素與血紅蛋白結(jié)合Hb消耗完后與白蛋白結(jié)合高鐵血紅素白蛋白與硫化銨形成銨血色原比色測定血紅蛋白尿【參考區(qū)間】正常人呈陰性（四）高鐵血紅素白蛋白試驗【應(yīng)用評價】血管內(nèi)溶血時，血漿中游離血紅蛋白大量增加，血漿中可檢測出高鐵血紅素白蛋白。只有在嚴重溶血時，Hp與Hx均被耗盡，高鐵血紅素方與白蛋白結(jié)合成高鐵血紅素白蛋白；故血清中出現(xiàn)高鐵血紅素白蛋白是溶血嚴重的指標。（四）高鐵血紅素白蛋白試驗第二節(jié)紅細胞膜缺陷檢查及其應(yīng)用紅細胞攜帶氧氣和二氧化碳，為體內(nèi)重要的氣體交換單元。膜的功能有：細胞變形性能，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)離子平衡，維持細胞容積，穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境紅細胞和韌性和變形能力，對正常的微循環(huán)血流有重要的作用。紅細胞膜參與細胞運輸、信息傳遞、血型抗原、免疫反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)及出、凝血調(diào)節(jié)等反應(yīng)。紅細胞直徑為6～9μm，呈雙層凹面的圓盤狀2．α珠蛋白生成障礙性貧血鈣-ATP酶受抑制，鈣沉積膜上，膜的柔韌性降低利用此實驗可對高發(fā)區(qū)域人群或疑診的新生兒進行篩查。當G-6-PD缺乏癥時，由于NADPH生成減少或缺乏，高鐵血紅蛋白不被還原或還原速度減慢，高鐵血紅蛋白還原率下降。在孵育時，加入葡萄糖和ATP作為糾正物，觀察溶血可否有一定的糾正，稱為糾正試驗。（一）珠蛋白生成障礙性貧血Rous試驗、尿隱血試驗、蔗糖溶血試驗中間代謝產(chǎn)物測定、嘧啶-核苷酶活性測定PNH患者因紅細胞膜有缺陷而對補體敏感合成：65%合成于有核紅細胞期，35%合成于網(wǎng)織紅細胞期正常人高鐵血紅蛋白還原率≥75%（臍帶血≥77%）。某些血紅蛋白病骨架蛋白等可明顯異常。3．G-6-PD活性正常時，紅細胞通過磷酸戊糖旁路形成NADPH使MHb還原成亞鐵血紅蛋白，因而含變性珠蛋白小體的紅細胞減少，而G-6-PD活性減低時，NADPH減少，MHb增多，導(dǎo)致含變性珠蛋白小體的紅細胞增多，不穩(wěn)定血紅蛋白由于血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，穩(wěn)定性減低易被氧化，含變性珠蛋白小體的紅細胞可增多，伯氨喹啉型溶血性貧血，含變性珠蛋白小體的紅細胞也可增多。2．HbA2增多，見于β珠蛋白生成障礙性貧血，為雜合子的重要實驗室診斷指標。2．變性珠蛋白小體，主要是α、β珠蛋白鏈的病變而引起的溶解度和穩(wěn)定性降低所致；NADPH的吸收峰在波長340nm處，可通過單位時間生成的NADPH的量來測定G-6-PD活性。紅細胞對低滲的抵抗能力與其表面積與容積的比值有關(guān)，比值小，說明紅細胞容積已脹大，對低滲抵抗力小，滲透脆性增加；【參考區(qū)間】正常血片含HbF的著色紅細胞<0.出現(xiàn)細胞膜對自身補體（C3）敏感性增高的異常紅細胞，引起慢性血管內(nèi)溶血。實驗室檢查酸化血清溶血試驗（Ham試驗）為陽性。一、概述低滲溶液中，血紅蛋白逸出，紅細胞殘留的完整的紅細胞膜，稱為影細胞紅細胞膜蛋白質(zhì)占49.3％、脂質(zhì)42％、糖類8％蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的比例約為1:1；比值變化與膜的功能相關(guān)，兩者在很大程度上決定著膜的理化特征任何原因引起的溶血都必然有紅細胞膜的缺陷或損傷紅細胞膜膜蛋白膜脂質(zhì)膜糖類與膜脂質(zhì)形成糖脂與膜蛋白形成糖蛋白糖鏈裸露膜外，有受體、抗原性、信息傳遞功能，稱之細胞天線磷脂糖脂膽固醇甘油磷脂鞘磷脂膽固醇脂游離膽固醇鞘糖脂與膜脂質(zhì)形成脂蛋白與糖類形成糖蛋白外周蛋白內(nèi)在蛋白膽固醇/磷脂（C/P）比值約為0.8～1.0一、概述紅細胞膜為脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)鑲嵌在脂質(zhì)雙層內(nèi)又相互連續(xù)形成膜的骨架。電鏡下觀察紅細胞膜呈三層暗-亮-暗區(qū)帶，外層含糖脂、糖蛋白和蛋白質(zhì)，具親和水性；中間層含磷脂、膽固醇、蛋白質(zhì)為疏水性；內(nèi)層主要包含蛋白質(zhì)，呈親水性。紅細胞膜結(jié)構(gòu)液態(tài)鑲嵌模型帶3帶4.2錨蛋白α膜收縮蛋白β膜收縮蛋白肌動蛋白帶4.1血型蛋白C膜脂質(zhì)雙層紅細胞膜結(jié)構(gòu)的兩個基本的特征膜的不對稱性膜的流動性膜的內(nèi)外兩層的組分和功能有明顯的差異，稱為膜的不對稱性紅細胞膜結(jié)構(gòu)紅細胞膜的功能運輸物質(zhì)變形性免疫功能抗原性血型抗原老化抗原影響變形性因素：①膜骨架蛋白組分和功能狀態(tài)②膜脂質(zhì)流動性大有利于變形③細胞表面積與體積比值④血紅蛋白的質(zhì)和量⑤膜的離子通透性二、實驗室檢查紅細胞滲透脆性試驗紅細胞膜蛋白電泳分析血細胞表型分析紅細胞孵育滲透脆性試驗酸化血清溶血試驗蔗糖溶血試驗紅細胞自身溶血試驗及其糾正試驗常見實驗室檢查酸化甘油溶血試驗（一）紅細胞滲透脆性試驗紅細胞在不同濃度的低滲鹽溶液中，水分通過紅細胞膜進入細胞內(nèi)，當水滲透達一定程度時，紅細胞發(fā)生膨脹破裂。根據(jù)不同濃度的低滲鹽溶液中紅細胞溶血的情況，反映紅細胞對低滲鹽溶液的抵抗能力。低滲鹽低滲鹽紅細胞對低滲的抵抗能力與其表面積與容積的比值有關(guān)，比值小，說明紅細胞容積已脹大，對低滲抵抗力小，滲透脆性增加；反之抵抗力增大，滲透脆性降低?！緟⒖紖^(qū)間】簡易半定量法：開始溶血：3.8～4.6g/L完全溶血：2.8～3.2g/L增加主要見遺傳性球形紅細胞增多癥、橢圓形紅細胞增多癥和部分自身免疫性溶血性貧血。降低主要見于珠蛋白生成障礙性貧血、血紅蛋白C、D、E病，低色素性貧血、阻塞性黃膽、脾切除術(shù)后等。（一）紅細胞滲透脆性試驗（二）紅細胞孵育滲透脆性試驗血液置于37℃溫箱孵育24h葡萄糖的消耗，貯備的ATP減少膜對陽離子的主動傳遞受阻，Na在紅細胞內(nèi)聚集紅細胞膨脹，孵育滲透脆性增加正常人的紅細胞經(jīng)孵育處理后，其滲透脆性變化不明顯，而有細胞膜缺陷或某些酶缺陷的紅細胞，由于其內(nèi)的葡萄糖和ATP很快被消耗，孵育后脆性明顯增加?！緟⒖紖^(qū)間】未孵育50%溶血：4.00～4.45gNaCL/L；37℃孵育24h50%溶血：4.65～5.90gNaCL/L增加見于輕型遺傳性紅細胞增多癥，遺傳性非球形紅細胞溶血性貧血。降低見于珠蛋白生成障礙性貧血、缺鐵性貧血、鐮狀細胞性貧血、脾切除手術(shù)后。本試驗用于輕型遺傳性紅細胞增多癥，遺傳性非球形紅細胞溶血性貧血的診斷和鑒別診斷。（二）紅細胞孵育滲透脆性試驗抗IgG血清2滴抗IgG血清2滴抗IgG血清2滴生理鹽水2滴【免疫復(fù)合型實驗室檢查】根據(jù)不同的血紅蛋白帶有不同的電荷，等電點不同，在一定的pH緩沖液中，緩沖液的pH大于Hb的等電點時其帶負電荷，電泳時在電場中向陽極泳動；【參考區(qū)間】成人<2%，新生兒<40%（2）PNH-再障：指原有肯定的PNH（而非下述的第4類），轉(zhuǎn)為明確的再障，PNH的表現(xiàn)已不明顯。G-6-PD缺陷者的熒光很弱或無熒光；本病的特征是血片中出現(xiàn)較多的口形紅細胞，有輕重不一的溶血陽性家族史。再障-PNH綜合癥再分為四種情況：PK基因缺陷，常染色體隱性遺傳，僅次于G-6-PD缺陷癥遺傳性球形紅細胞增多癥在G-6-PD和NADP+存在下，G-6-PD能使NADP+還原成NADPH，后者在紫外線照射下會發(fā)出熒光。紅細胞酶缺陷是指參與紅細胞代謝（主要是糖代謝）的酶由于基因突變導(dǎo)致的酶活性或性質(zhì)改變所引起的溶血及（或）其他表現(xiàn)的疾病。所用紅細胞必須洗滌，未洗滌紅細胞不能用于本試驗。59）U/gHb（37℃）（ICSH推薦的Glock與McLean法）紅細胞、血紅蛋白低于正常值。遺傳性橢圓形紅細胞增多癥骨髓象骨髓增生活躍，幼紅細胞增生顯著。溫抗體型AIHA，是由于抗體附著在紅細胞表面，導(dǎo)致紅細胞呈球形，故應(yīng)注意與遺傳性球形紅細胞增多癥(HS)相鑒別，HS可有陽性家族史，但無抗自身紅細胞的溫抗體。自身免疫性溶血性貧血②雜合子形式，即紅細胞鐮狀細胞性狀；根據(jù)顯色深淺，即可測出血漿游離血紅蛋白的量?！綪CH的鑒別診斷】使對補體敏感的紅細胞膜造成缺損，紅細胞溶解破損370C水浴1h→離心棄去上清液→洗滌3次→分別配成5%紅細胞懸液。試管號123456…1617紅細胞酶缺陷是指參與紅細胞代謝（主要是糖代謝）的酶由于基因突變導(dǎo)致的酶活性或性質(zhì)改變所引起的溶血及（或）其他表現(xiàn)的疾病。干細胞型又稱干細胞增多癥或脫水型細胞增多癥，由于細胞脫水致紅細胞邊緣皺褶或不規(guī)則，有時可呈靶形；正常人各管均為陰性，無溶血。出現(xiàn)細胞膜對自身補體（C3）敏感性增高的異常紅細胞，引起慢性血管內(nèi)溶血。根據(jù)顯色深淺，即可測出血漿游離血紅蛋白的量。某些病毒感染可陽性，但此時的PCH一般是短暫的。注意與自身免疫性溶血性貧血所致繼發(fā)性球形紅細胞增多癥相鑒別，后者Coombs（+）。直接抗人球蛋白（DAGT）結(jié)果觀察示意圖注：表中“→”表示混勻后并吸出液體ml數(shù)；在單核-巨噬細胞中破環(huán)遺傳性球形紅細胞增多癥的紅細胞膜脂質(zhì)減少，表面積/體積的比值降低、細胞球形化，膜蛋白及膜脂質(zhì)有缺陷紅細胞鐮變試驗、血紅蛋白電泳、珠蛋白肽鏈分析、基因分析、吸收光譜測定溫抗體型AIHA外周血象紅細胞事先要經(jīng)酶處理，才能引起凝集或溶血反應(yīng)成熟紅細胞內(nèi)的主要蛋白質(zhì)是血紅蛋白（Hb），占細胞干重的96%，占細胞容積的35%。是一組由于紅細胞膜蛋白異常引起的異質(zhì)性家族遺傳性溶血病，其共同特點是外周血中存在大量的橢圓形成熟紅細胞。遺傳性球形紅細胞增多癥（三）紅細胞自身溶血試驗

