煙草抗青枯黑脛病益生菌劑研制與應(yīng)用

煙草抗青枯黑脛病益生菌劑研制與應(yīng)用第一頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三第二頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三1.項目實施的背景1.1青枯病、黑脛病是煙草生產(chǎn)上的毀滅性病害。湘西土樣中青枯菌含量較大，永州次之，郴州相對較少，土壤中青枯菌含量與青枯病發(fā)生的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，其中加青枯菌拮抗菌肥土壤中的含菌量明顯少于未加菌肥土壤．

杜桂萍，周建國，煙草青枯病菌的田間快速檢測，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.2010,36(2):192-195.1.2對青枯病的防治尚無理想藥劑和抗病品種。規(guī)?；l(fā)展、集約化經(jīng)營煙草連作病原積累病害發(fā)生造成損失易感品種第三頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三合成農(nóng)藥的長期使用活性化合物積累農(nóng)藥殘留非靶標(biāo)毒性病原菌耐藥性逐漸增強煙草及其制品安全性煙草可持續(xù)發(fā)展受到影響1.3化學(xué)農(nóng)藥使用的長期影響。第四頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三1.4湖南省郴州市煙草種植面臨的主要問題。目前最突出的問題是根莖病害和葉部病害；根莖病害發(fā)生規(guī)律復(fù)雜、危害嚴(yán)重、難以控制。煙草青枯病和黑脛病是煙草的系統(tǒng)性、突發(fā)性和流行性病害，面積和危害程度都在擴大，已經(jīng)成為制約我省郴州市煙葉生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的重要的因素。第五頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三文獻檢索后發(fā)現(xiàn)有關(guān)煙草青枯病害的報道有162篇論文王巖等以硫酸慶大霉素為誘變劑，通過濃度梯度平板法篩選出拮抗效果與T5菌株類似的抗性突變菌株T5-1，該菌遺傳穩(wěn)定性較好。以牛糞、玉米秸稈為原料生產(chǎn)有機肥，當(dāng)堆溫達到50℃以上后保溫2周，然后降溫至40℃時接入T5-1菌株，40℃下培養(yǎng)3d，可得到拮抗菌和嗜溫菌濃度均為1012cfu/g(干基)的高密度堆肥產(chǎn)品。大田試驗結(jié)果表明，該有機肥對煙草青枯病具有一定的防治效果，第一年有機肥施用量較小，效果不顯著；第二年連續(xù)施用有機肥且加大施用量，抗病效果顯著增加，其中生物有機肥作基肥施用效果最好，青枯病的發(fā)病率較對照降低了50.65％，病情指數(shù)降低了71.09％。第六頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三有關(guān)煙草黑脛病害的報道有179篇論文。

方敦煌等報道生防菌GP13不同施用時期防治效果表明，生防菌對煙草黑脛病的防治效果在40.1％-90.5％，3個時期以成活后施用，防治效果較好，移栽期效果稍差，假植期防效相對較差。500倍生防菌菌劑的防效與對照藥劑相當(dāng)，防效為42.6-94.5％。第七頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三未見通過直接對病原菌抗生素標(biāo)記，不經(jīng)過平板拮抗，直接進行土壤菌株對抗篩選的研究報道。第八頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三二、研究目標(biāo)和主要研究內(nèi)容研究目標(biāo)1.通過室內(nèi)及大田試驗，建立恰當(dāng)?shù)囊种坪诿劜?、青枯病益生菌劑篩選方法，篩選出20-35℃抑制土壤青枯病、黑脛病病源菌在煙田內(nèi)擴繁的益生細菌、芽孢桿菌。2.構(gòu)建抑制青枯病、黑脛病病源菌數(shù)量的益生菌庫，實現(xiàn)對根莖病害的多元化控制。3.研究益生菌劑的生產(chǎn)、保存、使用的關(guān)鍵技術(shù)，對連作煙田的失衡微生物系進行原位修復(fù)；4.構(gòu)建青枯病和黑脛病的模式研究系統(tǒng)，實現(xiàn)對根莖病害的可持續(xù)控制。第九頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三主要研究內(nèi)容

