食品微生物之檢驗方法-阪崎腸桿菌之檢驗

食品微生物之檢驗方法一阪崎腸桿菌之檢驗適用范圍：本方法適用于一般食品及奶粉中阪崎腸桿菌之檢驗。檢驗方法：2.1工作環(huán)境：工作平臺須寬敞、潔凈、光線良好，操作平臺光度為100叭燭光以上，密閉室內(nèi)換氣良好，盡可能沒有灰塵及流動空氣。每15分鐘落菌數(shù)不得超過15CFU/培養(yǎng)皿。2.2器具及材料：干熱滅菌器。高壓滅菌釜。攪拌均質(zhì)器(Blender)或鐵胃(Stomacher):適用于無菌操作者。天平：可稱量到2000g者，靈敏度為0.1g；可稱量到120g者，靈敏度為1mg。冰箱：能維持5土3°C者。吸管或吸管尖：已滅菌，1mL吸管應(yīng)有0.01mL之刻度；5mL及10mL吸管應(yīng)有0.1mL之刻度。吸管輔助器(Pipetteaid)或微量分注器。稀釋瓶：160mL，玻璃、聚乙烯(polyethylene)、鐵弗龍(Teflon)或其它能耐121C濕熱滅菌20分鐘以上之塑料材質(zhì)，附螺旋蓋。培養(yǎng)皿：已滅菌，內(nèi)徑約9cm，深度約15mm，底皿之內(nèi)外面應(yīng)平坦，無氣泡、刮傷或其它缺點。2.2.10增菌用容器：附螺旋蓋之125mL、250mL、2L三角錐瓶或廣口瓶；玻璃、聚乙烯、鐵弗龍或其它能耐121C濕熱滅菌20分鐘以上之塑料材質(zhì)。2.2.11pH測定儀。2.2.12培養(yǎng)箱：能維持內(nèi)部溫度在土1C以內(nèi)者。2.2.13溫度計：量測溫度范圍1?55C，最小刻度0.1C。2.2.14水?。杭由w，具水流循環(huán)系統(tǒng)，能維持水溫溫差在土0.2C以內(nèi)者。2.2.15接種針及接種環(huán)(直徑約3mm)：鎳鉻合金、鉑銥或鉻線材質(zhì)，或可拋棄式者。曲玻棒：可滅菌者，直徑3?4mm，涂抹區(qū)域45?55mm。試管：10X100mm，13X100mm，13X120mm，15X150mm，16X150mm試管，或其它適用者。旋渦混合器(Vortexmixer)。2.2.19顯微鏡：能放大至1000倍以上之一般光學顯微鏡。2.2.20載玻片及蓋玻片：適用于染色及鏡檢用。2.2.21研缽、杵。2.2.22藥勺、剪刀、小刀、鑷子：可滅菌。2.2.23濾紙及褐色試藥瓶。2.2.24無菌濾膜：孔徑0.45rm或以下之親水性醋酸纖維膜。杜蘭發(fā)酵管(Durhamfermentationtube):外徑9X22mm或其它適用者。試藥：氯化鈉、硫酸月桂酸鈉(sodiumlaurylsulfate)、膽鹽No.3(bilesaltsNo.3)、中性紅(neutralred)、結(jié)晶紫(crystalviolet)、檸檬酸鐵銨(ferricammoniumcitrate)、脫氧膽酸鈉(sodiumdesoxycholate)、硫代硫酸鈉(sodiumthiosulfate)、草酸銨(ammoniumoxalate)、碘化鉀、碘、沙黃O(safranin0)、對-二甲胺基苯甲醛(p-dimethylaminobenzaldehyde)、四甲基對位苯二胺鹽酸鹽(N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine2HCl)、磷酸二氫鈉(NaH2P04H20)、硝基苯哌喃半乳糖苷(o-nitrophenyl-B-D-galactopyranoside,0NPG)、5-漠-4-氯-3-吲哚-a-D-哌喃葡萄糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