及其糾正試驗血液置于37℃溫箱孵育24h葡萄糖的消耗，貯備的ATP減少膜對陽離子的主動傳遞受阻，Na在紅細胞內(nèi)聚集紅細胞膨脹，孵育滲透脆性增加在孵育時，加入葡萄糖和ATP作為糾正物，觀察溶血可否有一定的糾正，稱為糾正試驗?！緟⒖紖^(qū)間】正常人紅細胞孵育48小時，不加糾正物的溶血率<4.0%，加葡萄糖的溶血率<1.0%，加ATP糾正物的溶血率<0.8%。1遺傳性球形紅細胞增多癥自身溶血率增加，能被葡萄糖或ATP糾正。2G-6-PD缺乏癥等戊糖旁路代謝缺陷的病人自身溶血率增加，能被葡萄糖糾正。3丙酮酸激酶缺乏癥時不能利用葡萄糖產(chǎn)生ATP，溶血率增加，不能被葡萄糖糾正，能被ATP可糾正。4獲得性溶血性貧血或自身免疫性溶血性貧血時試驗結(jié)果常各有不同，對診斷意義不大。5本試驗不夠敏感和特異，僅對遺傳性球形紅細胞增多癥有較大診斷價值，其他多僅作為篩選試驗。6Daice認為第Ⅰ型自身溶血僅輕度增高，加葡萄糖后糾正；第Ⅱ型自身溶血顯著增高，加葡萄糖不能糾正，但加ATP后可以糾正，說明其ATP生成障礙，而其實質(zhì)是PK缺乏。應(yīng)用評價（三）紅細胞自身溶血試驗

