法醫(yī)物證鑒定動物DNA種屬鑒定技術規(guī)范

法醫(yī)物證鑒定動物DNA種屬鑒定技術規(guī)范范圍本技術規(guī)范規(guī)定了XX省司法鑒定機構法醫(yī)DNA實驗室進行DNA種屬鑒定的基本要求、檢驗程序、質量控制、鑒定意見和鑒定文書。本技術規(guī)范適用于XX省法醫(yī)DNA實驗室對含有DNA的生物檢材（包括但不限于血液、毛發(fā)、羽毛、組織、骨骼、牙齒等）的物種來源進行確認，確認范圍為獸類（包括人）、鳥類、爬行類、兩棲類。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GA/T382-2014法庭科學DNA實驗室建設規(guī)范GA/T383-2014法庭科學DNA實驗室檢驗規(guī)范SF/ZJD0105008-2018法醫(yī)物證鑒定線粒體DNA檢驗規(guī)范SF/T0069-2020法醫(yī)物證鑒定實驗室管理規(guī)范SN/T4626-2016DNA條形碼物種鑒定操作規(guī)程CNAS-CL08:2018《司法鑒定/法庭科學機構能力認可準則》CNAS-CL08-A002:2018《司法鑒定/法庭科學機構能力認可準則在法醫(yī)物證DNA鑒定領域的應用說明》術語和定義下列術語和定義適用于本文件。法醫(yī)物證鑒定鑒定人運用法醫(yī)物證學的科學技術或者專門知識，對各類生物檢材進行鑒別和判斷并提供鑒定意見的活動。DNA種屬鑒定DNA種屬鑒定指的是通過DNA序列分析對生物檢材的種屬來源進行鑒定。廣義上的種屬鑒定包括動植物的類屬確定，狹義的種屬鑒定指的是動物的生物檢材的種屬來源鑒定，即確定檢材是否屬于人體所有，有時還要確定檢材屬于何種動物。遺傳標記遺傳標記是指在DNA序列分析中用作標記的基因，也稱為標記基因。線粒體DNA線粒體DNA（MitochondrialDNA，mtDNA）是指位于線粒體中的DNA，呈雙鏈環(huán)狀結構，有編碼區(qū)和非編碼區(qū)。常用的遺傳標記有控制區(qū)、12SrRNA、16SrRNA、細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ（CytochromecoxidasesubunitIgene，COI）以及細胞色素b（Cytochromeb，Cytb）等。BLAST比對BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）是基于局部序列比對，對數(shù)據(jù)庫進行快速搜索，其特點是僅搜索序列之間高度相似的區(qū)域，可以兼顧到搜索的精確性和搜索速度，是目前應用最廣泛的序列相似性搜索工具之一。BLAST的運行方式是先用目標序列建立數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫里面的每一條序列為目標序列，然后用查詢序列與數(shù)據(jù)庫中的目標序列做兩兩序列局部比對，從而得到全部比對結果。包括BLASTN和BLASTP，BLASTN是將給定的核酸序列與核酸數(shù)據(jù)庫中的序列進行比較；BLASTP是使用蛋白質序列與蛋白質數(shù)據(jù)庫中的序列進行比較。本規(guī)范應用的是BLASTN?；蛐蛄邢嗨贫然蛐蛄邢嗨贫龋⊿equencesimilarity）是指進行序列比對時，檢測序列與目標序列之間相同DNA堿基數(shù)與檢測序列全部堿基數(shù)的比值。MSPMSP（Maximum-scoringsegmentpair）代表在數(shù)據(jù)庫中進行Blast檢索時，與被檢測序列相似度最高的序列。系統(tǒng)發(fā)育樹系統(tǒng)發(fā)育樹（Phylogenetictrees）是表明被認為具有共同祖先的各物種間演化關系的樹?；疽?.1鑒定機構應具有從事法醫(yī)物證的執(zhí)業(yè)范圍，且應滿足如下要求：a）對所有影響鑒XX果的人員崗位規(guī)定相應的能力要求，包括教育、資質、培訓、專業(yè)知識、技能等，并保留相關記錄；制定適宜的培訓計劃并組織實施；b）依據(jù)鑒定方法和要求對鑒定人以及參與鑒定工作的人員進行監(jiān)督，以評價其鑒定工作的符合性和滿意程度；監(jiān)督的結果應作為培訓需求評價的依據(jù)之一；c）具有能識別樣本的標識系統(tǒng)，并確保樣本在鑒定過程期間能得到持續(xù)的識別；d）建立樣本的運輸、接收、處置、保護、存儲、保留和/或清理的規(guī)定，應對接收、內部傳遞、處置、保留、返還和清理等過程進行記錄，確保記錄的完整性和可追溯性。