毛細管電泳課件

毛細管電泳第四組：

周毅

龍城

陳欣Contents一、概述二、經(jīng)典電泳分析三、毛細管電泳分析法毛細管電泳，又叫高效毛細管電泳（HPCE），是八十年代問世的一種高效的液相分離方法，是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物。毛細管電泳有六種不同的分離形式可供選擇，具有分析時間短，分離效率高等特點。廣泛用于分離多種化合物，如氨基酸、糖類、維生素、神經(jīng)遞質(zhì)、DNA片段等。毛細管電泳在食品分析、藥物分析和生命科學等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

二、經(jīng)典電泳分析

利用電泳現(xiàn)象對某些化學或生物物質(zhì)進行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳；按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳；傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。三、高效毛細管電泳分析高效毛細管電泳在技術(shù)上采取了兩項重要改進：1、采用了內(nèi)徑在25~100μm，外徑300~400μm的毛細管2、采用了高達數(shù)千伏的電壓（1）毛細管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場電壓可以很高（2）電壓升高，電場推動力大，又可進一步使柱徑變小，柱長增加（3）高效毛細管電泳的柱效遠高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達幾十萬塊/米，特殊柱子可以達到數(shù)百萬1、毛細管電泳基本原理

毛細管電泳中，帶電粒子的運動受到兩種作用：電泳和電滲。電泳是指溶液中帶電粒子(離子、膠團)在電場中定向移動的現(xiàn)象，是驅(qū)動毛細管中電解質(zhì)運動的一種作用力。電滲是在電場的作用下，毛細管中的溶液表層聚集的正電荷向負極運動的現(xiàn)象。（1）分離過程電場作用下，毛細管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。帶電粒子的遷移速度=電泳+電滲流；兩種速度的矢量和。正離子：兩種效應(yīng)的運動方向一致，在負極最先流出；中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；陰離子：兩種效應(yīng)的運動方向相反。ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負極最后流出。（2）遷移速度當帶電離子以速度ν在電場中移動時，受到大小相等、方向相反的電場推動力和平動摩擦阻力的作用。電場力：FE=qE阻力：F=fν

故：qE=fνq—離子所帶的有效電荷；E—電場強度；ν—離子在電場中的遷移速度；f—平動摩擦系數(shù)(對于球形離子：f=6πηγ；γ—離子的表觀液態(tài)動力學半徑；η—介質(zhì)的粘度；)

（3）電滲流現(xiàn)象液體兩端施加電壓時，會發(fā)生液體相對于固體表面的移動，這種液體相對于固體表面的移動的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。電滲是CE中推動流體前進的驅(qū)動力，它使整個流體像一個塞子一樣以均勻的速度向前運動，使整個流型呈近似扁平型的“塞式流”。它使溶質(zhì)區(qū)帶在毛細管內(nèi)原則上不會擴張。電滲現(xiàn)象中整體移動著的液體叫電滲流。電滲流的大小用電滲流速度V電滲流表示，取決于電滲淌度μ和電場強度E。V電滲流=μE電滲流的方向取決于毛細管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)：內(nèi)表面帶負電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；內(nèi)表面帶正電荷，溶液帶負電荷，電滲流流向陽極Eg：石英毛細管；帶負電荷，電滲流流向陰極；2、高效毛細管電泳分離模式

毛細管區(qū)帶電泳(CZE)1

毛細管凝膠電泳(CZE)2膠束電動毛細管色譜（MEKC）3

毛細管等速電泳（CITF）5毛細管等電聚焦(CIEF)4毛細管電色譜（CEC）6

毛細管區(qū)帶電泳（CZE）CZE是使用裸毛細管和真溶液性質(zhì)的電解質(zhì)緩沖溶液進行的毛細管電泳技術(shù)，是毛細管電泳中應(yīng)用最廣泛、最基本的一種分離模式。分離機理是基于各被分離組分的荷質(zhì)比之間的差異。通常把CZE看成其他各種毛細管電泳分離模式的母體。應(yīng)用范圍包括氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、離子、對映體拆分和很多其他本身能帶電或在一定條件下能帶上電荷物質(zhì)的分離。

毛細管凝膠電泳（CGE）CGE是以凝膠或高濃度線性高分子溶液為介質(zhì)填充在毛細管內(nèi)而進行的電泳。被分析組分因電泳而遷移，在遷移過程中依據(jù)分子的大小在起“分子篩”作用的凝膠中得以分離。特點：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。因為蛋白質(zhì)、DNA等的電荷/質(zhì)量比與分子大小無關(guān)，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離，所以是DAN排序的重要手段。