-a-D-glucopyranoside)、亮綠(brilliantgreen)>酚紅(phenolred)、漠甲酚紫(bromcresolpurple)、漠麝香草藍(bromthymolblue)、肌酸(creatine)、甲基紅(methylred)、a-萘酚(a-naphthol)、氫氧化鉀、95%乙醇、無水乙醇、戊醇(amylalcohol)或異戊醇(isoamylalcohol)、乳糖、蔗糖、半乳糖Kdulcitol)、核糖醇(adonitol)、棉子糖(raffinose)、山梨醇(sorbitol)、阿拉伯糖醇(D-arabitol)、氰化鉀、氫氧化鈉、L-離胺酸(L-lysine)、L-鳥胺酸(L-ornithine)、L-精胺酸(L-arginine)、礦物油或液態(tài)石蠟油(paraffinoil)及鹽酸等均采用化學試藥級。試劑：無菌蒸餾水：蒸餾水900mL、90mL、9mL,分裝于增菌容器或試管中，以121°C滅菌15分鐘。0.85%生理食鹽水：取氯化鈉8.5g溶于1000mL蒸餾水中，分裝于試管內(nèi)，以121C滅菌15分鐘?？峦呖耸显噭?Kovacs’reagent)：取對-二甲胺基苯甲醛5g溶于戊醇或異戊醇75mL中，再徐徐加入鹽酸25mL,混合均勻后應(yīng)呈黃色并須保存于4C冰箱中。甲基紅指示劑(Methylredindicator)：取甲基紅0.1g溶于95%乙醇300mL后，再加蒸餾水使成500mL。歐普氏試劑(Voges-Proskauertestreagents,VPreagents)：溶液A：取a-萘酚5g溶于無水乙醇100mL中。溶液B：取氫氧化鉀40g溶于蒸餾水中，并使成100mL。0.5%氰化鉀溶液(0.5%potassiumcyanidesolution)：取氰化鉀0.5g溶于無菌蒸餾水100mL中(氰化鉀為劇毒物質(zhì)，本操作務(wù)必在抽氣柜內(nèi)進行)。礦物油或液態(tài)石蠟油：取礦物油或液態(tài)石蠟油20?50mL裝入有蓋容器中約1/2滿，以121C滅菌30分鐘。革蘭氏染色液(Gramstainsolution)：.1哈克氏(Hucker’s)結(jié)晶紫液(初染劑)：溶液A：取結(jié)晶紫2g溶于95%乙醇20mL中。溶液B：取草酸銨0.8g溶于蒸餾水80mL中。將溶液A與溶液B混合，靜置24小時后以濾紙過濾，取濾液作為初染劑。.2革蘭氏碘液(媒染劑)：取碘化鉀2g及碘1g置于研砵中，經(jīng)研磨5?10秒鐘后，加蒸餾水1mL研磨，次加蒸餾水5mL研磨，再加蒸餾水10mL，研磨至碘化鉀和碘完全溶于水中，將此溶液注入褐色瓶中，再以適量蒸餾水洗滌研砵及杵后，并入洗液，加蒸餾水使成300mL。.3哈克氏復染液(復染劑)：取沙黃02.5g溶于95%乙醇100mL中，供作復染原液。使用時，取原液10mL加蒸餾水90mL，作為復染液。注：革蘭氏染色液因放久可能失效，因此若購買成品時，要注意其保存期限，若自行配制者應(yīng)檢查其染色效果。氧化酶試劑(Oxidasereagent)：取四甲基對位苯二胺鹽酸鹽1g溶于蒸餾水100mL后，貯存于褐色瓶，并置入冰箱中，使用期限以不超過1星期為宜。1M磷酸二氫鈉溶液：取磷酸二氫鈉6.9g溶于蒸餾水45mL中，徐徐注入30%氫氧化鈉溶液約3mL，調(diào)整pH值為7.0，續(xù)加入蒸餾水使成50mL，貯存于4°C冰箱中備用。