吸光光度分析法

吸光光度分析法第一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二吸光光度法：分子光譜分析法的一種，又稱分光光度法，屬于分子吸收光譜分析方法基于外層電子躍遷10.1概述吸收光譜發(fā)射光譜散射光譜分子光譜原子光譜第二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二10.2吸光光度法基本原理1

吸收光譜產(chǎn)生的原因光:一種電磁波,波粒二象性

光譜名稱波長范圍X射線0.1~10nm遠紫外光10~200nm近紫外光200~400nm可見光400~750nm近紅外光0.75~2.5um中紅外光2.5~5.0um遠紅外光5.0~1000um微波0.1~100cm無線電波1～1000m當光子的能量與分子的E匹配時，就會吸收光子

E=hu=hc/l第三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二原子光譜為線光譜分子光譜為帶光譜電子躍遷能級分子振動能級分子轉(zhuǎn)動能級第四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二物質(zhì)的顏色吸收光顏色波長范圍(l,nm)黃綠黃橙紅紫紅紫藍綠藍藍綠紫藍綠藍藍綠綠黃綠黃橙紅400-450450-480480-490490-500500-560560-580580-600600-650650-7502物質(zhì)顏色和其吸收光關(guān)系互補色第五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二吸收光譜曲線：物質(zhì)在不同波長下吸收光的強度大小

A～l關(guān)系最大吸收波長lmax：光吸收最大處的波長3一些基本名詞和概念lmax對比度(Δl):絡(luò)合物最大吸收波長(lMRmax)與試劑最大吸收波(lRmax)之差Δl第六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二4朗伯-比爾定律光吸收定律－朗伯-比爾(Lambert-Beer)定律吸光光度法的理論依據(jù)，研究光吸收的最基本定律I0=Ir+It+IaI0=It+IaI0IrItIa

T=It/I0,T:透射比或透光度A=lg(I0/It)＝lg(1/T),A:吸光度朗伯定律（1760年）：光吸收與溶液層厚度成正比比爾定律（1852年）：光吸收與溶液濃度成正比第七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二當一束平行單色光垂直照射到樣品溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度及光程（溶液的厚度）成正比關(guān)系－－－朗伯比爾定律－－－光吸收定律數(shù)學(xué)表達：A＝lg(1/T)=Kbc其中，A:吸光度，T:透射比，K:比例常數(shù)，b:溶液厚度，c:溶液濃度注意：平行單色光均相介質(zhì)無發(fā)射、散射或光化學(xué)反應(yīng)第八頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二摩爾吸光系數(shù)e靈敏度表示方法A=e

bcA=Kbcc:mol/Le

表示物質(zhì)的濃度為1mol/L,液層厚度為1cm時溶液的吸光度。單位：

(L?mol-1?cm-1)c:g/LA=abca:吸光系數(shù)第九頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二桑德爾(Sandell)靈敏度：S當儀器檢測吸光度為0.001時，單位截面積光程內(nèi)所能檢測到的吸光物質(zhì)的最低含量。單位：mg/cm2

S=M/e

第十頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二氯磺酚S測定鋼中的鈮50ml容量瓶中有Nb30μg，用2cm比色池，在650nm測定光吸收，A＝0.43,求S.(Nb原子量92.91)。有兩種做法：根據(jù)A=εbC,求ε＝3.3×104L·mol-1·cm-1

第十一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二吸光度的加和性A1=e1bc1A2=e2bc2A

=e1bc1+e2bc2

根據(jù)吸光度的加和性可以進行多組分的測定以及某些化學(xué)反應(yīng)平衡常數(shù)的測定在某一波長，溶液中含有對該波長的光產(chǎn)生吸收的多種物質(zhì)，那么溶液的總吸光度等于溶液中各個吸光物質(zhì)的吸光度之和第十二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二1分光光度計的組成光源單色器樣品池檢測器讀出系統(tǒng)10.3吸光光度計第十三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二常用光源光源波長范圍(nm)適用于氫燈185~375紫外氘燈185~400紫外鎢燈320~2500可見，近紅外鹵鎢燈250~2000紫外，可見，近紅外氙燈180~1000紫外、可見（熒光）能斯特?zé)?000~3500紅外空心陰極燈特有原子光譜激光光源特有各種譜學(xué)手段第十四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二單色器作用:產(chǎn)生單色光常用的單色器：棱鏡和光柵樣品池（比色皿）

