細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)-課件

WALVAXIntroduction玉溪嘉和生物藥業(yè)有限公司細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)王建清1ppt課件內(nèi)容單抗基本知識(shí)細(xì)胞基本知識(shí)設(shè)備與器材準(zhǔn)備、溶液配制無(wú)菌技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)凍存、復(fù)蘇2ppt課件抗體基本概念及抗體結(jié)構(gòu)抗體基本概念B細(xì)胞接受抗原刺激后增殖分化成漿細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白抗體的結(jié)構(gòu)四條肽鏈通過(guò)鏈間二硫鍵組成H2L2重鏈：五類(isotype:a、g、m、d、e)輕鏈：兩型(k、l)3ppt課件抗體基本概念及抗體結(jié)構(gòu)抗體的三個(gè)功能區(qū)可變區(qū)(Variableregion,VH/VL,Fv)：結(jié)合抗原

VH和VL：重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)高變區(qū)HVR－抗原結(jié)合部位－互補(bǔ)決定區(qū)CDR

骨架區(qū)FR1－4

恒定區(qū)(Constantregion,CH/CL)

絞鏈區(qū)(Hingeregion)4ppt課件抗體基本概念及抗體結(jié)構(gòu)免疫球蛋白的類型

類型(Class):重鏈C區(qū)抗原性 IgG、IgA、IgM、IgD、IgE亞類(Subclass):重鏈抗原性/二硫鍵數(shù)目位置 IgG1-45ppt課件單克隆抗體和基因工程單抗6ppt課件單克隆抗體和基因工程單抗

人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。7ppt課件鼠單克隆V區(qū)人源化（CDR移植）CDR序列CDR序列鼠單克隆抗體人抗體人源化抗體單克隆抗體和基因工程單抗8ppt課件鼠抗體嵌合抗體66%人源化抗體90%全人抗體100%單克隆抗體和基因工程單抗9ppt課件單抗基本知識(shí)細(xì)胞基本知識(shí)設(shè)備與器材準(zhǔn)備、溶液配制無(wú)菌技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)凍存、復(fù)蘇10ppt課件細(xì)胞基礎(chǔ)知識(shí)細(xì)胞學(xué)的由來(lái)細(xì)胞及細(xì)胞學(xué)說(shuō)的提出：1665年英國(guó)學(xué)者Roberthooke，用自制的顯微鏡觀察軟木的薄片，第一次發(fā)現(xiàn)植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并首次借用拉丁文Cella（小室）這個(gè)詞稱呼他們看到的類似于蜂巢的極小的封閉小室。德國(guó)植物學(xué)家施萊登（1838.M.JSchleiden）,動(dòng)物學(xué)家施旺（1839，T.schwann）提出動(dòng)植物都是細(xì)胞的集合物。使細(xì)胞及其功能有了一個(gè)較為明確的定義，確立了“細(xì)胞學(xué)說(shuō)”的基本原則。這時(shí)“細(xì)胞學(xué)說(shuō)”主要內(nèi)容是：（1）細(xì)胞是有機(jī)體，動(dòng)植物都是由細(xì)胞發(fā)育來(lái)的；（2）每個(gè)細(xì)胞都作為一個(gè)相對(duì)的獨(dú)立單位，有自己的“生命”（3）新的細(xì)胞可以通過(guò)老的細(xì)胞繁殖產(chǎn)生。11ppt課件細(xì)胞基本知識(shí)細(xì)胞的基礎(chǔ)知識(shí)1、細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位：細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位，一切機(jī)體均由細(xì)胞構(gòu)成（病毒是非細(xì)胞形態(tài)的生命）。細(xì)胞不僅是機(jī)體的基本形態(tài)機(jī)構(gòu)單位，也是機(jī)體的基本功能單位，機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和進(jìn)化都是以細(xì)胞為基礎(chǔ)。細(xì)胞同時(shí)也是機(jī)體發(fā)生疾病的基礎(chǔ)。2、細(xì)胞的基本共性：構(gòu)成細(xì)胞的基本化學(xué)因素只O、C、H、N、P、S、Ca、K、Fe、Na、Cl、Mg等，他們構(gòu)成細(xì)胞功能與結(jié)構(gòu)所需的許多無(wú)極化合物和各種生物分子。構(gòu)成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基本生物大分子是：核酸、蛋白質(zhì)、脂肪和糖類。這些大分子一般以符合分子形成如核蛋白、脂蛋白、糖蛋白或糖脂等組成細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)。