硝基苯哌喃半乳糖試劑(ONPGreagent)：取硝基苯哌喃半乳糖80mg溶于37C蒸餾水15mL中，再加入1M磷酸二氫鈉溶液5mL即為0.0133M硝基苯哌喃半乳糖試劑，貯存于4C冰箱中，使用時須加溫至37C。培養(yǎng)基：蛋白胨緩沖液(Bufferedpeptonewater,BPW)蛋白胨(peptone)10g氯化鈉(NaCl)5g磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 3.5g磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1.5g蒸餾水1000mL攪拌加熱溶解后，以121C滅菌15分鐘，最終pH值為7.2土0.2。加鹽硫酸月桂酸胰化蛋白培養(yǎng)液(Lauryltryptosebrothwith2%NaCl,2%NaCl-LST)TOC\o"1-5"\h\z胰化蛋白(tryptose) 20g乳糖(lactose)5g磷酸二氫鉀(KH2PO4) 2.75 g磷酸氫二鉀(K2HPO4) 2.75 g氯化鈉(NaCl)20g硫酸月桂酸鈉(sodiumlaurylsulfate)0.1g蒸餾水1000mL加熱溶解后，分取10mL注入裝有杜蘭發(fā)酵管之試管內(nèi)，以121C滅菌15分鐘，最終pH值為6.8土0.2。紫紅膽鹽葡萄糖培養(yǎng)基(Violetredbileglucoseagar,VRBG)酵母抽出液(yeastextract)3g蛋白胨(peptone)7g氯化鈉(NaCl)5g膽鹽No.3(bilesaltsNo.3) 1.5g乳糖(lactose)10g中性紅(neutralred)0.03g結(jié)晶紫(crystalviolet)0.002g洋菜（agar）15g葡萄糖（glucose）10g蒸餾水1000mL加熱至沸騰溶解，注意不可加熱過度。于45?50°C水浴中冷卻，最終pH值為7.4土0.2。每培養(yǎng)皿注入約20mL，凝固后確定表面干燥后使用。配制后之培養(yǎng)基應(yīng)放置于2?8C冰箱中保存，但須于一個月內(nèi)使用完畢。阪崎腸桿菌培養(yǎng)基（Enterobactersakazakiiagar,ESA）胰化蛋白胨（tryptone） 15g大豆蛋白胨（soyapeptone）5.0g氯化鈉（NaCl）5.0g檸檬酸鐵銨（ferricammoniumcitrate）1.0g脫氧膽酸鈉（sodiumdesoxycholate）1.0g硫代硫酸鈉（Na2S2O3.5H2O）1.0g5-漠-4-氯-3-吲哚-a-D-哌喃葡萄糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-a-D-glucopyranoside）0.1g洋菜（agar）15g蒸餾水1000mL攪拌加熱溶解后，以121C，滅菌15分鐘，最終pH值為7.3土0.2。冷卻至50C，每培養(yǎng)皿注入約20mL，凝固后確定表面干燥后使用。腸內(nèi)細菌科增菌培養(yǎng)液（Enterobacteriaceaeenrichmentbroth,EEbroth）TOC\o"1-5"\h\z蛋白胨（peptone） 10g葡萄糖（glucose） 5g磷酸氫二鈉（Na2HPO4） 8g磷酸二氫鉀（KH2PO4） 2g牛膽鹽（ox-gall） 20g亮綠（brilliantgreen）0.015g蒸餾水1000mL加熱至沸騰溶解，注意不可加熱過度，最終pH值為7.2土0.2。