4.2鑒定人應具有法醫(yī)物證鑒定執(zhí)業(yè)資格，熟悉并掌握線粒體DNA檢驗的方法和原理，并能正確評價結果。4.3鑒定活動應包括檢驗（采樣、DNA提取和純化、DNA定量分析、DNA測序、遺傳信息分析）、鑒定意見判斷、鑒定文書撰寫等環(huán)節(jié)。鑒定活動完畢后，應將各個環(huán)節(jié)的記錄進行歸檔。檢驗程序采樣要求5.1.1含有DNA的生物檢材（包括但不限于血液、毛發(fā)、羽毛、組織、骨骼、牙齒等）均可采集。5.1.2樣本應分別包裝，注明編號、采樣日期等。5.1.3樣本采集后應及時進行實驗或冷凍保存（注：冷凍保存溫度為-20℃，時間不超過3個月）。DNA提取和純化按照GA/T383-2014中附錄A的方法執(zhí)行。DNA定量分析按照GA/T383-2014中6.1～6.3的方法執(zhí)行。MtDNA測序根據(jù)需要，可選擇單個或多個遺傳標記，通過Primer數(shù)據(jù)庫獲取通用引物，或自行設計引物進行PCR擴增和測序。本技術規(guī)范提供了兩個通用引物的體系示例供參考，操作如下：a）PCR擴增PCR擴增體系：反應組分原濃度終濃度10×PCRBuffer10×1×MgCl2（mmol/L）251.25dNTPs（mmol/L）100.2Taq酶（U/μL）20.05引物（μmol/L）1.250.25模板DNA（ng/L）5-251-5ddH2O——12SrRNA引物對：F：5'-AAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3'R：5'-GAGGGTGACGGGCGGTGTGT-3'COI引物對：F：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'R：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'PCR擴增條件：95℃，5min；95℃30s，55℃40s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃，7min。b）測序利用遺傳分析儀對PCR產(chǎn)物進行雙向測序，得到DNA序列信息。遺傳信息分析5.6.1BLAST比對獲得的DNA序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫中的在線序列Blast工具（），在數(shù)據(jù)庫進行搜索。5.6.2系統(tǒng)發(fā)育樹的構建根據(jù)Blast搜索結果，當MSP有多個物種序列時，下載這些物種的基因序列，同時下載遠源物種的基因序列作為外群序列。利用專業(yè)分析軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。質量控制從事DNA種屬鑒定的實驗室至少應該包括以下質量控制措施：對照設置為保證DNA測序結果的準確性，要求每次實驗過程中均設置陽性對照和陰性對照。陽性對照：PCR擴增添加ControlDNA作為陽性對照。陰性對照包括：（1）提取試劑的空白對照，用于監(jiān)控從提取到分析環(huán)節(jié)是否存在污染；（2）PCR試劑的空白對照，用于監(jiān)控從擴增到分析環(huán)節(jié)是否存在外源DNA污染。雙向測序為避免潛在的異質性影響和保證結果的可靠性，宜進行正、反鏈雙向測序。污染防控根據(jù)CNAS-CL08-A002:2018法醫(yī)物證DNA實驗室的相關要求，從事DNA種屬鑒定實驗室應采?。ǖ幌抻冢┮韵麓胧┮苑乐刮廴荆篴）檢材在實驗室工作區(qū)間的單向流動；b）做好實驗人員的自身防護，如使用個人防護裝備，包括作業(yè)服、一次性使用手套、一次性使用口罩和一次性使用發(fā)罩，并根據(jù)具體情況及時更換；c）做好設備、設施的定期清理和消毒；d）具備實驗區(qū)的外部屏障，能有效阻止無關人員未經(jīng)許可進入實驗區(qū)。鑒定意見7.1根據(jù)DNA檢驗結果的遺傳信息分析進行鑒定意見判斷。7.2鑒定意見判斷可參考以下原則：a）當檢測序列與MSP的基因序列相似度為99-100%，且MSP所代表動物為單個物種時，可認為MSP所代表動物與檢材所屬動物為同一種；b）當檢測序列與MSP的基因序列相似度為99-100%，且MSP所代表動物為多個物種時，可構建系統(tǒng)發(fā)育樹，與檢測序列聚為一支的序列所代表的動