12ppt課件3、細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)在亞顯微結(jié)構(gòu)水平上，細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)大體可以分成三種體系：主要由脂蛋白構(gòu)成的生物膜系統(tǒng)，如細(xì)胞膜、核膜及一系列重要細(xì)胞器如：線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體和液泡等的封閉膜；第二類主要由核酸蛋白成分構(gòu)成的顆粒與顯微結(jié)構(gòu)系統(tǒng)，如染色質(zhì)與核仁基質(zhì)，核蛋白體等；第三類有蛋白質(zhì)構(gòu)成的細(xì)胞骨架（主要是微絲與微管），中心體、紡錘體、纖毛、鞭毛等專門結(jié)構(gòu)。細(xì)胞基本知識(shí)1.核仁2.細(xì)胞核3.核糖體4.囊泡5.粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)6.高爾基體7.細(xì)胞骨架8.滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)9.線粒體10.液泡11.細(xì)胞質(zhì)12.溶酶體13.中心粒13ppt課件4、細(xì)胞作為生命活動(dòng)的基本單位的共同特點(diǎn)：首先所有細(xì)胞表面均有一層脂蛋白成分的生物膜，使細(xì)胞能與周圍環(huán)境保持相對(duì)獨(dú)立性：其次所有細(xì)胞都有兩種核酸，即DNA和RNA作為遺傳信息的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)基礎(chǔ)；第三作作為蛋白質(zhì)合成的“機(jī)器”-核蛋白，是一切細(xì)胞不可缺少的基本結(jié)構(gòu)；第四所有細(xì)胞都是以一分為二的分裂方式增值。第五細(xì)胞具有多樣性，形狀、大小、懸殊很大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度也很不一樣。5、原核細(xì)胞與真核細(xì)胞：這兩種細(xì)胞是根據(jù)進(jìn)化程度與結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度來(lái)劃分的。原核細(xì)胞（Procaryticcell）它沒(méi)有典型的核結(jié)構(gòu)，沒(méi)有核膜，只有一個(gè)比較集中的核區(qū)，其中分布著環(huán)裝DNA絲，細(xì)胞內(nèi)缺少重要細(xì)胞器，但有時(shí)有核蛋白體及游離的質(zhì)粒（plasmid），原核細(xì)胞的繁殖以直接分裂（無(wú)絲分裂）為主，DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)合成同時(shí)連續(xù)進(jìn)行。細(xì)胞基本知識(shí)14ppt課件6、從進(jìn)化角度真核細(xì)胞與原核細(xì)胞有兩點(diǎn)區(qū)別，第一細(xì)胞膜系統(tǒng)的分化與演變不同。真核細(xì)胞以膜系統(tǒng)的分化為基礎(chǔ)，分化成各種重要的細(xì)胞器；第二遺傳信息與遺傳裝置的擴(kuò)增與復(fù)雜化程度不一。真核細(xì)胞（Eucaryoticcell）進(jìn)化程度高，結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜。細(xì)胞基本知識(shí)15ppt課件細(xì)胞周期（細(xì)胞分裂周期）即單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程，指母細(xì)胞分裂后形成的細(xì)胞到下一次再分裂成兩個(gè)子細(xì)胞之間的時(shí)期。細(xì)胞的增殖是生物最根本的特征，細(xì)胞是借助分裂來(lái)進(jìn)行增殖的。通過(guò)細(xì)胞分裂即可將復(fù)制的遺傳物質(zhì)平均地分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。我們進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，實(shí)際是在細(xì)胞群體和個(gè)體的情況下考查細(xì)胞行為的。大部分細(xì)胞群體都由分裂和不分裂兩部細(xì)胞混合組成。而不分裂細(xì)胞又可分為兩類：即保持再進(jìn)入細(xì)胞周期能力的G0期細(xì)胞（或叫靜置細(xì)胞或休止細(xì)胞）及不分裂最終注定要死亡的終止分化細(xì)胞（或稱之終端分化細(xì)胞），他們不能再進(jìn)入周期。進(jìn)入周期內(nèi)的細(xì)胞可以分為兩個(gè)期：間期（G1+S+G2），M期（有絲分裂期），整個(gè)細(xì)胞周期組成是G0+G1+S+G2+M。細(xì)胞基本知識(shí)16ppt課件間期G1期：DNA合成前期或細(xì)胞分裂后期。這一期細(xì)胞代謝比較活躍，RNA，蛋白質(zhì)合成旺盛，為S期的DNA合成做好準(zhǔn)備，此期后階段，中心體會(huì)進(jìn)行分裂。