取901^注入約125mL已滅菌之附蓋三角錐瓶或廣口瓶中，配置后之培養(yǎng)液應(yīng)放置于2?8C冰箱中保存，但須于一個月內(nèi)使用完畢。胰化酪蛋白大豆培養(yǎng)基（Trypticasesoyagar,TSA）胰化酪蛋白胨（trypticasepeptone）15.0g植物蛋白胨（phytonepeptone）5.0g氯化鈉（NaCl）5.0g洋菜（agar）15g蒸餾水1000mL平板培養(yǎng)基配制方法：攪拌加熱溶解后，以121C滅菌15分鐘，最終pH值為7.3土0.2。冷卻至50C，每培養(yǎng)皿注入約20mL，凝固后確定表面干燥后使用；斜面培養(yǎng)基配制方法：加熱溶解后，分取約5mL注入試管，以121C滅菌15分鐘，最終pH值為7.3土0.2。滅菌后作成斜面培養(yǎng)基，斜面長度約4?5cm，斜面底部之深度約2?3cm。尿素培養(yǎng)液（Ureabroth）尿素（urea）20g酵母抽出物（yeastextract）0.1g磷酸氫二鉀（K2HPO4） 9.1g磷酸氫二鈉（Na2HPO4） 9.5g酚紅（phenolred）0.01g蒸餾水1000mL溶解后，經(jīng)孔徑0.45rm濾膜過濾后，分取1.5?3mL濾液，注入已滅菌之試管中，最終pH值為6.8土0.2。運動性試驗培養(yǎng)基（Motilitytestmedium）牛肉抽出物（beefextract）3g蛋白胨（peptone）10g氯化鈉（NaCl） 5g洋菜（agar） 4g蒸餾水1000mL加熱溶解后，分取約81^注入附有螺旋蓋試管中，以121°C滅菌15分鐘，最終pH值為7.4土0.2。氰化鉀培養(yǎng)液（Potassiumcyanidebroth）聚蛋白胨（polypeptone）3g氯化鈉（NaCl）5g磷酸二氫鉀（KH2PO4） 0.225g磷酸氫二鈉（Na2HPO4） 5.64g蒸餾水1000mL溶解后，以121C滅菌15分鐘，最終pH值為7.6土0.2。冷卻后于抽氣柜內(nèi)以吸管輔助器配合無菌操作，加入0.5%氰化鉀溶液15mL，混合均勻，分取1?1.51^注入已滅菌之試管中，貯存于冰箱備用，貯存期限不得超過兩周（操作氰化鉀溶液時，需戴手套且不可用口吸取）。胰化蛋白胨培養(yǎng)液（Tryptonebroth）胰化蛋白胨（tryptone）或胰化酪蛋白胨（trypticase）10g蒸餾水1000mL溶解后，分取約51^注入試管內(nèi)，以121C滅菌15分鐘，最終pH值為6.9土0.2。MR-VP培養(yǎng)液（MR-VPbroth）蛋白胨緩沖液粉末（bufferedpeptone-waterpowder）7g葡萄糖（glucose）5g磷酸氫二鉀（K2HPO4） 5g蒸餾水1000mL溶解后，分取約10mL注入試管中，以118?121C滅菌15分鐘，最終pH值為6.9土0.2。漠甲酚紫培養(yǎng)液（Bromcresolpurplebroth）蛋白胨（peptone）10g牛肉抽出物（beefextract）3g氯化鈉（NaCl）5g漠甲酚紫（bromcresolpurple）0.04g蒸餾水1000mL溶解后，分取約2.5mL注入試管內(nèi)，以121°C滅菌10分鐘，最終pH值為7.0土0.2。冷卻后，每管加入經(jīng)0.2rm孔徑濾膜過濾除菌之50%（w/v）蔗糖溶液0.278土0.002mL，使培養(yǎng)液中該糖之最終濃度為5%（w/v）。含半乳糖醇、核糖醇、棉子糖、山梨醇及阿拉伯糖醇之漠甲酚紫培養(yǎng)液配制方法亦同。