膠束電動毛細管色譜（MEKC）MEKC采用臨界膠束濃度以上的表面活性劑在運行緩沖液內(nèi)形成疏水內(nèi)核、外部帶負電的動態(tài)膠束假固相，利用溶質(zhì)的疏水性差異，在溶液和膠束假固相間分配的差異進行分離。不僅能分離中性溶質(zhì)，而且能分離帶電組分。此表有助于根據(jù)樣品的物化性質(zhì)選擇合適的電泳模式。3、高效毛細管電泳的特點1.儀器簡單、易自動化電源、毛細管、檢測器、溶液瓶2.分析速度快、分離效率高在3.1min內(nèi)分離36種無機及有機陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種陽離子；柱效常?？蛇_105-106理論塔極數(shù)/米；3.操作方便、消耗少進樣量極少，每次進樣的體積僅為1mL10nL4.應(yīng)用范圍極廣分子生物學、醫(yī)學、藥學、化學、環(huán)境保護、材料等4、毛細管電泳的應(yīng)用①

藥物分析②手性化合物分析③離子分析④核酸分析及DNA測序⑤毛細管電泳—電化學發(fā)光

分離檢測技術(shù)⑥毛細管電泳離子色譜檢測離子①藥物分析

CE對藥物及其制劑的成分分析，主要用于新藥研究和開發(fā)、藥品生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制、藥物制劑分析等。采用毛細管區(qū)帶電泳方式，在11min內(nèi)分離17種藥物；eg：采用MEKC模式，鑒定違禁藥物；效果優(yōu)于HPLG法。②手性化合物分析合成獲得單一手性化合物相當困難，檢測分析更是相當困難；HPCE分離分析手性化合物的方法：加入手性選擇劑；常用手性選擇劑：環(huán)糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性劑（氨基酸衍生物、低聚糖等天然手性表面活性劑）③離子分析陽離子分析：遷移方向和電滲流方向一致；4.5min內(nèi)分離了24種金屬離子陽極進樣，陰極檢測；具有很高的靈敏度；陰離子分析：陰離子電泳方向和電滲流方向相反、速度接近；分析時間長、效率低；陰極進樣，陽極檢測；但是質(zhì)量小、電荷密度大的離子如SO4-2、F-等，電泳速率大于電滲流，陽極端流出，在陰極端無法檢測；可加入電滲流改性劑，十六烷基三甲基溴化胺等，使電泳方向和電滲流方向一致，可在3.1min內(nèi)分離36種陰離子。

④核酸分析及DNA測序CZE和MECC通常用來分離堿基、核苷、核苷酸、簡單的寡核苷酸等。CGE則可用于寡核苷酸(>10mers)、ssDNA和dsDNA等的分離。人類基因組計劃所需解決的關(guān)鍵問題之一就是提高測序的速度。如用短寡核苷酸引物庫測DNA序列、高速DNA序列、毛細管陣列、毛細板陣列等。對DNA分析是CE的應(yīng)用重點之一，CE-MS聯(lián)用也已用于DNA分析。

⑤毛細管電泳—電化學發(fā)光分離檢測技術(shù)

Ru(bpy)32+ECL技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于CE，簡稱CE-ECL。主要用來檢測胺類化合物操作簡單、靈敏度高、分離效率高、分析速度快以及試劑消耗少等。CE-ECL主要有四種模式：毛細管區(qū)帶電泳-ECL(CZE-ECL)，膠束電動色譜-ECL(MEKC-ECL)，毛細管電色譜-ECL(CEC-ECL)非水毛細管電泳-ECL(NACE-ECL)。⑥毛細管電泳離子色譜檢測離子傳統(tǒng)的毛細管電泳法主要用于檢測有機大分子和蛋白質(zhì)的分離，難以檢測沒有紫外吸收的無機離子。

①分離能力強。傳統(tǒng)離子色譜柱內(nèi)徑4-5mm，而毛細管電泳離子色譜柱的內(nèi)徑為5-500μm，其理論踏板數(shù)為每米幾十萬到上百萬，遠高于傳統(tǒng)離子色譜。②分離速度快。通常在幾分鐘內(nèi)即可分離完全，而常規(guī)離子色譜分析一般需要幾十分鐘。③操作簡便、費用低。毛細管的價格遠遠低于離子色譜柱的價格。④進樣量小。一般小于100nL，而傳統(tǒng)離子色譜則需10-15uL5、毛細管電泳的前景展望1、微型化

毛細管電泳可以實現(xiàn)微型化，整體化學分析系統(tǒng)（TAS）及TAS微型化。2、聯(lián)用儀器

將毛細管電泳-質(zhì)譜技術(shù)（CE-MS）結(jié)合起來。3、陣列毛細管凝膠電泳

一個新的進展方向，目前最有效的DNA序列分析儀，若用100支毛細管陣列電泳，速度可達到280堿基對/小時/支。5、毛細管電泳的前景展望4、微全分析(μ-TAS)

使得集成毛細管電泳技術(shù)(ICEC)延伸了毛細管電泳的潛力和可行性。5、CE分析微生物

通過改變微生物的生存環(huán)境來改變細菌的表面特征,借助CE方法