原生質體制備和轉化

原生質體制備和轉化第一頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo培養(yǎng)基成分高滲溶液（有機/無機）緩沖液的pH（5.8-7.4）酶解條件（時間/各種酶的比例）酶液用高鹽還是高滲緩沖液配擦鏡紙收集菌絲體or離心收集菌絲體雙層or單層培養(yǎng)基第二頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo《微生物學實驗教程》周德慶（酵母）1、接種于液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。2、取培養(yǎng)液10ml，4000r/min離心5min,棄上清液，用Tris-HCl(pH7.4)、0.5mol/LEDTA、高滲緩沖液各洗滌一次。3、用含10mmol/L巰基乙醇的高滲緩沖液稀釋裂解酶液。4、加酶液，100r/min搖床50-100min酶解。脫壁效果達70%左右即停止酶解。5、100r/min離心三分鐘，去沉淀，取上清。再2000r/min離心10min收集沉淀原生質體。6、高滲緩沖液洗滌2次，2000r/min離心10min收集原生質體，最終用1ml高滲緩沖液懸浮原生質體。高滲緩沖液：蔗糖0.5mol/L,MgCl210mmol/L,Tris-HCl(pH7.4)10mmol/L第三頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo1、原生質體混合、PEG助融2、雙層平板：底層10ml的固體培養(yǎng)基（1.2%瓊脂），將樣品加入5ml融化后的半固體培養(yǎng)基（0.6%瓊脂，預保溫42℃）中，快速混合，導入鋪有底層培養(yǎng)基的平板上。待上層凝固后，置于恒溫箱培養(yǎng)第四頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo《工業(yè)微生物育種學》施巧琴吳松剛*菌絲培養(yǎng)基：1、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基2、PDA培養(yǎng)基（一種普遍用于酵母菌和霉菌計數培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，被推薦用于各類食品和飲料中酵母菌和霉菌檢測和計數）3、査氏培養(yǎng)基（用于真菌的分離鑒定，霉菌、白色念珠菌、酵母等微生物）*再生培養(yǎng)基：同查氏培養(yǎng)基，其中含NaCl濃度為0.8mol/L第五頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo*緩沖液：pH5.8-6.8磷酸氫二鈉-檸檬酸溶液*高滲溶液：0.6mol/LNaCl溶液*酶溶液：蝸牛酶、纖維素酶，用0.7mol/L的NaCl配制，G6砂芯漏斗抽濾除菌第六頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo取107個/mL的單孢子懸浮液，涂布于平板表面的玻璃紙上，培養(yǎng)后用無菌鑷子將培養(yǎng)菌絲體的玻璃紙轉移并倒復在已配好的酶液內，輕輕抖動玻璃紙，菌絲體散落在酶液中，然后去玻璃紙，酶解，定時取樣觀察。（該法收集的菌絲體會十分干凈，免去了洗滌、離心等手續(xù)，減少對菌絲的傷害和雜菌污染）酶解1-2h，將培養(yǎng)皿內破碎菌絲體和原生質體混合液用吸管吹吸數次，用G2或G3砂芯漏斗過濾，使原生質體同菌絲體碎片分開，濾液1500-2000r/min離心10min，洗滌去上清，懸浮于同一高滲溶液中。再將含有原生質體的濾液用再生培養(yǎng)基洗滌三次，以清除酶液，然后用保存液懸浮。血球計數板計數，冷藏備用。雙層平板，再生，計算原生質體再生率。第七頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo林艷學姐：挑AspergillusoryzaeP5菌絲于葡萄糖-蛋白胨斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)6~7天，至孢子成黃綠色取新鮮培養(yǎng)的斜面7支，用20mL無菌水洗下成熟孢子于鋪滿玻璃珠的三角瓶中，置搖床上150r/min振蕩分散30min經四層無菌鏡頭紙過濾，制成孢子濃度約為107個/mL的單孢子懸浮液將上述制得的孢子懸浮液每1mL接種于一瓶盛有50mL菌絲培養(yǎng)基的三角瓶中，于30℃靜止培養(yǎng)23~25h6000r/min，離心10min收集幼嫩的菌絲體用無菌水洗滌菌絲體，4000r/min，離心5min收集菌絲體用PBA溶液洗滌菌絲體兩次，每次4000r/min，離心5min收集菌絲體第八頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo以0.15g濕菌體用酶量1mL的比例，加入酶液，置于滅菌平板中置33℃搖床上80r/min振蕩酶解，每半小時取樣，在顯微鏡下觀察原生質體的釋放情況待酶解完全后，加等體積1mol/L山梨醇溶液，用四層無菌鏡頭紙過濾，除去未酶解的菌絲體殘片，收集原生質體液4000r/min室溫離心10min，收集原生質體沉淀去上清，沉淀用1mol/L山梨醇溶液洗滌2次，每次4000r/min離心10min棄上清將原生質體懸浮于5mL1mol/L山梨醇溶液中，-70℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆玫诰彭?，共二十一頁，編輯?023年，星期二CompanyLogo將制備好的原生質體溶液3200r/min，4℃離心10min；棄上清，沉淀重懸于預冷的STC溶液中，將原生質體濃度調整為5×106~5×107個細胞/mL；將約2~5μg質粒DNA(體積不超過10μL)與100μL米曲霉原生質體置冰上輕輕混勻；加入25μLPTC溶液，冰浴20min；加入1mLPTC溶液，室溫放置15min；最后加入2mLSTC溶液，混勻。