脫羧酶基礎(chǔ)培養(yǎng)液（Decarboxylasebasalmedium）蛋白胨（peptone）5g酵母抽出物（yeastextract）3g葡萄糖（glucose）1g漠甲酚紫（bromcresolpurple）0.02g蒸餾水1000mL加熱攪拌溶解后，取L-離胺酸5g溶解于上述之培養(yǎng)液中，混合均勻，分取適量注入試管內(nèi)，以121C滅菌10分鐘，最終pH值為6.5土0.2，使成離胺酸脫羧酶培養(yǎng)液。含L-精胺酸及L-鳥胺酸之脫羧酶培養(yǎng)液配制方法亦同。對照組之配制，除脫羧酶基礎(chǔ)培養(yǎng)液外，不需添加任何物質(zhì)。辛蒙斯檸檬酸鹽培養(yǎng)基（Simmonscitrateagar）氯化鈉（NaCl）5gTOC\o"1-5"\h\z檸檬酸鈉（Na3C6H5O7） 2 g磷酸氫二鉀（K2HPO4） 1 g磷酸二氫銨（NH4H2PO4） 1 g硫酸鎂（MgSO4）0.2g漠麝香草藍（bromthymolblue）0.08g洋菜（agar） 15g蒸餾水1000mL加熱溶解后分取約5mL注入試管中以121C滅菌15分鐘最終pH值為6.8土0.2滅菌后作成斜面培養(yǎng)基，此斜面長度約4?5cm，斜面底部深度約2?3cm。2.3檢液之調(diào)制：奶粉檢體（包括嬰兒配方奶粉、特殊營養(yǎng)配方奶粉、幼童專用奶粉及成人奶粉）用振搖方式，使充分均勻混合后，以已滅菌之藥勺或其它方便使用之用具，取100g、10g及1g，分別加入內(nèi)含預熱至45C之無菌蒸餾水900mL、90mL及9mL之2L、250mL及125mL三角錐瓶中（三重復）。以上三角錐瓶得以其它耐濕熱滅菌之塑料材質(zhì)容器或玻璃試管替代，唯檢液體積以不超過容器總?cè)萘慷种粸樵瓌t。充分混合均勻，即為三階三瓶（管）之10倍稀釋檢液，于35C培養(yǎng)18?24小時，供作檢液。因檢液于增菌培養(yǎng)過程可能產(chǎn)氣，故不可緊鎖螺旋瓶蓋（或試管蓋），宜維持松動但不脫落狀態(tài)。液態(tài)食品檢體：充分均勻混合后，取100mL、10mL及1mL，分別加入內(nèi)含900mL、90mL及9mL已滅菌之蛋白胨緩沖液。充分混合均勻，即為三階三瓶（管）之10倍稀釋檢液，于35°C培養(yǎng)18?24小時，供作檢液。環(huán)境檢體或涂抹物檢體：環(huán)境檢體：取1g置于含2%NaCl-LST培養(yǎng)液10mL之試管內(nèi)，于44C培養(yǎng)18?24小時，供作檢液。涂抹物檢體：將涂抹棒之頭部置于已滅菌試管內(nèi)，以無菌操作折（剪）斷涂抹物木柄，添加蛋白胨緩沖液5mL后，將試管蓋旋緊，于10秒內(nèi)來回叩擊手心使其劇烈振蕩（振蕩幅度需達15公分）50次或以旋渦混合器充分振蕩至涂抹物頭部之棉絮松弄取溶出液1mL置于含2%NaCl-LST培養(yǎng)液10mL之試管內(nèi)，于44C培養(yǎng)18?24小時，供作檢液?；?qū)⑼磕ò糁^部置于含2%NaCl-LST培養(yǎng)液10mL之試管內(nèi)，以無菌操作折（剪）斷涂抹物木柄，于44C培養(yǎng)18?24小時，供作檢液。2.4鑒別試驗：選擇性增菌培養(yǎng)：吸取2.3節(jié)之檢液10mL，加入內(nèi)盛有腸內(nèi)細菌科增菌培養(yǎng)液90mL之160mL稀釋瓶中?；旌暇鶆蚝笥?5C培養(yǎng)18?24小時。分離培養(yǎng)：方法一：自2.4.1節(jié)之腸內(nèi)細菌科增菌培養(yǎng)液中取一接種環(huán)量，在VRBG及ESA培養(yǎng)基表面劃線后（二重復），于35C培養(yǎng)18?24小時，觀察所形成菌落之形態(tài)。