這一期從細(xì)胞生理變化上有一個(gè)矯正點(diǎn)（R點(diǎn)），由于各種內(nèi)外因素的影響，它可能控制G1期的延續(xù)時(shí)間變化，因此G1期的長(zhǎng)短變化極大。S期：DNA合成期，此期結(jié)束DNA會(huì)加倍。早期復(fù)制的DNA富有G-C堿基，晚期復(fù)制的DNA富有A-T堿基。此期DNA合成的同時(shí)，也有組蛋白的合成。G2期：DNA合成后期，分裂前期。有活躍的RNA蛋白質(zhì)合成，DNA含量已加倍，有微管的合成，為M期紡錘絲微管組裝提供原料。17ppt課件M期前期：此期的主要特征是染色質(zhì)濃縮，確定分裂極，核仁解體，核膜消失。DNA分子螺旋化和折疊，雙螺旋縮短，形成染色單體，進(jìn)而變成雙結(jié)構(gòu)，中間有著絲粒相連。此時(shí)中心粒出現(xiàn)，周圍有微管形成的星體，逐漸分離，到相對(duì)應(yīng)位置形成細(xì)胞兩極。中心粒間的微管延長(zhǎng)，形成紡錘體，染色體界于赤道部。中期：進(jìn)入中期的染色體高度濃縮，形成典型中期染色體，部分紡錘體開(kāi)始附著著絲粒上，染色體在赤道面上形成赤道板。后期：染色體開(kāi)始一分為二，幾乎所有的染色體同時(shí)分離，染色體被染色體絲拉向兩極，細(xì)胞也向兩極方向延長(zhǎng)呈橢圓形，最后在赤道部凹下形成啞鈴狀。末期：染色體達(dá)到細(xì)胞兩極，開(kāi)始解螺旋，并形成染色質(zhì)，核膜逐漸形成，核仁出現(xiàn)，胞體逐漸分離，形成兩個(gè)子細(xì)胞，兩個(gè)子細(xì)胞進(jìn)入G1期。18ppt課件單抗基本知識(shí)細(xì)胞基本知識(shí)設(shè)備與器材準(zhǔn)備、溶液配制無(wú)菌技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)凍存、復(fù)蘇19ppt課件一、細(xì)胞常用設(shè)備和器材二氧化塔搖床超凈工作臺(tái)設(shè)備與器材準(zhǔn)備、溶液配制20ppt課件倒置顯微鏡電動(dòng)助吸器程序降溫盒21ppt課件不銹鋼柱式濾器22ppt課件液氮罐細(xì)胞培養(yǎng)板23ppt課件培養(yǎng)基儲(chǔ)存瓶細(xì)胞培養(yǎng)瓶24ppt課件器材的清洗和滅菌不要讓污染了的器皿變干！！清洗的重要性除化學(xué)污染：鹽、油污、蛋白質(zhì)、重金屬等使培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)表面帶負(fù)電荷，供細(xì)胞附著。滅菌的重要性除去微生物污染酸液配方25ppt課件新的玻璃器皿的清洗滅菌自來(lái)水刷洗，除去灰塵。烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5%稀鹽酸中12小時(shí)以除去臟物、鉛、砷等物。刷洗、烘干：泡酸12小時(shí)后立即用自來(lái)水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來(lái)水沖洗干凈后用烤箱烘干。泡酸、清洗：用酸浸泡12小時(shí)，然后從酸缸內(nèi)撈出器皿用自來(lái)水沖洗10次，最后蒸餾水沖洗3-5次。烘干、包裝：移液管和滴管的尾端要塞入棉花。高壓滅菌。烘干備用。26ppt課件使用后的玻璃器皿的清洗滅菌刷洗、烘干：使用過(guò)的玻璃器皿立即用清水刷洗干凈。自來(lái)水浸泡過(guò)夜，泡酸前用自來(lái)水沖洗干凈，烘干。泡酸、清洗：烘干后泡入鹽酸，12小時(shí)后從酸缸內(nèi)撈出器皿立即用自來(lái)水沖洗10次（避免蛋白質(zhì)干后粘附于玻璃上難以清洗），過(guò)蒸餾水3次。烘干、包裝高壓滅菌烘干備用27ppt課件金屬器皿的清洗滅菌金屬器皿不能泡酸，清洗時(shí)可先用洗滌劑刷洗，后用自來(lái)水沖干凈，然后用75%酒精擦拭，再用自來(lái)水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制和內(nèi)包裝好。高壓滅菌，再烘干備用。橡膠和塑料器皿的清洗滅菌刷洗、烘干：使用后立即用清水刷洗干凈。自來(lái)水浸泡過(guò)夜，泡酸前用自來(lái)水沖洗干凈烘干。泡入5%鹽酸過(guò)夜。自來(lái)水沖洗10次，過(guò)蒸餾水3次。烘干高壓蒸汽滅菌烘干備用滴管膠頭可用75%酒精浸泡5分鐘，紫外線照射消毒28ppt課件二、細(xì)胞常用的培養(yǎng)液和試劑培養(yǎng)用液是維持組織細(xì)胞生存、生長(zhǎng)及進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)各項(xiàng)操作過(guò)程中所需的基本溶液。設(shè)備與器材準(zhǔn)備、溶液配制29ppt課件（1）平衡鹽溶液（BSS）BSS又稱生理鹽水或鹽溶液，主要由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖組成。本身具有維持滲透壓，調(diào)控酸、堿度平衡的作用，同時(shí)能共給細(xì)胞生存所需的能量和無(wú)機(jī)離子成分；用作洗滌組織、細(xì)胞及配制各種培養(yǎng)用液的基礎(chǔ)溶液。