及其糾正試驗（四）酸化甘油溶血試驗遺傳性球形紅細胞增多癥的紅細胞膜脂質(zhì)減少，表面積/體積的比值降低、細胞球形化，膜蛋白及膜脂質(zhì)有缺陷當甘油存在于低滲溶液時，可阻止低滲溶液中的水快速進入紅細胞內(nèi)，減慢溶血過程。但甘油與膜脂質(zhì)又有親和性，可使膜脂質(zhì)逐步溶解而減少。它們在pH6.85的甘油緩沖液中比正常紅細胞溶解速度快，導(dǎo)致紅細胞懸液的吸光度降至50%的時間（AGLT50）明顯縮短?！緟⒖紖^(qū)間】正常人AGLT50>290s【應(yīng)用評價】遺傳性球形紅細胞增多癥AGLT50明顯縮短（15~25s）。自身免疫性溶血性貧血、腎功能衰竭、妊娠等AGLT50也可縮短。（五）酸化血清溶血試驗正常人的血清，在pH6.4～pH6.6條件下酸化，補體被激活PNH患者體內(nèi)存在對補體敏感的紅細胞，在此條件下發(fā)生溶血。而正常人的紅細胞不被溶解。將血清加熱56℃30min滅活補體后，血清失去溶血作用。本實驗是PNH的確證實驗；其假陽性和假陰性較少見，但如患者多次輸血而使其補體敏感紅細胞相對減少時，可呈弱陽性或陰性。某些自身免疫性溶血性貧血患者溶血發(fā)作嚴重時也偶呈陽性，此時，如果血清加熱破壞補體后，試驗結(jié)果由陽性轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮裕敲锤С諴NH的診斷。（六）蔗糖溶血試驗PNH患者因紅細胞膜有缺陷而對補體敏感在離低子強度的蔗糖溶液中，補體與細胞膜的結(jié)合加強使對補體敏感的紅細胞膜造成缺損，紅細胞溶解破損【參考區(qū)間】正常人為陰性【應(yīng)用評價】本試驗比酸溶血試驗敏感，但特異性較差，是PNH簡易過篩試驗。再生障礙性貧血、巨幼紅細胞性貧血和自身免疫性溶血性貧血患者也可出現(xiàn)陽性，故必要時需做酸化血清溶血試驗加以鑒別。（七）血細胞表型分析血細胞表型分析PNH是一種獲得性基因突變導(dǎo)致的克隆性疾病，其異常的血細胞膜糖化肌醇磷脂－錨（GPI-anchor）連接蛋白如CD59,CD55等表達明顯減低或缺乏，細胞膜對補體的敏感性增強而引起溶血性貧血。用GPI連接蛋白如CD59的單克隆抗體作分子探針，流式細胞術(shù)分析紅細胞和白細胞膜CD59等分子的表達量和計數(shù)其缺乏表達（陰性）細胞的數(shù)量。【參考范圍】PNH診斷的臨界值：CD59陰性的紅細胞大于5%和CD59陰性的中性粒細胞大于10%，非PNH者均小于5%；PNH患者CD59陰性的紅細胞大于9%，多數(shù)患者大于20%；CD59陰性的中性粒細胞均大于16%?！緫?yīng)用評價】該實驗的靈敏度和特異性可達100％，而Ham實驗的靈敏度為50％左右，但實驗需要的流式細胞儀其價格比較貴，實驗價格也較高。（八）紅細胞膜蛋白電泳分析將制備的紅細胞膜樣品進行SDS電泳，根據(jù)樣品中各種蛋白相對分子質(zhì)量的不同，分離得到紅細胞膜蛋白的電泳圖譜，從而可見各膜蛋白組分百分率。紅細胞各種膜蛋白組分百分率變化較大，與正常紅細胞膜蛋白電泳圖譜作比較?；蛞詭?蛋白為基準，各膜蛋白含量與帶3蛋白的比例表示。許多先天性和后天性溶血性貧血都伴有紅細胞膜蛋白異常，各種膜缺陷疾病如遺傳球形紅細胞增多癥有收縮蛋白等含量減低或結(jié)構(gòu)異常。某些血紅蛋白病骨架蛋白等可明顯異常。三、紅細胞膜缺陷檢查的應(yīng)用紅細胞膜缺陷原發(fā)性先天性遺傳性球形細胞增多癥遺傳性橢圓形紅細胞增多癥遺傳性口形紅細胞增多癥后天獲得性繼發(fā)性紅細胞酶或血紅蛋白缺陷外在因素影響（一）遺傳性球形紅細胞增多癥遺傳性球形紅細胞增多癥是一種紅細胞膜蛋白結(jié)構(gòu)異常所致的遺傳性溶血病，其特點是外周血中出現(xiàn)較多小球形紅細胞。多呈常染色體顯性遺傳，少數(shù)呈常染色體隱性遺傳的HS常合并新的基因突變而發(fā)病，研究顯示HS有第8號染色體短臂缺失。貧血、黃疸和脾腫大，是最常見的臨床表現(xiàn)紅細胞膜收縮蛋白自身聚合位點及其結(jié)構(gòu)的區(qū)域異常膜結(jié)構(gòu)與功能的異常鈉泵功能亢進，鈉、水進入細胞增多紅細胞呈球形紅細胞內(nèi)的ATP相對缺乏鈣-ATP酶受抑制，鈣沉積膜上，膜的柔韌性降低該紅細胞通過脾臟被截留，于巨噬細胞內(nèi)破壞破壞不能被機體代償時出現(xiàn)溶血性貧血實驗室檢查遺傳性球形紅細胞增多癥1．血象血紅蛋白和紅細胞量多為正常或輕度降低，血片中出現(xiàn)小球形紅細胞為本病的血液形態(tài)學(xué)特征；網(wǎng)織紅細胞增加，一般為5%～10%，急性溶血發(fā)作時可高60%～70%。嗜多色性紅細胞增多，外周血中可出現(xiàn)少數(shù)幼稚紅細胞。2．骨髓象紅細胞增生旺盛，粒紅比值降低，紅細胞系以中、晚幼紅細胞為主，可占有核細胞的25%～60%；當發(fā)生再障危象時，骨髓中紅細胞系再生低下，有核紅細胞減少。3．滲透脆性試驗HS紅細胞滲透脆性增高4．紅細胞膜電泳分析SDS電泳可得到紅細胞膜蛋白各組分的百分率，80%的患者可發(fā)現(xiàn)異常。5．紅細胞膜蛋白定量測定絕大多數(shù)HS有一種或多種膜蛋白缺乏6．分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用球形紅細胞較正常紅細胞小、厚，且深染，大小比較均一，直徑變?。?.2～7.0μm），厚度增加（2.2～3.4μm），染色后細胞中央淡染區(qū)消失，小球形紅細胞所占的比例在不同的患者中差別較大，多數(shù)患者在10%以上（正常人多<5%）。診斷和鑒別診斷HS無特異的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查，診斷時應(yīng)結(jié)合病史、臨床表現(xiàn)和實驗室檢查綜合分析。血涂片中小球形細胞大于10%，紅細胞滲脆性增加，有陽性的家族史，本病的診斷可成立。注意與自身免疫性溶血性貧血所致繼發(fā)性球形紅細胞增多癥相鑒別，后者Coombs（+）。對Coombs試驗多次陰性者，應(yīng)作紅細胞膜蛋白分析和組分定量，必要時采用基因序列分析的方法，尋找診斷依據(jù)和進行家系調(diào)查以鑒別診斷。（二）遺傳性橢圓形紅細胞增多癥是一組由于紅細胞膜蛋白異常引起的異質(zhì)性家族遺傳性溶血病，其共同特點是外周血中存在大量的橢圓形成熟紅細胞。HE大多為常染色體顯性遺傳，極少數(shù)為常染色體隱性遺傳。定義本病的原發(fā)病變是膜骨架蛋白異常，其膜收縮蛋白結(jié)構(gòu)有缺陷，膜骨架穩(wěn)定性降低。HE的紅細胞在骨髓釋放入血液循環(huán)后由于膜骨架蛋白的缺陷，在通過微循環(huán)時由于切變力的作用變成橢圓形后不能恢復(fù)正常，同時，紅細胞由于膜骨架穩(wěn)定性的降低容易破壞，大多數(shù)橢圓形紅細胞在脾臟被破壞。診斷和鑒別診斷遺傳性橢圓形紅細胞增多癥1．血象有輕重不等的貧血，隱匿型可表現(xiàn)正常。血片中橢圓形紅細胞的比例大于25%。其形狀呈橢圓形、卵圓形、棒狀或臘腸形，橢圓形紅細胞橫徑與縱徑之比小于0.78，硬度增加，中心淡染區(qū)消失。2．骨髓象骨髓紅細胞系統(tǒng)增生活躍為增生性貧血骨髓象。3．紅細胞滲透脆性試驗紅細胞滲透脆性試驗和自身溶血試驗多增高。4．紅細胞膜蛋白電泳分析及低離子強度非變性凝膠電泳膜收縮蛋白分析其異常結(jié)果有助于膜分子病變的確定。5．分子生物學(xué)方法檢測某些膜蛋白基因突變。依據(jù)臨床表現(xiàn)、家族調(diào)查和相關(guān)實驗室檢查多數(shù)病例可確診，無陽性家族史時若橢圓形紅細胞大于50%也可明確診斷。本病應(yīng)與缺鐵性貧血、巨幼細胞貧血、骨髓纖維化、骨髓病性貧血、骨髓增生異常綜合征、珠蛋白生成障礙性貧血等鑒別。（三）遺傳性口形紅細胞增多癥是一種罕見的常染色體顯性遺傳性慢性溶血性貧血。本病的特征是血片中出現(xiàn)較多的口形紅細胞，有輕重不一的溶血陽性家族史。HST不是單一的疾病，而是發(fā)病機制、紅細胞形態(tài)和臨床表現(xiàn)都不同的一組綜合征。定義在口形細胞中，鈉離子濃度增高，鉀離子濃度減低，從而使離子泵的負荷增至6~10倍，但仍不足以代償鈉鉀的失衡狀態(tài)，導(dǎo)致細胞水腫、腫脹，體積增大，紅細胞脆性增高。根據(jù)口形紅細胞內(nèi)鈉、鉀離子和陽離子總量的多少水腫細胞型又稱水腫細胞增多癥，其細胞內(nèi)鈉、鉀離子和陽離子總量明顯增多，致水分進入細胞內(nèi)，使紅細胞腫脹表現(xiàn)為口形；此型細胞滲透脆性增加，變形能力減弱，在脾扣留被巨噬細胞吞噬破壞。干細胞型又稱干細胞增多癥或脫水型細胞增多癥，由于細胞脫水致紅細胞邊緣皺褶或不規(guī)則，有時可呈靶形；此種細胞變形能力降低，紅細胞滲透脆性降低，主要在單核-巨噬細胞系統(tǒng)內(nèi)破壞。其他細胞型診斷和鑒別診斷遺傳性口形紅細胞增多癥血片中口形紅細胞增多，可達10%~50%。口形紅細胞中心蒼白區(qū)呈狹窄的裂縫，裂縫的中央較兩端更為狹窄，縫的邊緣清楚，類似微張的魚口；而在濕血片中，紅細胞雙凹面消失而呈單面凹，形似碗狀。正常人外周血中也可見到少量口形細胞，一般為小于4%。貧血一般輕微，血紅蛋白很少低于80g/L，多數(shù)患者網(wǎng)織紅細胞增多，約10％~20％；紅細胞滲透脆性試驗增高，也可正?；蚪档?；自身溶血可呈陽性，可被葡萄糖或ATP部分糾正。依據(jù)臨床表現(xiàn)、外周血口形紅細胞增多和家族史一般可作出診斷。但需要與繼發(fā)性口形紅細胞增多癥相鑒別，繼發(fā)性口形紅細胞增多癥除口形紅細胞增多外，一般無溶血，缺乏家族史，并具有相應(yīng)疾病的特征。診斷依據(jù)是紅細胞G-6-PD活性的實驗室檢查，臨床表現(xiàn)及陽性家族史2．HbF相對增多某些血液疾病【原理】自身免疫性溶血性貧血的自身抗體（IgG），是不完全抗體，結(jié)合在紅細胞表面，使其致敏?？笴3型多為陰性，僅17%弱陽性溫抗體型自身免疫性溶血性貧血因有冷凝集素的作用，故試驗必須在37℃條件下進行，在試驗前紅細胞應(yīng)先用溫鹽水洗滌過。或定量測定G-6-PD活性較正常平均值降低40%以上，均可確診。血紅蛋白的合成受鐵的供應(yīng)、原卟啉和珠蛋白合成的影響。第四節(jié)血紅蛋白病檢查（一）溫抗體型自身免疫性溶血性貧血（溫抗體型AIHA）紅細胞各種膜蛋白組分百分率變化較大，與正常紅細胞膜蛋白電泳圖譜作比較。IgG是引起該貧血的主抗體，與紅細胞的最適反應(yīng)溫度為35～40℃的自身抗體稱為溫抗體。是一種變性血紅蛋白顆粒，一般附著在細胞膜上，故又稱血紅蛋白包涵體，變性珠蛋白小體可被堿性染料著色。3．冷藏與水浴將以上試管混勻→冷藏（2～5℃）2h→取出觀察結(jié)果→記錄凝集管最高稀釋度→再將所有試管放入37℃水浴2h→取出觀察凝集是否消失。2．骨髓象骨髓紅細胞系統(tǒng)增生活躍為增生性貧血骨髓象。遺傳性球形紅細胞增多癥的紅細胞膜脂質(zhì)減少，表面積/體積的比值降低、細胞球形化，膜蛋白及膜脂質(zhì)有缺陷使對補體敏感的紅細胞膜造成缺損，紅細胞溶解破損①膜骨架蛋白組分和功能狀態(tài)【DAGT與IAGT臨床意義】參與核苷酸代謝或轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸甘油醛后參與糖酵解測定管凝集陽性對照管凝集陰性對照管不凝集鹽水對照管不凝集（四）陣發(fā)性冷性血紅蛋白尿癥PCH（四）陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥是一種獲得性造血干細胞基因突變引起紅細胞膜缺陷所致的溶血病。出現(xiàn)細胞膜對自身補體（C3）敏感性增高的異常紅細胞，引起慢性血管內(nèi)溶血。睡眠時加重，可伴發(fā)作性血紅蛋白尿和全血細胞減少癥。定義骨髓造血組織受到損傷，而引起多能造血干細胞的基因突變，產(chǎn)生膜異常的干細胞克隆，異常造血干細胞不斷增生、分化，形成具有PNH缺陷的細胞群；這種缺陷不僅累及紅細胞，也累及患者的粒細胞、淋巴細胞和血小板。患者體內(nèi)紅細胞分三型Ⅰ型對補體的敏感性正常；Ⅱ型對補體中度敏感；Ⅲ型對補體高度敏感。與睡眠有關(guān)的間歇溶血發(fā)作，以血紅蛋白尿為主要特征，多為慢性血管內(nèi)溶血，伴有全血細胞減少和反復(fù)血栓形成。臨床表現(xiàn)發(fā)病機制實驗室檢查陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥1．血象貧血，呈正色素性或低色素性貧血，網(wǎng)織紅細胞常增高，可見有核紅細胞及紅細胞碎片。白細胞和血小板多減少，半數(shù)患者呈全血細胞減少。2．骨髓象半數(shù)以上的患者三系增生活躍，尤以紅系造血旺盛。隨病情變化表現(xiàn)不一，不同穿刺部位增生程度可明顯差異。3．特殊溶血試驗（1）溶血存在的依據(jù)：尿隱血試驗或尿含鐵血黃素試驗陽性。（2）補體敏感的紅細胞存在的依據(jù)：蔗糖溶血試驗、熱溶血試驗、酸化血清溶血試驗。4．流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)GPI錨連接蛋白（CD55或CD59）低表達的異常細胞群，支持PNH診斷。本試驗是目前診斷PNH特異性和敏感性最高且可定量的檢測方法。診斷和鑒別診斷陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥1．診斷標準①臨床表現(xiàn)符合PNH或上述必須考慮為PNH的表現(xiàn)情況；②有肯定的血紅蛋白尿發(fā)作或血管內(nèi)溶血的直接、間接證據(jù)；③實驗室檢查證明有補體敏感的紅細胞群存在和檢測CD55及CD59這兩種常見的血細胞表面錨蛋白相關(guān)抗原的表達情況是確診試驗。2．鑒別診斷排除其他溶血病，全血細胞減少還應(yīng)與再障鑒別。3．再障-PNH綜合癥的診斷