阪崎腸桿菌在VRBG培養(yǎng)基上的典型菌落為外緣規(guī)則平整呈淡粉紅色或紫紅色外緣通常伴有紫紅色之膽酸（bileacids）類物質(zhì)沉殿環(huán)生成；阪崎腸桿菌在ESA培養(yǎng)基上的典型菌落為外緣規(guī)則平整，呈綠色。自VRBG及ESA培養(yǎng)基上鉤取可疑菌落，劃線于TSA平板培養(yǎng)基，于35C培養(yǎng)18?24小時后，進行下列初步生化試驗。方法二：自2.4.1節(jié)之腸內(nèi)細菌科增菌培養(yǎng)液中吸取1mL量，加入內(nèi)盛有生理食鹽水9mL之試管中，進行系列稀釋，使增菌培養(yǎng)液稀釋至原來的10-4?10-6倍。每一管（含未稀釋之培養(yǎng)液）分別以無菌吸管吸取0.1mL量，以曲玻棒均勻涂于VRBG及ESA培養(yǎng)基上，于35C培養(yǎng)18?24小時。自VRBG及ESA培養(yǎng)基上鉤取可疑菌落，劃線于TSA平板培養(yǎng)基，于35C培養(yǎng)18?24小時后，進行下列初步生化試驗?；旌暇辏∕ixedculture）之純化：將VRBG及ESA培養(yǎng)基上之未純化菌株，以四區(qū)劃法，劃于VRBG或ESA培養(yǎng)基，于35C培養(yǎng)18?24小時后，鉤取典型菌落，劃線于TSA平板培養(yǎng)基，于35C培養(yǎng)18?24小時后，進行下列初步生化試驗。2.5鑒定試驗：2.5.1初步生化試驗：氧化酶試驗（Oxidasetest）：以無菌接種針挑取可疑菌株，涂抹于含有氧化酶試劑之濾紙表面。10?15秒后變?yōu)樯钭仙邽檎磻?yīng)，否則為負反應(yīng)，阪崎腸桿菌為氧化酶負反應(yīng)。黃色色素產(chǎn)生試驗（Yellowpigmentproductiontest）：以無菌接種針挑取TSA平板培養(yǎng)基上可疑菌株至少5株，分別劃于TSA斜面培養(yǎng)基上，以25C培養(yǎng)48?72小時，觀察菌株產(chǎn)生色素之情形。有黃色色素產(chǎn)生者為正反應(yīng)，否則為負反應(yīng)，阪崎腸桿菌為正反應(yīng)。尿素酶試驗（Ureasetest）：以無菌接種針挑取可疑菌株，接種于尿素培養(yǎng)液內(nèi)，于35C培養(yǎng)24土2小時。由于未接種之尿素培養(yǎng)液偶爾會轉(zhuǎn)變?yōu)樽霞t色，故試驗時應(yīng)包括未接種之培養(yǎng)液作為對照用。培養(yǎng)液由橘紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樽霞t色者為正反應(yīng)，顏色不變者為負反應(yīng)，阪崎腸桿菌為負反應(yīng)。運動性試驗(Motilitytest)：以無菌接種針挑取可疑菌株，穿刺接種于運動性試驗培養(yǎng)基之表面中央點至深度0.5口寸處。于35°C培養(yǎng)24小時后開始觀察直至48土2小時。當測試菌沿穿刺線呈放射線狀生長者為正反應(yīng)，否則為負反應(yīng)，阪崎腸桿菌為正反應(yīng)。革蘭氏染色(Gramstain):以無菌接種針挑取可疑菌株，劃于TSA斜面培養(yǎng)基上，于35C培養(yǎng)24土2小時，依下列步驟進行革蘭氏染色后鏡檢。鉤取菌體，于載玻片上制成薄抹片，風干或微熱固定。