幾種常用的平衡鹽溶液：Ringer、PBS、Tyrode、Earle、Hank’s、Dulbecco（都有相應(yīng)配方）最簡(jiǎn)單的BSS是Ringer。D-Hank’s與Hank’s的主要區(qū)別在于前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank’s常用于配制胰酶溶液。配制平衡鹽溶液也應(yīng)當(dāng)用新鮮的三蒸水。配好的平衡鹽溶液可以過(guò)濾除菌或高溫高壓滅菌。有渾濁或沉淀時(shí)，應(yīng)重新配制。D-Hank’s30ppt課件（2）培養(yǎng)基培養(yǎng)基就是人工模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，維持細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，他是提供細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好。缺點(diǎn)：來(lái)源受限。成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染。合成培養(yǎng)基根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低。缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。31ppt課件五大常用培養(yǎng)基RPMI1640Dulbecco’sModifiedEaglesMedium（DMEM）MinimumEssentialMedium（MEM）Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium（IMDM）Medium199GBM05：21種氨基酸，8種無(wú)機(jī)鹽，18種微量元素，12種維生素，11種其它營(yíng)養(yǎng)物組成。32ppt課件33ppt課件（3）其它培養(yǎng)用液消化液胰酶溶液：濃度一般為0.1%-0.25%，配制時(shí)要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液。EDTA溶液：一種化學(xué)螯合劑，對(duì)細(xì)胞有一定離散作用，毒性小，使用方便，濃度為0.02%?？膳c胰酶混合使用?？?℃冰箱保存。使用EDTA處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。膠原酶溶液：使用濃度0.1-0.3mg/L或200000U/L，作用最佳pH6.5。膠原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制。膠原酶作用溫和，不易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，但價(jià)格昂貴。谷氨酰胺補(bǔ)充液：合成培養(yǎng)基中的必須成分，但容易降解，所以都是在使用前添加。一般配制成100倍濃縮液-20℃pH調(diào)整液NaHCO3溶液：保證培養(yǎng)基在5%CO2環(huán)境下PH達(dá)到設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。HEPES：一種弱酸，羥乙基哌嗪乙硫磺酸，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，主要是防止培養(yǎng)基pH迅速變化。使用濃度0.01-0.05mol/L?？股厝芤海涸谂囵B(yǎng)液內(nèi)加入適量抗生素，以抑制可能存在的細(xì)菌生長(zhǎng)。青霉素100u/mL、鏈霉素100ug/mL。34ppt課件培養(yǎng)基儲(chǔ)存液體培養(yǎng)基分裝后不可在-20℃下保存；因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的鹽容易析出，而再次融化后，有的鹽可能無(wú)法重新溶解，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分和滲透壓改變，培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，容易細(xì)胞破裂而死亡。培養(yǎng)基開(kāi)瓶后盡快用完，不宜長(zhǎng)時(shí)間保存，因?yàn)闀r(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致液體培養(yǎng)基中鹽分的析出和pH的改變。35ppt課件碳酸氫鈉的作用及含量與CO2一起形成緩沖系統(tǒng)，保持培養(yǎng)基pH值穩(wěn)定；不同的培養(yǎng)基要求添加NaHCO3的量不一樣，如DMEM要求添加3.7g/L，為了保持pH值穩(wěn)定，必須用高濃度的CO2平衡，一般不低于8%，而1640等要求添加NaHCO32.2g/L,還有些培養(yǎng)基要求添加更少，那么這些培養(yǎng)基就要求較低CO2的濃度平衡，一般是5%。HEPES的作用及含量培養(yǎng)基中最常用的Buffersystem是碳酸氫鈉，它可以提供營(yíng)養(yǎng)，但卻在生理pH值條件下會(huì)降低緩沖能力。