凡再障轉(zhuǎn)化為PNH，或PNH轉(zhuǎn)化為再障，或兼有兩病特征者，均屬再障－PNH綜合征。再障-PNH綜合癥再分為四種情況：（1）再障-PNH：指原有肯定的再障（而非未能診斷的PNH早期表現(xiàn)），轉(zhuǎn)為可確定的PNH，再障的表現(xiàn)已不明顯。（2）PNH-再障：指原有肯定的PNH（而非下述的第4類），轉(zhuǎn)為明確的再障，PNH的表現(xiàn)已不明顯。（3）PNH伴有再障特征：指臨床及實驗室檢查所見均說明病情仍以PNH為主，但伴有一個或一個以上部位骨髓增生低下、巨核細胞減少、網(wǎng)織紅細胞不增高等再障表現(xiàn)者。（4）再障伴有PNH特征：指臨床及實驗室檢查所見均說明病情仍以再障為主，但伴有PNH的實驗診斷結(jié)果陽性者。PNH與再障的鑒別臨床癥狀與實驗室檢查PNH再生障礙性貧血出血較少，且程度較輕常有，程度較重感染較少較多鞏膜黃染部分病例有無肝脾腫大部分病例有偶見全血細胞減少約半數(shù)病例有所有病例有血小板波動約半數(shù)病例有，可達正常少有波動感染時白細胞升高反應(yīng)無少有網(wǎng)織紅細胞常增高常減少骨髓增生活躍或明顯活躍約90.5%約40.7%中性粒細胞堿性磷酸酶積分明顯降低增高血清膽紅素明顯增高可輕度增高蔗糖溶血試驗陽性陰性尿含鐵血黃素試驗均有罕見酸化血清溶血試驗陽性陰性最常見的為葡萄糖6-磷酸脫氫酶缺陷癥、丙酮酸激酶缺陷癥。第三節(jié)紅細胞酶缺陷檢查定義紅細胞酶缺陷是指參與紅細胞代謝（主要是糖代謝）的酶由于基因突變導(dǎo)致的酶活性或性質(zhì)改變所引起的溶血及（或）其他表現(xiàn)的疾病。按細胞內(nèi)代謝作用不同糖酵解途徑的酶缺乏己糖激酶（HK）葡萄糖磷酸異構(gòu)酶（GPI）丙酮酸激酶（PK）磷酸果糖激酶（PFK）戊糖磷酸旁路代謝的酶缺乏葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PD）6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGD）核苷酸代謝的酶缺陷嘧啶5’核苷酸酶（P5’N）腺苷酸激酶（AK）一、紅細胞的糖代謝乳酸脫氫酶葡萄糖6-磷酸葡萄糖磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乳酸5-磷酸核酮糖6-磷酸葡萄糖酸ADPATPNADHNAD-丙酮酸激酶NADPH+H+NADP+NADP+G-6-PD6PGD谷胱甘肽還原酶NADPH+H+氧化型谷胱甘肽谷胱甘肽還原型谷胱甘肽谷胱甘肽過氧化酶H2OH2O2參與核苷酸代謝或轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸甘油醛后參與糖酵解糖酵解途徑戊糖磷酸旁路途徑二、實驗室檢查（一）高鐵血紅蛋白還原試驗G6PG-6-PDNADP還原型美藍高鐵血紅蛋白（Fe3+）高鐵血紅蛋白還原酶6-磷酸葡萄糖酸NADPH氧化型美藍血紅蛋白（Fe2+）1.加入亞硝酸鹽使紅細胞中的亞鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，正常紅細胞的G-6-PD催化戊糖旁路使NADP成NADPH，其脫下的氫通過亞甲藍試劑的遞氫作用而使高鐵血紅蛋白（Fe3+）還原成亞鐵血紅蛋白（Fe2+），比色測定。2.當G-6-PD缺乏癥時，由于NADPH生成減少或缺乏，高鐵血紅蛋白不被還原或還原速度減慢，高鐵血紅蛋白還原率下降。3.正常人高鐵血紅蛋白還原率≥75%（臍帶血≥77%）。4.G-6-PD缺乏時，高鐵血紅蛋白還原率下降。中間缺乏（雜合子）為31%～74%，嚴重缺乏（半合子或純合子）<30%。（二）變性珠蛋白小體生成試驗G-6-PD缺乏的病人血樣加入乙酰苯肼于37℃孵育2～4小時，使血紅蛋白變性，用煌焦油藍等堿性染料染色觀察紅細胞珠蛋白小體的生成情況，計算含5個及以上珠蛋白小體的紅細胞的百分率。正常人含5個及以上珠蛋白小體的紅細胞一般<30%。二、實驗室檢查應(yīng)用評價1．G-6-PD缺乏癥常高于45%，可作G-6-PD缺乏的篩檢試驗。但還原型谷胱甘肽缺乏癥也增高；不穩(wěn)定血紅蛋白病含小體的細胞百分率為75%～84%，HbH病和化學(xué)物質(zhì)中毒時也增高。2．變性珠蛋白小體，主要是α、β珠蛋白鏈的病變而引起的溶解度和穩(wěn)定性降低所致；是一種變性血紅蛋白顆粒，一般附著在細胞膜上，故又稱血紅蛋白包涵體，變性珠蛋白小體可被堿性染料著色。該實驗與異丙醇試驗和熱不穩(wěn)定實驗一樣可作為不穩(wěn)定血紅蛋白存在的一種證據(jù)。3．G-6-PD活性正常時，紅細胞通過磷酸戊糖旁路形成NADPH使MHb還原成亞鐵血紅蛋白，因而含變性珠蛋白小體的紅細胞減少，而G-6-PD活性減低時，NADPH減少，MHb增多，導(dǎo)致含變性珠蛋白小體的紅細胞增多，不穩(wěn)定血紅蛋白由于血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，穩(wěn)定性減低易被氧化，含變性珠蛋白小體的紅細胞可增多，伯氨喹啉型溶血性貧血，含變性珠蛋白小體的紅細胞也可增多。（二）變性珠蛋白小體生成試驗在G-6-PD和NADP+存在下，G-6-PD能使NADP+還原成NADPH，后者在紫外線照射下會發(fā)出熒光。NADPH的吸收峰在波長340nm處，可通過單位時間生成的NADPH的量來測定G-6-PD活性。（三）G-6-PD熒光斑點試驗和活性測定G-6-PD缺陷見于蠶豆病、伯氨喹啉型藥物性溶血性貧血。利用此實驗可對高發(fā)區(qū)域人群或疑診的新生兒進行篩查。正常人有很強熒光。正常人酶活性為：（8.34±1.59）U/gHb（37℃）（ICSH推薦的Glock與McLean法）（12.1±2.09）U/gHb（37℃）（WHO推薦的Zinkham法）G-6-PD缺陷者的熒光很弱或無熒光；雜合子或某些G-6-PD變異者則可能有輕到中度熒光。二、實驗室檢查（四）丙酮酸激酶熒光斑點試驗和活性測定在ADP存在的條件下催化PEP轉(zhuǎn)化成丙酮酸，在NADH的作用下，丙酮酸被LDH轉(zhuǎn)化為乳酸，熒光標記NADH上，此時有熒光的NADH變?yōu)闊o熒光的NAD，檢測以上過程熒光消失的時間反應(yīng)PK的活性。熒光斑點不消失或時間延長說明丙酮酸激酶活性缺乏，中間缺乏（雜合子）時，熒光25～60分鐘消失，嚴重缺乏（純合子）時，熒光60分鐘不消失。正常人丙酮酸激酶活性斑點在25分鐘內(nèi)消失。酶活性（15.0±1.99）U/gHb。PEPADPLDH乳酸丙酮酸PKATP熒光標記NADHNAD+二、實驗室檢查紅細胞G-6-PD基因突變致活性降低和/或酶性質(zhì)改變，是一種X性連鎖隱性或不完全顯性遺傳性疾病。G-6-PD缺乏時，紅細胞膜脂質(zhì)和膜蛋白巰基的氧化，引起紅細胞僵硬，易被脾臟和肝臟中的巨噬細胞破壞導(dǎo)致溶血。三、紅細胞酶缺陷檢查的應(yīng)用（一）紅細胞葡萄糖6-磷酸脫氫酶缺陷癥分類蠶豆病急性溶血性貧血新生兒高膽紅素血癥先天性非球形紅細胞性溶血性貧血（CNSHA）實驗室檢查1．溶血的檢查非遺傳性有誘因，急性溶血，血管內(nèi)溶血；而遺傳性非球形細胞溶血性貧血具有慢性血管外溶血的實驗室特征2．G-6-PD缺乏的篩檢試驗高鐵血紅蛋白還原試驗、熒光斑點試驗、硝基四氮唑藍紙片法。熒光斑點試驗的特異性最高，高鐵血紅蛋白還原試驗的敏感性最強3．G-6-PD確診試驗G-6-PD活性定量檢測能準確反映酶的活性。診斷依據(jù)是紅細胞G-6-PD活性的實驗室檢查，臨床表現(xiàn)及陽性家族史如篩選試驗中兩項中度異常；或一項篩選試驗中度異常加上Heinz小體生成試驗陽性（有40%紅細胞含Heinz小體，每個紅細胞有5個以上Heinz小體）并排除其他溶血病因；或一項篩選試驗中度異常，伴有明確的家族史；或一項篩檢試驗嚴重異常；或定量測定G-6-PD活性較正常平均值降低40%以上，均可確診。診斷和鑒別診斷（二）丙酮酸激酶缺陷癥1.PK基因缺陷，常染色體隱性遺傳，僅次于G-6-PD缺陷癥2.PK缺陷時，ATP產(chǎn)生減少，引起血管外溶血，表現(xiàn)為慢性溶血性貧血。檢驗1．篩檢試驗紅細胞自溶血試驗、PK熒光斑點試驗2．酶活性定量試驗PK活性檢測3．ATP測定4．中間代謝產(chǎn)物測定①2，3-二磷酸甘油酸（2，3-DPG）②磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）③2-磷酸甘油酸（2-PG）診斷和鑒別診斷1．紅細胞PK缺乏的實驗室診斷標準2．遺傳性紅細胞丙酮酸激酶缺乏癥主要通過紅細胞PK活性的測定進行診斷。三、紅細胞酶缺陷檢查的應(yīng)用第四節(jié)血紅蛋白病檢查成熟紅細胞內(nèi)的主要蛋白質(zhì)是血紅蛋白（Hb），占細胞干重的96%，占細胞容積的35%。正常血紅蛋白由兩對珠蛋白肽鏈和4個亞鐵血紅素構(gòu)成的4個亞基組成的四聚體，形狀近似球形的結(jié)合蛋白。血紅蛋白的合成受鐵的供應(yīng)、原卟啉和珠蛋白合成的影響。分子結(jié)構(gòu)：由血紅素和珠蛋白構(gòu)成，其分子由四個亞基構(gòu)成，即兩個α亞基和兩個β亞基，可組裝成α2β2結(jié)構(gòu)血紅蛋白合成：65%合成于有核紅細胞期，35%合成于網(wǎng)織紅細胞期血紅蛋白是一種結(jié)合蛋白，分子量約為64458每個亞基由：一條珠蛋白肽鏈和一個血紅素分子構(gòu)成血紅素是鐵原子和原卟啉Ⅸ的復(fù)合物。為含鐵卟啉衍生物，鐵原子位于原卟啉Ⅸ的卟啉環(huán)中心珠蛋白肽鏈有6種：α、β、γ、δ、ε、ζ。出生后白主要有α、β、γ、δ四種珠蛋白肽鏈（一）血紅蛋白的結(jié)構(gòu)