將適量上述轉化液涂布于高滲再生基本培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5~7天，所長出的菌落即為轉化成功的菌株；同時設置未加質粒而轉化的原生質體涂布平板作為陰性對照。第十頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo菌絲培養(yǎng)基葡萄糖含量為0.5%的葡萄糖-蛋白胨完全培養(yǎng)基。高滲再生培養(yǎng)基以1.2mol/LSorbitol（山梨糖醇）配制的葡萄糖-蛋白胨基本固體培養(yǎng)基。0.2mol/L磷酸緩沖液（pH6.0）：0.2mol/LNaH2PO4·2H2O（約240mL）和0.2mol/LNa2HPO4·12H2O（約60mL）混合至pH為6.0第十一頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo混合酶液：2%纖維素酶，1%蝸牛酶，5mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）用pH6.0的含0.4mol/LNH4Cl的0.2mol/L磷酸緩沖液配置混合酶液，經0.45μm微孔濾膜過濾除菌，保存于4℃PTC溶液：25%PEG8000，50mmol/LCaCl2，10mmol/LTris-HCl(pH7.5)STC溶液：1.2mol/LSorbitol，50mmol/LCaCl2，10mmol/LTris-HCl(pH7.5)第十二頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo1.米曲霉C-2在2%G-P斜面培養(yǎng)6天至長出孢子，滅菌去離子水洗下孢子，經四層擦鏡紙過濾制成孢子懸液，接種于50mL0.5%G-P菌絲全培養(yǎng)基，30℃靜置培養(yǎng)23~25h；2.過濾收集菌體，用無菌水與0.8MNaCl各洗滌一次；3.菌體置于滅菌培養(yǎng)皿中，加入15ml酶解液（2%纖維素酶、1%蝸牛酶、3mMDTT）；4.置30℃搖床（80r/min）酶解3h左右，在顯微鏡下觀察原生質體的釋放情況；5.酶解完全后，四層擦鏡紙過濾，除去未酶解菌絲，離心收集原生質體；6.用0.8MNaCl洗滌二次，0.8MNaCl-50mMCaCl2

洗滌一次；7.棄上清原生質體重懸于100μL0.8MNaCl-50mMCaCl2中，血球板計數。王金良學長：第十三頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo1、將構建的pMD-pyrG質粒與100μL原生質體置冰上輕輕混勻；加入25μL預冷PTC，冰浴30min；2、再加入500μL上述PTC溶液，平靜混勻，室溫20min；加入預冷1mL0.8MNaCl-50mMCaCl2，混勻；3、與100mL米曲霉高滲再生培養(yǎng)基混合，倒平板；30℃培養(yǎng)4-7天。第十四頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo培養(yǎng)基成分高滲溶液（有機/無機）緩沖液的pH（5.8-7.4）酶解條件（時間/各種酶的比例）酶液用高鹽還是高滲緩沖液配擦鏡紙收集菌絲體or離心收集菌絲體雙層or單層培養(yǎng)基第十五頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo取培養(yǎng)20h的康氏木霉菌絲體懸液10mL，4000r/min離心30min收集菌絲體，用無菌水4000r/min離心30min洗滌2次，加2.0%蝸牛酶溶液30℃水浴酶解至原生質體形成率接近100%時停止酶解，用0.6mol/LNaCl5min條件下離心洗滌2次，最后將原生質體懸于0.6mol/LNaCl溶液中。在原生質體制備過程中每隔一定時間取酶解液制成水封片于顯微鏡下觀察。第十六頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo取原生質體懸液1mL與5mL上層再生培養(yǎng)基混勻，傾倒于下層再生培養(yǎng)基平板上，待培養(yǎng)基凝固后于28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。用下式計算再生率：再生率（%）=（A-B）/C×100%式中：A為經高滲溶液稀釋的原生質體在再生培養(yǎng)基上長出的菌落數；B為經無菌水稀釋的原生質體在再生培養(yǎng)基上長出的菌落數；C為顯微鏡下計數的原生質體數。第十七頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo培養(yǎng)時間22h酶種類和濃度單一蝸牛酶，3%酶解時間2.5h酶解溫度36℃滲透壓穩(wěn)定劑無機鹽溶液有利于原生質體的釋放，而糖醇類不利于原生質體釋放（NaCl）原生質體制備第十八頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo原生質體再生酶種類和濃度單一蝸牛酶，2%酶解溫度30℃滲透壓穩(wěn)定劑糖﹑醇類有利于原生質體的再生而無機鹽類物質不利于再生（蔗糖）再生培養(yǎng)基中蔗糖濃度0.8mol/L康氏木霉原生質體制備的最適菌齡為22h，蝸牛酶濃度為2.0%，酶解溫度為30℃，酶解時間為2.5h，蝸牛酶溶液中的滲透壓穩(wěn)定劑為0.6mol/LNaCl，再生培養(yǎng)基中的滲透壓穩(wěn)定劑為0.8mol/L蔗糖第十九頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期二CompanyLogo菌絲體培養(yǎng)60h,用1.5%溶菌酶+0.5%蝸牛酶混合酶液,pH值6.0～