初染：將已固定之抹片，用哈克氏結(jié)晶紫液染1分鐘后水洗，水洗時間應(yīng)不超過5秒鐘。媒染：加革蘭氏碘液作用1分鐘，水洗。脫色：以95%乙醇洗至不再有紫色褪出時，再以水洗，此步驟需時甚短，僅數(shù)秒即可，惟視抹片之厚薄而定。復染：用哈克氏復染液復染30秒鐘，水洗。自然風干。鏡檢：呈現(xiàn)深紫色者為革蘭氏陽性菌，呈現(xiàn)淡紅色者為革蘭氏陰性菌。阪崎腸桿菌為革蘭氏陰性、無莢膜、無芽孢之桿狀菌。經(jīng)上述試驗，判定為可疑阪崎腸桿菌者，自TSA培養(yǎng)基鉤菌，進行下列生化試驗確認。生化試驗：硝基苯哌喃半乳糖苷試驗(ONPGtest)：鉤菌并置于含有已滅菌之0.85%生理食鹽水0.2mL之試管中，作成濃懸浮液后，再加入一片浸過硝基苯哌喃半乳糖苷試劑之紙錠，并輕輕搖動后，于35C培養(yǎng)6?24小時，紙錠變成黃色者為正反應(yīng)，否則為負反應(yīng)，阪崎腸桿菌為正反應(yīng)。氰化鉀試驗(KCNtest)：鉤菌接種于氰化鉀培養(yǎng)液，以橡皮塞塞緊試管口，于35C培養(yǎng)24小時后開始觀察直至48土2小時。培養(yǎng)液由清澈變?yōu)榛鞚嵴邽檎磻?yīng)，否則為負反應(yīng)，阪崎腸桿菌為正反應(yīng)。吲哚試驗(Indoletest)：鉤菌接種于胰化蛋白胨培養(yǎng)液中，于35C培養(yǎng)48土2小時后，加入柯瓦克氏試劑0.2?0.3mL，輕輕搖動后靜置約10分鐘，上層呈紅色者為正反應(yīng)，否則為負反應(yīng)，大部份阪崎腸桿菌為負反應(yīng)。歐普氏試驗(VPtest)：鉤菌接種于MR-VP培養(yǎng)液中，于35C培養(yǎng)48土2小時后，取培養(yǎng)液1mL至另一已滅菌之試管中，加入歐普氏試劑溶液A約0.6mL及歐普氏試劑溶液B約0.2mL后，再加入少許肌酸，振搖均勻，經(jīng)2?4小時后觀察結(jié)果，呈現(xiàn)粉紅色至鮮紅者為正反應(yīng)，否則為負反應(yīng)，大部份阪崎腸桿菌為正反應(yīng)。甲基紅試驗(Methylredtest)：將節(jié)剩余之MR-VP培養(yǎng)液于35C再培養(yǎng)48土2小時后，取培養(yǎng)液5mL至另一已滅菌試管中，加入甲基紅指示劑5?6滴，輕輕搖勻，呈紅色者為正反應(yīng)，否則為負反應(yīng)，大部份阪崎腸桿菌為負反應(yīng)。檸檬酸鹽利用試驗(Citrateutilizationtest)：鉤菌接種于辛蒙斯檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基，須在斜面上作劃線及穿刺培養(yǎng)，于35C培養(yǎng)96土2小時。斜面上有菌體生長且培養(yǎng)基顏色由綠色變?yōu)樗{色者為正反應(yīng)，否則為負反應(yīng)，阪崎腸桿菌為正反應(yīng)。精胺酸二水解酶試驗(Argininedihydrolasetest)：鉤菌分別接種于精胺酸脫羧酶培養(yǎng)液及脫羧酶基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，接種后分別注入已滅菌之液態(tài)石蠟或礦物油覆蓋表面高約1?2cm，需松蓋，于35°C培養(yǎng)4天，每24小時觀察一次。精胺酸脫羧酶培養(yǎng)液呈紫色，且脫羧酶基礎(chǔ)培養(yǎng)液呈黃色者為正反應(yīng)，否則為負反應(yīng)，阪崎腸桿菌為精胺酸二水解酶正反應(yīng)。