血紅蛋白血紅素鐵原子原卟啉Ⅸ珠蛋白α、β、γ、δ、ε、ζ。出生后主要有α、β、γ、δ四種珠蛋白肽鏈正常血紅蛋白由兩對珠蛋白肽鏈和4個亞鐵血紅素構(gòu)成的4個亞基組成的四聚體，形狀近似球形的結(jié)合蛋白。血紅蛋白的合成受鐵的供應(yīng)、原卟啉和珠蛋白合成的影響。血紅蛋白由四條非共價結(jié)合的球蛋白鏈組成，每條鏈結(jié)合一血紅素基團，亦即血紅蛋白分子的氧結(jié)合位點。血紅素是鐵原子和原卟啉Ⅸ的復(fù)合物，是含鐵卟啉衍生物，鐵原子位于原卟啉Ⅸ的卟啉環(huán)中心。血紅素是血紅蛋白的組成成分，是Hb、Mb、多種酶和多種細胞色素的輔基，其合成于有核紅細胞和肝細胞的線粒體內(nèi)。血紅素合成后，離開線粒體，在胞質(zhì)內(nèi)與珠蛋白肽鏈結(jié)合為血紅蛋白；血紅素由脾臟、骨髓、肝臟中的巨噬細胞吞噬降解。在血紅素合成過程中酶的缺陷引起卟啉或其前體在體內(nèi)蓄積可導(dǎo)致卟啉病。珠蛋白按四級結(jié)構(gòu)與血紅素形成血紅蛋白，血紅蛋白的每個亞基由一條珠蛋白肽鏈和一個血紅素分子構(gòu)成，肽鏈在生理條件下成球形，把血紅素分子包在里面，這條肽鏈盤繞成的球形結(jié)構(gòu)又被稱為珠蛋白。胚胎期：HbGower1（δ2ε2）HbGower2（α2ε2）HbPorthland（ζ2γ2）3周出現(xiàn)，12周完全消失出生后：HbA(α2β2)：占總量的96%～98%；HbA2(α2δ2)：占總量的1.2%～3.5%；HbF(α2γ2)：出生后迅速下降，2歲時接近成人，占總量的2%以下。胎兒后2/3期和新生兒期：HbF(α2γ2)：胎兒血紅蛋白（一）血紅蛋白的結(jié)構(gòu)