厚度(光程):0.5,1,2,3,5…cm

材質(zhì)：玻璃比色皿－－可見光區(qū)石英比色皿－－可見、紫外光區(qū)第十五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二檢測器

作用：接收透射光，并將光信號轉(zhuǎn)化為電信號常用檢測器：光電管光電倍增管光二極管陣列光電管分為紅敏和紫敏，陰極表面涂銀和氧化銫為紅敏，適用625－1000nm波長；陰極表面涂銻和銫為紫敏，適用200－625nm波長第十六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二目視比色法—比色管光電比色法—光電比色計

光源、濾光片、比色池、硒光電池、檢流計分光光度法與分光光度計722型分光光度計光學(xué)系統(tǒng)圖1.光源；2.濾光片；3,8聚光鏡4,7.狹縫；5.準直鏡；6.光柵9.比色池；10.光電管第十七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二10.4顯色反應(yīng)及影響因素要求：a.選擇性好b.靈敏度高(ε>104)c.產(chǎn)物的化學(xué)組成穩(wěn)定d.化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定e.反應(yīng)物和產(chǎn)物有明顯的顏色差別(l>60nm)沒有顏色的化合物，需要通過適當?shù)姆磻?yīng)定量生成有色化合物再測定－－顯色反應(yīng)1顯色反應(yīng)第十八頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二絡(luò)合反應(yīng)氧化還原反應(yīng)2顯色反應(yīng)類型第十九頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二離子締合反應(yīng)成鹽反應(yīng)第二十頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二褪色反應(yīng)

Zr(IV)-偶氮胂III絡(luò)合物測定草酸吸附顯色反應(yīng)

達旦黃測定Mg(II),Mg(OH)2吸附達旦黃呈紅色第二十一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二3顯色劑無機顯色劑:過氧化氫，硫氰酸銨，碘化鉀有機顯色劑：偶氮類：偶氮胂III第二十二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二三苯甲烷類三苯甲烷酸性染料鉻天菁S三苯甲烷堿性染料結(jié)晶紫第二十三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二鄰菲羅啉類：新亞銅靈肟類：丁二肟第二十四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二4多元絡(luò)合物混配化合物Nb-5-Br-PADAP-酒石酸V-PAR-H2O離子締合物

AuCl4--羅丹明B金屬離子-配體-表面活性劑體系Mo-水楊基熒光酮-CTMAB第二十五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二5影響因素a溶液酸度（pH值及緩沖溶液）影響顯色劑的平衡濃度及顏色，改變Δl影響待測離子的存在狀態(tài)，防止沉淀影響絡(luò)合物組成第二十六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二b顯色劑的用量稍過量，處于平臺區(qū)c顯色反應(yīng)時間針對不同顯色反應(yīng)確定顯示時間顯色反應(yīng)快且穩(wěn)定；顯色反應(yīng)快但不穩(wěn)定；顯色反應(yīng)慢，穩(wěn)定需時間；顯色反應(yīng)慢但不穩(wěn)定d顯色反應(yīng)溫度加熱可加快反應(yīng)速度，導(dǎo)致顯色劑或產(chǎn)物分解第二十七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二e溶劑f干擾離子有機溶劑，提高靈敏度、顯色反應(yīng)速率消除辦法：提高酸度，加入隱蔽劑，改變價態(tài)選擇合適參比選擇適當波長第二十八頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二10.5光度分析法的設(shè)計1.選擇顯色反應(yīng)2.選擇顯色劑3.優(yōu)化顯色反應(yīng)條件4.選擇檢測波長5.選擇合適的濃度6.選擇參比溶液7.建立標準曲線測量條件選擇第二十九頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二1測定波長選擇選擇原則：“吸收最大，干擾最小”靈敏度選擇性第三十頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二2測定濃度控制控制濃度吸光度A：0.2～0.8減少測量誤差第三十一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二3參比溶液選擇儀器調(diào)零消除吸收池壁和溶液對入射光的反射扣除干擾試劑空白試樣空白褪色空白第三十二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二參比溶液的選擇方法：（1）如果僅所測物質(zhì)有吸收，其它試劑均無吸收，則可用純?nèi)軇┳鰠⒈热芤?；?）如果顯色劑或其它試劑略有吸收，應(yīng)用空白溶液（不加試樣溶液）做參比溶液；（3）如果試樣中其它組分有吸收，但不與顯色劑反應(yīng)，則當顯色劑無吸收時，可用試樣溶液做參比溶液；當顯色劑略有吸收時，或干擾離子也與顯色劑反應(yīng)時，可在試液中加入掩蔽劑后再加顯色劑，以此溶液作為參比。第三十三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二4標準曲線制作理論基礎(chǔ)：朗伯-比爾定律相同條件下測定不同濃度標準溶液的吸光度AA～c作圖第三十四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二10.6吸光光度法的誤差非單色光引起的偏移物理化學(xué)因素：非均勻介質(zhì)及化學(xué)反應(yīng)吸光度測量的誤差