而HEPES是一種很強(qiáng)的Buffer，加入HEPES能使細(xì)胞培養(yǎng)基在pH7.2-7.6條件下緩沖能力增強(qiáng)；HEPES在培養(yǎng)基中的終濃度通常為35mmol；非必須，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行添加；36ppt課件丙酮酸鈉的作用丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源。但是，如果沒(méi)有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。保證細(xì)胞更好地生長(zhǎng)，但非必須成分。谷氨酰胺的作用幾乎所有的細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺都有較高的要求。谷氨酰胺脫掉氨基后，可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源，參與蛋白質(zhì)的合成和能量代謝。在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)不良而死亡。但同時(shí)L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性；谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，加有谷氨酰胺的液體培養(yǎng)基4℃冰箱儲(chǔ)存兩周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來(lái)的谷氨酰胺；37ppt課件單抗基本知識(shí)細(xì)胞基本知識(shí)設(shè)備與器材準(zhǔn)備、溶液配制無(wú)菌技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)凍存、復(fù)蘇38ppt課件無(wú)菌技術(shù)微生物污染一直是細(xì)胞培養(yǎng)的主要問(wèn)題。39ppt課件細(xì)胞污染的種類細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、真菌、支原體和病毒。污染源無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)操作室環(huán)境不佳污染之血清污染之細(xì)胞細(xì)菌和真菌的污染和鑒別肉眼直接觀察法培養(yǎng)檢查法顯微鏡觀察法40ppt課件細(xì)菌污染細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)的污染最常見(jiàn)的有：大腸桿菌、枯草桿菌、假單胞菌、白色葡萄球菌。培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變渾濁，pH改變。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。真菌污染真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。41ppt課件支原體的污染和鑒別造成支原體高污染的原因：支原體大小0.1-0.8um，無(wú)細(xì)胞壁，可透過(guò)一般過(guò)濾膜（0.22-0.45um）支原體污染時(shí)，沒(méi)有明顯的肉眼或一般光學(xué)顯微鏡可觀察到的特征變化過(guò)去缺乏簡(jiǎn)單、快捷且可靠的檢測(cè)方式細(xì)胞流通間缺乏物品管理，造成實(shí)驗(yàn)室間的相互污染研究和操作人員忽略污染問(wèn)題已受污染的細(xì)胞已受污染的培養(yǎng)基、血清42ppt課件支原體的鑒別方法相差顯微鏡觀察法Hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法DNA熒光染色法PCR方法43ppt課件病毒的污染和鑒別細(xì)胞的直接觀察動(dòng)物接種檢查電子顯微鏡檢查免疫學(xué)檢查PCR技術(shù)44ppt課件無(wú)菌操作總則：任何時(shí)候都要毫不動(dòng)搖的在每一個(gè)操作環(huán)節(jié)都堅(jiān)持高標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)菌技術(shù)！預(yù)防為主！不要讓無(wú)菌程度低的物品沾染無(wú)菌程度高的物品！45ppt課件培養(yǎng)室的滅菌定期打掃培養(yǎng)室：每周打掃一次，用純化水拖地、擦桌子、超凈工作臺(tái)，然后用消毒劑擦拭消毒。CO2搖床：先用0.3%新潔爾滅擦拭，然后用75%酒精擦拭或0.5%過(guò)氧乙酸，再用紫外燈照射。保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈，定期消毒。實(shí)驗(yàn)前：用75%酒精（0.3%新潔爾滅）擦拭超凈臺(tái)、邊臺(tái)、倒置顯微鏡的載物臺(tái)。操作人員的無(wú)菌準(zhǔn)備：肥皂洗手。穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、穿好拖鞋戴乳膠手套，75%酒精擦手。