（二）影響血紅蛋白結(jié)構(gòu)和功能的因素影響血紅蛋白結(jié)構(gòu)和功能的因素珠蛋白基因缺失或缺陷一種或一種以上的珠蛋白肽鏈不能合成或合成不足HbH(β4)HbBarts(γ4)肽鏈一級結(jié)構(gòu)中的某一氨基酸被替換或丟失酶缺陷MHb化學(xué)藥物中毒MHbSHbHbCO二、實驗室檢查血紅蛋白電泳抗堿血紅蛋白檢測血紅蛋白F酸洗脫試驗異丙醇沉淀試驗熱變性試驗紅細胞包涵體試驗（一）血紅蛋白電泳根據(jù)不同的血紅蛋白帶有不同的電荷，等電點不同，在一定的pH緩沖液中，緩沖液的pH大于Hb的等電點時其帶負電荷，電泳時在電場中向陽極泳動；反之，Hb帶正電荷向陰極泳動，不同的血紅蛋白所帶電荷和相對分子量不同，可分離出各自的區(qū)帶。1．通過與正常人的血紅蛋白電泳圖譜進行比較，可發(fā)現(xiàn)異常血紅蛋白區(qū)帶。如HbH、HbE、HbBarts、HbS、HbD和HbC等異常血紅蛋白。2．HbA2增多，見于β珠蛋白生成障礙性貧血，為雜合子的重要實驗室診斷指標。HbE病時也在HbA2區(qū)帶位置處增加，但含量很大。HbA2輕度增加亦可見于肝病、腫瘤和某些血液病。1．pH8.6TEB緩沖液醋酸纖維膜電泳，適合于檢出HbA、HbA2、HbS、HbC，但HbF不易與HbA分開，HbH與HbBarts不能分開和顯示。2．pH6.5TEB緩沖液醋酸纖維膜電泳主要用于HbH和HbBarts的檢出。二、實驗室檢查（二）抗堿血紅蛋白檢測胎兒血紅蛋白（HbF）具有比HbA更強的抗堿作用，將待檢的溶血液與一定量的NaOH溶液混合，作用1分鐘后加入半飽和硫酸銨中止堿變性反應(yīng)。HbF抗堿變性作用強，沒有變性存在于上清中，而HbA變性沉淀，取上清液于540nm處測定吸光度，檢測出HbF的濃度?！緫?yīng)用評價】1．HbF絕對增多珠蛋白生成性貧血時HbF增加，重型者達30%～90%，中間型常為5%～30%，輕型小于5%。遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)綜合征患者，HbF可高達100%2．HbF相對增多某些血液疾病3．HbF生理性增多多見于孕婦及新生兒。【參考區(qū)間】成人<2%，新生兒<40%二、實驗室檢查骨髓有核細胞增生，以幼紅細胞增生為主，粒/紅比例倒置，幼紅細胞可呈巨幼樣變，但血清葉酸及維生素B12測定都在正常范圍。6TEB緩沖液醋酸纖維膜電泳，適合于檢出HbA、HbA2、HbS、HbC，但HbF不易與HbA分開，HbH與HbBarts不能分開和顯示。（三）冷凝集素綜合征CAS陣發(fā)性冷性血紅蛋白尿癥不同類型溶血性貧血試驗選擇血清間接膽紅素輕度升高。紅細胞膨脹，孵育滲透脆性增加為含鐵卟啉衍生物，鐵原子位于原卟啉Ⅸ的卟啉環(huán)中心試驗器材應(yīng)防止污染血漿蛋白，以免帶紅細胞形態(tài)檢查、紅細胞包涵體試驗、異丙醇沉淀試驗、熱變性試驗、Heinz小體生成試驗按缺乏的珠蛋白鏈的種類分類臨床表現(xiàn)一般為輕度溶血性貧血，脾不腫大或輕度腫大，呈小細胞低色素性貧血，易感染并使貧血加重。HbF抗堿變性作用強，沒有變性存在于上清中，而HbA變性沉淀，取上清液于540nm處測定吸光度，檢測出HbF的濃度。二、溶血性貧血的發(fā)病機制出現(xiàn)細胞膜對自身補體（C3）敏感性增高的異常紅細胞，引起慢性血管內(nèi)溶血。相關(guān)實驗室檢查明顯異常。異常血紅蛋白病，常見的疾?。喝?、溶血性貧血的診斷方法B、新生兒血型抗體檢查；本病的特征是血片中出現(xiàn)較多的口形紅細胞，有輕重不一的溶血陽性家族史。HbPorthland（ζ2γ2）（三）血紅蛋白F酸洗脫試驗HbF具有抗堿和抗酸作用，其抗酸能力比HbA強。將血涂片于酸性緩沖液中孵育，含HbF的紅細胞不被酸洗脫，可被伊紅染成紅色，而含HbA的紅細胞均被酸洗脫，不能被伊紅著色【應(yīng)用評價】珠蛋白生成障礙性貧血著色細胞增加，重型患者大多數(shù)紅細胞染成紅色，輕型患者可見少數(shù)染成紅色的細胞。遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)綜合征全部紅細胞均染為紅色?！緟⒖紖^(qū)間】正常血片含HbF的著色紅細胞<0.02（<2%）；孕婦可有輕度增加。二、實驗室檢查（四）異丙醇沉淀試驗在異丙醇這種能降低血紅蛋白分子內(nèi)部氫鍵的非極性溶劑中，不穩(wěn)定血紅蛋白更快地裂解沉淀。通過觀察血紅蛋白液在異丙醇中的沉淀現(xiàn)象對不穩(wěn)定血紅蛋白進行篩檢?！緫?yīng)用評價】不穩(wěn)定血紅蛋白存在時，常于5分鐘時出現(xiàn)沉淀，20分鐘開始出現(xiàn)絨毛狀沉淀。血液中含有較多HbF、HbH、HbE時也可出現(xiàn)陽性結(jié)果?！緟⒖紖^(qū)間】正常人血紅蛋白液為陰性（30分鐘內(nèi)不沉淀）二、實驗室檢查（五）熱變性試驗是根據(jù)不穩(wěn)定血紅蛋白比正常血紅蛋白更容易遇熱變性，觀察血紅蛋白液在50℃時是否出現(xiàn)沉淀，對不穩(wěn)定血紅蛋白進行篩檢?！緫?yīng)用評價】血紅蛋白沉淀率增加，說明不穩(wěn)定血紅蛋白的存在?！緟⒖紖^(qū)間】正常人熱沉淀的血紅蛋白<1%二、實驗室檢查（六）紅細胞包涵體試驗將煌焦油藍液與新鮮血液一起孵育，不穩(wěn)定血紅蛋白易變性沉淀形成包涵體。觀察溫育2h含包涵體的紅細胞是否比溫浴10min的陽性細胞多，可了解是否有HbH等不穩(wěn)定血紅蛋白的存在?！緟⒖紖^(qū)間】正常人<0.01（<1%）溫育10min10min～2h3h或更長網(wǎng)織紅細胞顯現(xiàn)出來HbH病紅細胞內(nèi)包涵體形成其它不穩(wěn)定血紅蛋白形成珠蛋白變性沉淀【應(yīng)用評價】1．不穩(wěn)定血紅蛋白病孵育1～3小時多數(shù)紅細胞內(nèi)可出現(xiàn)變性珠蛋白肽鏈沉淀形成的包涵體。G-6-PD缺乏或細胞還原酶缺乏及化學(xué)物質(zhì)中毒等，紅細胞中也可出現(xiàn)包涵體。2．HbH病孵育1小時就可出現(xiàn)包涵體，也叫HbH包涵體。二、實驗室檢查三、血紅蛋白病檢查的應(yīng)用

