實驗二血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

實驗二血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳第一頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二實驗目的1、掌握電泳法分離蛋白質的原理2、學習醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質的原理和操作方法3、學習蛋白質染色的方法第二頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二分離蛋白質的方法分離方法沉淀法鹽析法有機溶劑沉淀法層析法電學法電泳法等電聚焦超速離心法離子交換層析吸附層析凝膠過濾（分子篩）親和層析第三頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二實驗原理

電泳：是指帶電粒子在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。在一定pH條件下，不同的蛋白質由于具有不同的等電點而帶不同性質的電荷，因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也不同，即它們的電泳遷移率不同，因此，可對它們進行分離。第四頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二以蛋白質為例：H＋OH－H＋OH－pH>pIpH=pIpH<pI第五頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二影響電泳遷移率的因素：

1、內在因素：蛋白所帶凈電荷的性質和電荷的量、蛋白的大小和形狀

2、外界因素：電場強度、溶液的pH值、溶液的離子強度和電滲現(xiàn)象常見的電泳有：

1、醋酸纖維膜電泳、

2、聚丙烯酰胺凝膠電泳、

3、毛細管電泳第六頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二負極正極－－－－－－－－表面帶負電荷帶正電荷的水層攜帶粒子向負極移動

如果樣品原本是移向負極的，則泳動的速度加快；如果樣品原本是移向正極的，則泳動的速度減慢。電滲作用：電滲：在電場作用下液體對固體支持物相對移動的現(xiàn)象。＋＋＋＋＋＋＋＋以紙電泳為例:第七頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二血清中幾種主要蛋白組分：血清蛋白質等電點分子量占總蛋白的％清蛋白4.64

69,00057～72α1－球蛋白5.00

200,0002～5α2－球蛋白5.06300,000

4～9β－球蛋白5.1290,000～150,0006.5～12γ－球蛋白6.85～7.3156,000～950,00012～20

緩沖液pH=8.6

pI＜pH血清蛋白帶負電荷,在電場中向正極移動第八頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二醋酸纖維薄膜電泳醋酸纖維薄膜作為支持介質醋酸纖維薄膜：將纖維素的羥基乙?；癁榇姿狨?，溶于丙酮后制成有均一細密微孔的薄膜，其厚度為0.1～0.15mm

第九頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二染色劑一般蛋白質染色常使用氨基黑、考馬斯亮藍、麗春紅糖蛋白用甲苯胺藍或過碘酸-Schiff試劑脂蛋白則用蘇丹黑或品紅亞硫酸染色

第十頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二實驗器材1、電泳儀及電泳槽2、醋酸纖維薄膜（2×8cm）3、培養(yǎng)皿4、點樣器（蓋玻片）5、濾紙6、玻璃板（可用大培養(yǎng)皿背面代替）7、鑷子8、毛細管9、刀片第十一頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二實驗試劑1、巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH8.6，0.07mol/L，離子強度0.06)2、0.5%氨基黑10B染色液3、漂洗液100ml4、透明甲液和乙液各20ml5、人血清（嚴格防止血清沾到皮膚上，尤其是帶有傷口的皮膚）第十二頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二實驗操作1.醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇

將醋酸纖維素薄膜浸于緩沖液中約30min后，取醋酸纖維素薄膜放在濾紙中并吸干表面液體。整條薄膜顏色一致而無白色斑點，則表明薄膜質地均勻(實驗中應選擇質地均勻的膜)。2.電泳槽的準備

電泳槽有兩個互相隔離的槽，各自裝有緩沖液，接不同的電極，紅色為正極，黑色為負極。每個槽上都有一根可移動的橫桿，濾紙的一頭搭在橫桿上，另一頭浸入緩沖液中，形成濾紙橋。第十三頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二3.點樣：

點樣前，取一張干凈的濾紙，在距一邊1.5cm處用鉛筆劃一條平行線作為點樣標志區(qū)。點樣時，用毛細管吸取血清，在蓋玻片一端均勻涂抹，使樣品連續(xù)、均勻、適量，把蓋玻片在薄膜毛面上輕而溫和地印一下（蓋章法）。點樣區(qū)距陰極端1.5cm（見圖）。此步是實驗的關鍵。

醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點樣位置示意圖（黑線處為點樣位置）

點樣區(qū)6.5cm1.5cm第十四頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二4.電泳

將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。連接好電泳儀。在室溫下電泳，打開電源開關，調節(jié)電流強度0.3mA/cm膜寬度（8片薄膜則為4.8mA）。通電10-15min后，調節(jié)電流強度0.5mA/cm膜寬度（8片薄膜則為8mA），電泳時間50-80min。電泳后，調節(jié)旋鈕使電流為零，關閉電泳儀切斷電源。第十五頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二5.染色：電泳完畢后將薄膜取下,放在含氨基黑10B染色液的培養(yǎng)皿中浸泡5min，染色時可置于搖床，染色液用后回收到原瓶。6.漂洗：將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數次，直至背景藍色脫盡，條帶清晰為止，取出薄膜放在濾紙上，用吹風機冷風吹干或者自然晾干。7.透明將干燥的薄膜浸入透明甲液2min后轉入乙液1min，取出后貼于干凈玻璃板上，中間不能有氣泡，等待至薄膜透明，如果透明太慢可用乙液淋洗一次。透明后冷風吹干燥，置于自來水下沖洗，等薄膜濕潤后用刀片從一角撬開并輕輕取下，濾紙吸干水分后即可。如需長期保存可在液體石蠟中浸潤。第十六頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二8.記錄和分析實驗結果

透明后可將薄膜上的5條色帶根據其顏色深淺、形狀、大小及相對位置進行描述、記錄，并判斷分析結果。透明后的薄膜可作掃描或照相。正常人血清醋酸纖維素薄膜電泳示意圖

1．為清蛋白，2，3，4，5，分別為α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白，6為點樣原點

第十七頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二注意事項1、薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關鍵之一。2、點樣時，應將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，薄膜吸水量以不干不濕為宜。3、點樣時，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞薄膜或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。4、點樣應點在薄膜的毛面上，點樣量要適量，不宜過多或過少。5、電泳時應將薄膜的點樣端置于電泳槽的負極端，且點樣面向下。6、應控制染色時間。時間長，薄膜底色不易脫去；時間太短，著色不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻，必要時可進行復染。第十八頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二思考題1.用醋酸纖維薄膜電泳做電泳支持物有什么優(yōu)點？2.電泳時為什么要將點樣的一端靠近負極端？3.電泳圖譜清晰的關鍵是什么？如何正確操作？第十九頁，共二十頁，編輯于2023年，星期二小知識：血清蛋白電泳結果的臨床意義可