離胺酸脫羧酶試驗(Lysinedecarboxylasetest)：鉤菌分別接種于離胺酸脫羧酶培養(yǎng)液及脫羧酶基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，接種后注入已滅菌之液態(tài)石蠟或礦物油覆蓋表面高約1?2cm，需松蓋，于35C培養(yǎng)4天，每24小時觀察一次。離胺酸脫羧酶培養(yǎng)液呈紫色且脫羧酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基呈黃色者為正反應(yīng)，否則為負反應(yīng)，阪崎腸桿菌為負反應(yīng)。鳥胺酸脫羧酶試驗(Ornithinedecarboxylasetest)：鉤菌分別接種于鳥胺酸脫羧酶培養(yǎng)液及脫羧酶基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，接種后注入已滅菌之液態(tài)石蠟或礦物油覆蓋表面高約1?2cm，需松蓋，于35C培養(yǎng)4天，每24小時觀察一次。鳥胺酸脫羧酶培養(yǎng)液呈紫色，且脫羧酶基礎(chǔ)培養(yǎng)液呈黃色者為正反應(yīng)，否則為負反應(yīng)，阪崎腸桿菌為正反應(yīng)。0發(fā)酵試驗(Fermentationtest)：鉤菌接種于分別含有蔗糖、半乳糖醇、核糖醇、棉子糖、山梨醇及阿拉伯糖醇等糖類之漠甲酚紫培養(yǎng)液中，于35C培養(yǎng)2?5天，每隔24小時觀察其發(fā)酵情形。培養(yǎng)液顏色由紫色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，產(chǎn)酸者為正反應(yīng)。2.6判定：阪崎腸桿菌陽性者，應(yīng)符合表一及表二所列之結(jié)果。表一、E.sakazakii、E.cloacae、E.aerogenes、E.agglomerans及E.gergoviae之生化反應(yīng)(1)試驗項目E.sakazakiiE.cloacaeE.aerogenesE.agglomeransE.gergoviae離胺酸脫羧酶(lysinedecarboxylase)——+—+精胺酸二水解酶(argininedihydrolase)++———鳥胺酸脫羧酶(ornithinedecarboxylase)+++—+檸檬酸鹽利用(citrateutilization)+++[+]+尿素酶(urease)————+吲I哚(indole)d——d—氰化鉀(KCN)+++d—黃色色素產(chǎn)生(yellowpigmentproduction)+——d—甲基紅(MR)—dNDND—歐普氏(VP)+dNDND+(1) +表示所有菌株在1?2天內(nèi)為正反應(yīng)；［+］表示大部分(89%以上)在1?4天

內(nèi)為正反應(yīng)；d表示依菌株而異（通常11?80%為正反應(yīng)）；一表示所有菌株培養(yǎng)7天后皆為負反應(yīng)；ND表示無可引用之資料。表二、E.sakazakii、E.cloacae、E.aerogenes、E.agglomerans及E.gergoviae之發(fā)酵試驗(1)試驗項目E.sakazakiiE.cloacaeE.aerogenesE.agglomeransE.gergoviae蔗糖(sucrose)+++(+)+半乳糖醇（dulcitol）—(-)—(—)—核糖醇（adonitol）—(-)+——棉子糖（raffinose）+++V+山梨醇（sorbi