血紅蛋白病珠蛋白生成障礙性貧血，常見的疾?。寒惓Ｑt蛋白病，常見的疾?。海ㄖ榈鞍祖湐?shù)量異常，常染色體隱性遺傳）（珠蛋白鏈結(jié)構(gòu)異常，常染色體顯性遺傳）β-地中海貧血α-地中海貧血鐮狀細胞貧血（HbS病）血紅蛋白E病血紅蛋白病:由遺傳性或基因突變所致的珠蛋白肽鏈結(jié)構(gòu)異?；蚝铣呻逆溗俾实母淖儯鹧t蛋白功能異常所致的疾?。ㄒ唬┲榈鞍咨烧系K性貧血珠蛋白生成障礙性貧血定義又稱為地中海貧血或海洋性貧血，它是由于遺傳的基因缺陷導(dǎo)致血紅蛋白中至少一種珠蛋白合成缺乏或不足，引起的貧血或病理狀態(tài)。分類按缺乏的珠蛋白鏈的種類分類α珠蛋白生成障礙性貧血β珠蛋白生成障礙性貧血按缺乏的珠蛋白鏈的程度分類完全無生成的α°、β°珠蛋白生成障礙性貧血部分生成的α+、β+珠蛋白生成障礙性貧血（βδ）°或（βδ）+珠蛋白生成障礙性貧血1．β珠蛋白生成障礙性貧血是珠蛋白生成障礙性貧血中發(fā)病率最高的一種類型。第11號染色體上控制β珠蛋白鏈合成的基因突變，β珠蛋白鏈合成受到抑制，雜合子的α鏈的合成速度比β鏈快2.0~2.5倍，純合子的α鏈合成的速度超過β鏈更多，甚至可完全沒有β鏈合成。多余的α鏈將導(dǎo)致：（1）α鏈聚合成不穩(wěn)定的四聚體（α4）增加，HbA2和HbF含量增加。（2）很不穩(wěn)定，容易發(fā)生沉淀，形成靶形紅細胞；（3）α鏈包含體附著于紅細胞膜，使紅細胞僵硬，導(dǎo)致無效造血。（4）紅細胞對鉀離子的通透性增加，能量代謝能力降低，生存期縮短。（一）珠蛋白生成障礙性貧血分類輕型雜合子β珠蛋白生成障礙性貧血沒有任何癥狀和貧血，但血涂片中可發(fā)現(xiàn)少數(shù)靶形紅細胞，紅細胞脆性試驗有輕度減低，HbA2輕度增高（大于3.5%）是其特點。重型純合子β珠蛋白生成障礙性貧血父母雙方均為輕型β珠蛋白生成障礙性貧血，出生后貧血進行性加重，有溶貧臨床表現(xiàn)，有地中海貧血面容。相關(guān)實驗室檢查明顯異常。中間型β珠蛋白生成障礙性貧血β珠蛋白生成障礙性貧血純合子型或雙重雜合子型。（一）珠蛋白生成障礙性貧血2．α珠蛋白生成障礙性貧血由于α珠蛋白基因的缺乏或缺陷使α珠蛋白鏈合成速度明顯降低或幾乎不能合成引起的。由第16對染色體上兩對聯(lián)鎖的α珠蛋白基因（父母雙方各繼承兩個）所控制。（一）珠蛋白生成障礙性貧血實驗室檢查1．血象貧血輕重不等，紅細胞大小不均，靶形RBC、碎片多大于10%，Ret增多，紅細胞脆性減低。2．血紅蛋白電泳檢測出異常血紅蛋白3．骨髓象骨髓中紅細胞增生極度活躍，粒紅比例倒置，呈無效性增生和原位溶血4．基因診斷診斷依據(jù)①臨床表現(xiàn)；②血液學(xué)改變，血紅蛋白電泳是診斷本病必備條件；③遺傳學(xué)檢查可確定純合子、雜合子、及雙重雜合子等，最可靠的方法是家族史的研究；④基因診斷可以鑒定基因型，并可作為確診試驗。（一）珠蛋白生成障礙性貧血各型珠蛋白生成障礙性貧血的血紅蛋白電泳結(jié)果類型HbA2HbF異常Hbα珠蛋白生成障礙性貧血HbH病正常HbH5%~30%HbBarts病降低正常HbBarts＞90%β珠蛋白生成障礙性貧血輕型3.5%~7%10%~30%重型1%~5%60%~98%βδ混合型100%HbE/β15%~40%HbE60%~80%（一）珠蛋白生成障礙性貧血（二）異常血紅蛋白病鐮狀細胞貧血（HbS?。┏霈F(xiàn)異常血紅蛋白S的常染色體顯性遺傳疾病。因HbA的β鏈形成HbS（Hbα2β26谷→纈），當血氧過低時HbS互相聚集，形成纖維狀多聚體。，當有足夠的多聚體形成時，紅細胞即由雙面凹盤狀變成鐮刀形，此過程稱“鐮變”。【實驗室檢查】血紅蛋白降低，紅細胞大小不均，出現(xiàn)異形細胞、多染性紅細胞、有核紅細胞、靶形紅細胞等，鐮狀紅細胞不多見。網(wǎng)織紅細胞常大于10%。紅細胞鐮變試驗陽性，紅細胞滲透脆性明顯降低。血紅蛋白電泳，可見HbS帶位于HbA和HbA2間，采用基因分析，可作出基因診斷。HbS病有三種表現(xiàn)形式：①純合子形式，即鐮狀細胞貧血；②雜合子形式，即紅細胞鐮狀細胞性狀；③HbS和其他異常血紅蛋白的雙雜合子狀態(tài)血紅蛋白E病（HbE）是β鏈第26位谷氨酸被賴氨酸替代的異常血紅蛋白(α2β226谷-賴)。HbE病是出現(xiàn)血紅蛋白E的常染色體不完全顯性遺傳性血紅蛋白病，為我國最常見的血紅蛋白病?！緦嶒炇覚z查】多為小細胞低色素性輕度貧血，紅細胞滲透脆性降低，血紅蛋白電泳顯示HbE占75%~92%，因HbE不穩(wěn)定，異丙醇沉淀試驗陽性和熱變性試驗弱陽性；變性珠蛋白小體檢測陽性。三種類型：HbE純合子、HbE特征和HbE/β珠蛋白生成障礙性貧血臨床表現(xiàn)一般為輕度溶血性貧血，脾不腫大或輕度腫大，呈小細胞低色素性貧血，易感染并使貧血加重。（二）異常血紅蛋白病不穩(wěn)定血紅蛋白病是由于控制血紅蛋白的肽鏈的基因突變，某些維持穩(wěn)定性的氨基酸被取代或缺失，致使血紅蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，稱為不穩(wěn)定血紅蛋白本病診斷有重要意義的是變性珠蛋白小體檢查、熱變性試驗和異丙醇沉淀試驗為陽性，一般用異丙醇試驗篩選，熱變性試驗和變性珠蛋白小體檢查診斷。多為正細胞性貧血，紅細胞大小不均，有異形和碎片，有時可見靶形紅細胞，網(wǎng)織紅細胞增高。血紅蛋白電泳僅有部分病例可分離出異常血紅蛋白區(qū)帶。易變性和沉淀，形成變性珠蛋白小體相應(yīng)臨床表現(xiàn)差異大（二）異常血紅蛋白病第五節(jié)免疫性溶血性貧血的檢查檢查抗體性質(zhì)明確診斷方向判斷效價水平評估疾病程度查找疾病原因檢查目的編輯制作李克勤一、概述