46ppt課件工作面無(wú)菌原則：保持工作面干凈。使用前用75%乙醇充分擦洗工作面，打開(kāi)紫外燈照射30分鐘。盡量少放物品：帶入必須的，移走不必要的。工作臺(tái)面物品整齊有序。實(shí)驗(yàn)完畢后移走所有物品，并徹底擦洗工作面，開(kāi)紫外燈照射30分鐘。47ppt課件凡是帶入超凈工作臺(tái)內(nèi)的物品表面要用消毒劑進(jìn)行外表面消毒。靠近酒精燈火焰操作。玻璃器皿使用前必須過(guò)火滅菌。打開(kāi)和蓋上蓋子前后灼燒瓶頸和蓋口附近。無(wú)菌級(jí)別高的物品不能觸碰無(wú)菌級(jí)別低的物品。手不能從敞開(kāi)的瓶口上方經(jīng)過(guò)。各種操作靠近酒精燈燈，動(dòng)作輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。吸取兩種以上的溶液時(shí)要注意更換吸管，防止交叉污染。無(wú)菌操作48ppt課件手握試管、移液管時(shí)盡量遠(yuǎn)離工作端。盡可能減少開(kāi)蓋時(shí)間隨時(shí)擦去任何溢出物。任何時(shí)候都不要把液體從一個(gè)無(wú)菌容器倒入另一個(gè)無(wú)菌容器。傾倒廢液時(shí)防止濺起和瓶口回流。在視野范圍內(nèi)工作。無(wú)菌思想貫穿到細(xì)胞培養(yǎng)的任何操作步驟。49ppt課件單抗基本知識(shí)細(xì)胞基本知識(shí)設(shè)備與器材準(zhǔn)備、溶液配制無(wú)菌技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)凍存、復(fù)蘇50ppt課件細(xì)胞培養(yǎng)基本概念細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：從體內(nèi)組織取出細(xì)胞模擬體內(nèi)出現(xiàn)環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度及酸堿度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使其生長(zhǎng)繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。原代培養(yǎng)：從體內(nèi)取出組織或細(xì)胞的第一次培養(yǎng)，應(yīng)該定義為首次成功地傳代培養(yǎng)之前的培養(yǎng)為原代培養(yǎng)。傳代：無(wú)論是稀釋，將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)皿中的繼續(xù)培養(yǎng)即稱為傳代或傳代培養(yǎng)，也稱再培養(yǎng)。單層培養(yǎng)：培養(yǎng)細(xì)胞在底物上分裂增殖，平鋪長(zhǎng)成單層細(xì)胞。一方面細(xì)胞可能長(zhǎng)滿培養(yǎng)空間，另一方面細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸抑制，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度逐漸減慢甚至停止。細(xì)胞培養(yǎng)51ppt課件懸浮培養(yǎng)：細(xì)胞或細(xì)胞聚集體懸浮于液體培養(yǎng)基中增殖，這些細(xì)胞無(wú)依賴于貼附底物或支持物上生長(zhǎng)的性質(zhì)。細(xì)胞系：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細(xì)胞系。由原細(xì)胞系分離出具有與原細(xì)胞系不同性狀的細(xì)胞系稱為亞系。細(xì)胞株：通過(guò)選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志，并能穩(wěn)定保持這些特性的培養(yǎng)物為細(xì)胞株。細(xì)胞密度：細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液或細(xì)胞在體外懸浮培養(yǎng)時(shí)，在沒(méi)毫升懸液中所含細(xì)胞數(shù)。代或世代：從細(xì)胞接種到下一次傳代再培養(yǎng)的一段時(shí)間叫一代，作為群體細(xì)胞要經(jīng)游離期、對(duì)數(shù)期與停止期等三個(gè)階段。52ppt課件培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式及類型貼壁生長(zhǎng)型細(xì)胞：必須依附支持物的表面生存的一類細(xì)胞，這類細(xì)胞在體內(nèi)時(shí)多有一個(gè)依附的環(huán)境，形態(tài)附著方式也是多態(tài)性。常見(jiàn)有上皮型細(xì)胞、成纖維型細(xì)胞、游走型細(xì)胞、多形型細(xì)胞。貼壁是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長(zhǎng)發(fā)育的基本存在方式，細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后，同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長(zhǎng)，因而屬于貼壁型細(xì)胞。