對朗伯-比爾定律的偏移第三十五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二1非單色光引起的偏移復(fù)合光由l1和l2組成，對于濃度不同的溶液a和b,引起的吸光度的偏差不一樣，濃度大，復(fù)合光引起的誤差大，故在高濃度時線性關(guān)系向下彎曲。第三十六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二非均勻介質(zhì)

膠體，懸浮、乳濁等對光產(chǎn)生散射，使實測吸光度增加，導(dǎo)致線性關(guān)系上彎2物理化學(xué)因素離解、締合、異構(gòu)等如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42-PAR的偶氮－醌腙式化學(xué)反應(yīng)第三十七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二吸光度標尺刻度不均勻3吸光度測量的誤差A(yù)＝0.434

，T＝36.8%時，測量的相對誤差最小A=0.2~0.8,T=15~65%，相對誤差<4%

dc/c=dA/A=dT/TlnTEr=dc/c×100％=dA/A×100％=dT/TlnT×100％第三十八頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二令ST=0.01,計算T不同值時的Sc/c，當TlnT對T進行微分時，其值為零時，Sc/c最小，此時T=0.368。第三十九頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二1.示差吸光光度法目的：提高光度分析的準確度和精密度解決高(低)濃度組分(i.e.A在0.2~0.8以外)問題分類：高吸光度差示法、低吸光度差示法、 精密差示吸光度法特點：以標準溶液作空白原理：A相對=A=bcx-bc0=bc準確度：讀數(shù)標尺擴展,相對誤差減少,

c0愈接近cx,準確度提高愈顯著10.7常用的吸光光度法第四十頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二例：硫脲還原－硫氰酸鹽比色法測定鋼鐵中的鉬。酸溶，硫酸－高氯酸介質(zhì)中，硫脲還原鐵（III）為鐵(II),除干擾，還原鉬（VI）為五價，2.00mg/100ml的鉬標準溶液為參比溶液，用2.00-2.30mg/100ml的鉬標準溶液，繪制工作曲線和測定樣品溶液的吸光度,480nm測定A。第四十一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二2.雙波長吸光光度法目的：解決渾濁樣品光度分析消除背景吸收的干擾多組分同時檢測原理：A=Al1-Al2=（l1-l2）bc波長對的選擇：等吸光度點法第四十二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二選l1為參比波長,l2為測量波長得Al1=xl1bcx+

yl1bcyAl2=

xl2bcx+

yl2bcyΔA=Al2-Al1=(

xλ2bcx+

yl2bcy)-(

xl1bcx+

yl1bcy)在等吸光度的位置(G,F),

yl2＝

yl1，則上式成為

ΔA=(

xl2-

xl1）bcxΔA與cx成正比,可用于測定例,苯酚與2,4,6-三氯苯酚(y)混合物中苯酚(x)的雙波長分光光度法測定。第四十三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二3.導(dǎo)數(shù)吸光光度法目的：提高分辨率去除背景干擾

原理：dnA/dln~l

第四十四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二10.8吸光光度法的應(yīng)用1測定弱酸和弱堿的離解常數(shù)

AHB和AB-分別為有機弱酸HB在強酸和強堿性時的吸光度，它們此時分別全部以[HB]或[B-]形式存在。HB＝H++B-