免疫性溶血性貧血-是由于免疫功能紊亂產(chǎn)生某種抗體能與自己正常紅細胞表面的抗原結(jié)合或激活補體，引起紅細胞過早破壞而導(dǎo)致的一組獲得性溶血性貧血，統(tǒng)稱免疫性溶血性貧血。

定義：免疫性溶血性貧血的分類依據(jù)病因可分為三類自身免疫性貧血同種免疫性貧血藥物免疫性貧血一、概述二、實驗室檢查（一）直接抗人球蛋白試驗（DATG）【原理】自身免疫性溶血性貧血的自身抗體（IgG），是不完全抗體，結(jié)合在紅細胞表面，使其致敏。直接抗人球蛋白試驗（DAGT），是應(yīng)用抗人球蛋白試劑（抗IgG和／或抗C3d）與紅細胞表面的IgG分子結(jié)合，并出現(xiàn)凝集反應(yīng)。紅細胞表面如果不存在自身抗體，則凝集反應(yīng)呈陰性?？谷饲虻鞍自囼炘恚阎t細胞抗原IgG抗體被IgG抗體致敏紅細胞抗人球蛋白抗體抗人球蛋白原理示意圖凝集為陽性直接反應(yīng)間接反應(yīng)【DAGT測定】【試劑】（1）抗人球蛋白血清,主要為抗IgG血清（適當稀釋，按出廠說明）。（2）正常O型人（2人以上）混合比容紅細胞。（3）抗D（Rh）血清。（4）AB型血清?！痉椒ā?.紅細胞懸液制備將被檢比容紅細胞洗滌3次后，配成5%紅細胞生理鹽水懸液。2.陰、陽性對照的紅細胞懸液制備如下表，分別得到各5%的紅細胞生理鹽水懸液。紅細胞／血清陽性對照紅細胞管（滴）陰性對照紅細胞管（滴）O型混合比容紅細胞22抗D（Rh）血清4-AB型血清-4陰、陽性對照的紅細胞懸液制備DAGT對照紅細胞懸液制備陽性對照管陰性對照管O型混合比容紅細胞2滴O型混合比容紅細胞2滴

抗D（Rh）血清4滴AB型血清4滴

370C水浴1h→離心棄去上清液→洗滌3次→分別配成5%紅細胞懸液。

【

DAGT操作步驟】

被檢RBC懸液2滴陽性對照RBC懸液2滴陰性對照RBC懸液2滴被檢RBC懸液2滴抗IgG血清2滴抗IgG血清2滴抗IgG血清2滴生理鹽水2滴↓↓↓↓

測定管陽性對照管陰性對照管鹽水對照管將以上各管混勻→5分鐘（或低速離心1分鐘）→觀察結(jié)果。

直接抗人球蛋白（DAGT）操作步驟示意圖【DAGT結(jié)果觀察】

測定管凝集陽性對照管凝集陰性對照管不凝集鹽水對照管不凝集陽性結(jié)果測定管不凝集陽性對照管凝集陰性對照管不凝集鹽水對照管不凝集

直接抗人球蛋白（DAGT）結(jié)果觀察示意圖陰性結(jié)果

【DAGT注意事項】1.所有試驗用紅細胞及血清都應(yīng)新鮮。2.試驗器材應(yīng)防止污染血漿蛋白，以免帶有球蛋白而出現(xiàn)假陰性。3.所用紅細胞必須洗滌，未洗滌紅細胞不能用于本試驗。（二）間接抗人球蛋白試驗（IAGT）【原理】間接試驗是檢查血清中游離的不完全抗體的試驗。本試驗是應(yīng)用已知紅細胞與抗人球蛋白血清，檢測被檢者血清中是否含有相應(yīng)的不完全抗體，如果存在，則已知紅細胞被致敏，再加入抗人球蛋白血清，可出現(xiàn)凝集?！?/p>

IAGT方法】

被檢者標本制備：按直接法制備被檢者5%紅細胞懸液；血清。操作步驟：取小試管4支，做好標記按下表加反應(yīng)物。【IAGT操作步驟】RBC懸液（已知）1滴D陽性RBC1滴D陽性RBC1滴被檢RBC懸液1滴血清（被檢）2滴不完全抗D血清2滴AB型血清2滴生理鹽水2滴

測定管陽性對照陰性對照鹽水對照

間接抗人球蛋白（IAGT）操作步驟示意圖→混勻→37℃水浴1小時→各管分別洗滌3次后→留1滴紅細胞懸液→分別加入抗人球蛋白血清1滴混勻→5分鐘后（或低速離心1分鐘）看結(jié)果。【IAGT結(jié)果觀察】測定管凝集陰性對照管不凝集測定管不凝集陽性對照管凝集陽性對照管凝集鹽水對照管不凝集陰性對照管不凝集鹽水對照管不凝集間接接抗人球蛋白（IAGT）結(jié)果觀察示意圖陽性結(jié)果

陰性結(jié)果

【DAGT與IAGT臨床意義】

自身免疫性溶血性貧血藥物誘發(fā)性免疫性溶血性貧血

新生兒溶血??；結(jié)締組織病Rh和ABO血型不合的妊娠（IAGT）陽性見于：

（DAGT）陽性見于：

（三）冷凝集素試驗（CAggT）【原理】冷凝集素為IgM類完全抗體，在低溫時可使自身紅細胞、0型紅細胞或與受檢者血型相同的紅細胞發(fā)生凝集，凝集反應(yīng)的高峰在0℃～4℃，當溫度回升到37℃時凝集消失?！驹噭?.正常O型或與受檢者相同血型2%紅細胞懸液（懸液制備方法同DAGT法）。

2.生理鹽水【CAggT方法】1.取患者靜脈血3ml～4ml→凝固后→離心分離血清→吸出血清備用。2.操作步驟取17只試管按下表加反應(yīng)物。O型2%紅細胞懸液ml

0.20.20.20.20.20.20.20.2試管號123456…1617

生理鹽水ml0.20.20.20.20.20.2…

0.20.2被檢血清ml

0.2