實驗四酸性磷酸酶及值測定

實驗四酸性磷酸酶及值測定第一頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二酸性磷酸酶：

催化磷酸單酯的水解反應(yīng)存在于人的肝臟，前列腺等處植物中以發(fā)芽的種子中含量最為豐富。

是生物體中重要的一種酶類，為某些疾病的檢測指標(biāo)。一、概述第二頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二酶液磷酸苯二鈉苯酚＋磷酸氫二鈉

folin-酚測定酚的濃度

計算出反應(yīng)速度（用產(chǎn)物生成量/min來表示）

根據(jù)雙倒數(shù)法計算出Km及Vmax二、實驗原理第三頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二第四頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二

V=Vmax[S][S]Km+第五頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二三、實驗步驟：1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取2、制作酶反應(yīng)時間與產(chǎn)物生成量的關(guān)系曲線3、制作酚標(biāo)準(zhǔn)曲線4、[S]與V0關(guān)系實驗

5、雙倒數(shù)作圖法計算Vmax和Km

第六頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二buffersubstrateenzymeCertainTimeblankStopthereactionColordeveloped第七頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二生化實驗課老師：于曉虹實驗報告請交到講臺上來酶液稀釋取上清液３００微升，稀釋３０倍，用大試管裝科代表李博恒第八頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二

1、磷酸酶原液的制備：稱取5g綠豆芽莖（去頭去根），加入pH5.6的HAC緩沖液2ml研磨成漿并靜置30分鐘。紗布過濾，取1.8ml濾液,以6000rpm，離心20min，取上清。上清液用pH5.6的HAC緩沖液稀釋30倍，用于實驗。第九頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二2、制作酶反應(yīng)時間與產(chǎn)物生成量的關(guān)系曲線（目的：選取合適的反應(yīng)時間）第十頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二加液程序表管號1234560磷酸苯二鈉0.50.50.50.50.50.50.5酶液0.50.50.50.50.50.5精確反應(yīng)時間3510152025碳酸鈉溶液2222222酶液－－－－－－0.5Folin－酚溶液0.50.50.50.50.50.50.5

Folin－酚溶液已稀釋好！注：進(jìn)行酶促反應(yīng)時，注意預(yù)熱，使所有的反應(yīng)在同等條件下開始35℃保溫10分鐘第十一頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二0123456反應(yīng)時間03510152025吸光度結(jié)果：以反應(yīng)時間為橫坐標(biāo)，A680nm為縱坐標(biāo)，繪制反應(yīng)進(jìn)程曲線，并從該曲線上求出酸性磷酸酶反應(yīng)初速率的時間范圍。第十二頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二3、制作酚標(biāo)準(zhǔn)曲線（目的：可從酚標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出A680nm所相當(dāng)?shù)姆雍?并計算出反應(yīng)速度（用每分鐘產(chǎn)物生成量來表示）第十三頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二0123456780.4mMphenol

standardsolution00.10.20.30.40.50.60.70.8H2O10.90.80.70.60.50.40.30.21MNa2CO3222222222Folin-phenolreagent0.50.50.50.50.50.50.50.50.5加液程序表35℃保溫10分鐘第十四頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二012345678酚含量/μmol00.040.080.120.160.200.240.280.32吸光度結(jié)果：以酚含量（μmol）為橫坐標(biāo)，A680nm為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以0號管作空白，在可見光分光光度計680nm波長處讀取各管的吸光度（A680nm）。第十五頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二4、[S]與V0關(guān)系實驗第十六頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二實驗加液程序表管號1234560磷酸苯二鈉0.100.150.200.250.300.500.50醋酸緩沖液0.400.350.300.250.20--酶液0.500.500.500.500.500.50-

精確反應(yīng)15分鐘35度碳酸鈉溶液2222222Folin－酚溶液0.50.50.50.50.50.50.5酶液－－－－－－0.5

35℃保溫10分鐘測680nm處吸光度

注：進(jìn)行酶促反應(yīng)時，注意預(yù)熱，使所有的反應(yīng)在同等條件下開始第十七頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二實驗中需注意事項：酶反應(yīng)作用時間精確控制

第十八頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二Tubenumber123456[S](mM)0.50.7511.251.52.51/