（1）上皮型細(xì)胞（2）成纖維型細(xì)胞（3）游走型細(xì)胞（4）多形型細(xì)胞53ppt課件懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞：來(lái)源于血液、脾臟、或骨髓細(xì)胞，不依附任何支持物，懸浮于培養(yǎng)液中的單個(gè)或小的細(xì)胞團(tuán)形式生長(zhǎng)54ppt課件培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)上皮型細(xì)胞：易相連成片；想靠-緊密相連-成薄層-鋪路石狀；生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)成纖維型細(xì)胞：排列成放射狀，漩渦狀并不緊靠連成片；細(xì)胞-細(xì)胞接觸易斷開(kāi)而單獨(dú)行動(dòng)；游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞；常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起。55ppt課件多行型細(xì)胞：多形型細(xì)胞是一些形態(tài)上不規(guī)則的細(xì)胞。其細(xì)胞一般分胞體和胞突兩部分。胞突為細(xì)長(zhǎng)形，似絲狀偽足。胞體雖略呈多角形，但沒(méi)有成纖維細(xì)胞型那樣規(guī)則。體外培養(yǎng)中呈現(xiàn)多形型的細(xì)胞最常見(jiàn)的類型是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。游走型細(xì)胞：本型細(xì)胞在支持物上散在生長(zhǎng)，一般不連成片。細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運(yùn)動(dòng)，速度快且不規(guī)則。56ppt課件懸浮型細(xì)胞：培養(yǎng)時(shí)不貼附底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)。在懸浮中生長(zhǎng)良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)。優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便（不需要消化），易于收獲缺點(diǎn)：觀察不方便，純化不方便，不能通過(guò)離心將死活細(xì)胞分離57ppt課件細(xì)胞系生長(zhǎng)過(guò)程原代（初代）培養(yǎng)期：從機(jī)體取下組織培養(yǎng)到第一次傳代。此代細(xì)胞種類較多，維持時(shí)間因細(xì)胞種類不同，一般1-4周。傳代培養(yǎng)期：初代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)到一定程度，即可連接傳代，使其連續(xù)生長(zhǎng)。一般二倍體細(xì)胞，不加附加條件，可傳代30-50代，此時(shí)可發(fā)生染色體丟失、突變、細(xì)胞增殖變慢、停止分裂，進(jìn)入衰退期，我們稱之有限細(xì)胞系。有些細(xì)胞的少數(shù)后代，或通過(guò)人工條件轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可通過(guò)這一期，獲得持久的增殖傳代能力，我們稱無(wú)線細(xì)胞系。細(xì)胞系生長(zhǎng)過(guò)程衰退期：傳代細(xì)胞到達(dá)一定代數(shù)，即發(fā)生增殖緩慢，逐漸停止，進(jìn)而發(fā)生衰退、死亡。這一現(xiàn)象可能說(shuō)明生物學(xué)衰老的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。人胚胎成纖維細(xì)胞可以進(jìn)行60代增殖，而80歲老人的肺成纖維細(xì)胞僅傳代了16代后便死亡。培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程58ppt課件細(xì)胞傳代生長(zhǎng)過(guò)程潛伏期：細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6-24小時(shí)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究停滯期（平臺(tái)期）：細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁（一定細(xì)胞密度）后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制：接觸抑制、密度限制59ppt課件細(xì)胞生長(zhǎng)條件與環(huán)境一、細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需要1、基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：（1）氨基酸：氨基酸是蛋白質(zhì)的基本單位。細(xì)胞培養(yǎng)常需12種氨基酸+谷氨酰胺：異亮氨酸、亮氨酸、胱氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、頡氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸（2）維生素：煙氨酸、葉酸、核黃素、B12、泛酸、吡哆醇、維生素C等（3）碳水化合物：提供細(xì)胞能源主要是葡萄糖。（4）無(wú)機(jī)離子：鈉、鉀、鎂、鈣、磷2、促細(xì)胞生長(zhǎng)因子：種類很多，多因特殊細(xì)胞生長(zhǎng)，或一定目的而加入不同促細(xì)胞生長(zhǎng)因子。3、血清：是細(xì)胞培養(yǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)成分，除含多種細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的成分，血清的作用機(jī)制商在探索。也不應(yīng)忽視血清中對(duì)某些細(xì)胞的有害成分，因此，實(shí)驗(yàn)室的血清要經(jīng)過(guò)篩選。60ppt課件二、細(xì)胞的生存環(huán)境1、溫度：一般的細(xì)胞培養(yǎng)最適溫度為35-37℃。不同動(dòng)物種的細(xì)胞，或經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞也可能由不同的要求。2、氣相及pH：體外細(xì)胞培養(yǎng)需要一定的氣相環(huán)境，一般為95%空氣加5%二氧化碳。大多數(shù)細(xì)胞所需pH在7.2-7.4。但是，細(xì)胞培養(yǎng)最適pH值隨培養(yǎng)的細(xì)胞種類不同而不同。成纖維細(xì)胞喜歡較高pH(7.4-7.7),而傳代轉(zhuǎn)化細(xì)胞系則需要偏低pH(7.0-7.4)。體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞耐酸能力要強(qiáng)于耐堿能力。3、滲透壓：培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)滲透壓有一定的適應(yīng)范圍細(xì)胞通?？赡?60mOsm/kg～320mOsm/kg四、無(wú)污染和無(wú)毒1、細(xì)胞培養(yǎng)中的污染問(wèn)題（1）微生物（細(xì)菌，霉菌，支原體）污染防治（2）實(shí)驗(yàn)室中細(xì)胞交叉污染2、無(wú)毒：凡與細(xì)胞接觸的器材、培養(yǎng)基均應(yīng)保持無(wú)任何細(xì)胞毒性。細(xì)胞生長(zhǎng)條件與環(huán)境61ppt課件單抗基本知識(shí)細(xì)胞基本知識(shí)設(shè)備與器材準(zhǔn)備、溶液配制無(wú)菌技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)凍存、復(fù)蘇62ppt課件細(xì)胞計(jì)數(shù)方法1、設(shè)備儀器自動(dòng)計(jì)數(shù)法設(shè)備計(jì)數(shù)速度快，準(zhǔn)確度高，偏差小等特點(diǎn)2、細(xì)胞計(jì)數(shù)版計(jì)數(shù)法細(xì)胞計(jì)數(shù)版計(jì)數(shù)速度慢，準(zhǔn)確度低，偏差大，誤差大。63ppt課件細(xì)胞計(jì)數(shù)操作1、制備單細(xì)胞懸液，取一小部分（500ul）至1.5ml取樣管中，加入等體積0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液。2、75%酒精清洗計(jì)數(shù)版表面，注意不要?jiǎng)潅?jì)數(shù)表面。將已染色待細(xì)胞懸液吹打均勻，然后用移液器吸取20ul細(xì)胞懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，液體剛好流到計(jì)數(shù)版凹槽邊緣。注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。3、將計(jì)數(shù)版平放在顯微鏡載物臺(tái)上計(jì)數(shù)。64ppt課件統(tǒng)計(jì)角上四個(gè)大格的活細(xì)胞數(shù)。對(duì)于壓線細(xì)胞的處理：數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右，細(xì)胞團(tuán)按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)。計(jì)算結(jié)果：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml=（四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)之和/4）*104*265ppt課件細(xì)胞計(jì)數(shù)的注意事項(xiàng)1、制備單細(xì)胞懸液。不可有較多成團(tuán)細(xì)胞。2、取樣均勻。多次取樣計(jì)數(shù)取平均值。3、細(xì)胞密度：每mm