1煙草根際、葉際優(yōu)勢微生物菌庫的建立。以桂陽代表性的植煙土壤為對象，可培養(yǎng)方法在實驗室中對優(yōu)勢微生物進行分離純化，構(gòu)建一個豐富的根際優(yōu)勢微生物菌庫群，其目的是為構(gòu)建菌庫提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源。2.實驗室模擬并研究不同微生物在滅菌土壤中的定植能力，篩選出模擬大田情況下，在可變環(huán)境中定植能力均較好的微生物，從而構(gòu)建益生菌庫。3.研究菌劑種類和用量對不同病害發(fā)病情況降低程度，確定較為有效的田間菌劑使用濃度，使用條件，與栽培技術(shù)的配套情況，評估菌劑的適應(yīng)能力，為菌劑使用提供理論依據(jù)。第十頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三4.益生菌劑對土壤微生態(tài)的影響及抗病機理研究（1）菌劑對土壤中有效N、P、K含量變化影響研究（2）菌劑對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響研究5.確定菌株的生產(chǎn)參數(shù)研究菌劑規(guī)模化生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)和技術(shù)參數(shù):以工業(yè)化生產(chǎn)為前提，研究不同發(fā)酵工藝菌劑中活菌收獲率，降低生產(chǎn)成本，確定生產(chǎn)環(huán)節(jié)的關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)，進行中試生產(chǎn)研究，并對產(chǎn)品不同保存情況下菌劑活力進行研究，確定關(guān)鍵技術(shù)，為菌株產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)銷售提供技術(shù)儲備。第十一頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三三、技術(shù)關(guān)鍵與創(chuàng)新點1、技術(shù)關(guān)鍵（1）建立具有桂陽煙區(qū)土壤代表性的能夠在煙草根際、葉際定植且具有降低病原微生物侵染能力的微生物菌庫，并從中篩選出具有田間使用效果的菌株。（2）大田實驗中該菌株能夠在煙草根際、葉際與病原菌的生態(tài)位競爭中占有優(yōu)勢，可以在大田中繁殖、持久性生存，穩(wěn)定，具有可持續(xù)性。（3）確定菌劑的生產(chǎn)培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)，菌劑保存條件，如是固態(tài)菌劑，確定填充劑成分，掌握不同環(huán)境條件下菌劑保存時間與菌劑活菌數(shù)的關(guān)系。第十二頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三2、創(chuàng)新點本項目從病原菌、寄主植物、發(fā)病土壤三要素出發(fā)，直接利用抗生素標(biāo)記青枯病原菌、益生拮抗菌，基于生態(tài)位理論研究在土壤中病原菌、益生菌群的變化，及植株感病情況情況，構(gòu)建益生菌庫，最終實現(xiàn)對煙草病害的生物多元化控制方法；第十三頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三四、研究方法與技術(shù)路線1、主要的試驗研究方法（1）采集桂陽煙區(qū)煙草不同生長時期根際土壤、葉際樣品，調(diào)查煙草根際微生物群落結(jié)構(gòu)，并分離純化煙草優(yōu)勢細菌。以桂陽煙區(qū)種植的煙草植株為研究對象，不同生長階段，取煙草根際土壤、葉片，采用土壤溶液培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)等方法，結(jié)合分子克隆技術(shù)研究煙草根際、葉際微生物多樣性，分離代表性優(yōu)勢微生物。第十四頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三（2）實驗室煙草根際、葉際益生微生物菌庫的建立。土壤優(yōu)勢細菌分別接種桂陽煙區(qū)代表性滅菌土壤，設(shè)置不同土壤溫度、濕度、營養(yǎng)類型，病害接種量等變化，篩選對病害微生物生長繁殖抑制且不同情況下均表現(xiàn)較強定植能力的微生物，采用分子鑒定方法鑒定菌種后構(gòu)建菌庫。第十五頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三（3）盆栽試驗選擇優(yōu)良菌株在初步篩選的基礎(chǔ)上，縮小篩選范圍，并對篩選菌株進行抗生素選擇性標(biāo)記（選擇與出發(fā)菌株生長型一致的菌株），消毒煙苗栽培至桂陽煙區(qū)代表性滅菌土壤，抗生素標(biāo)記菌株灌根或噴灑至葉際后，接種病原微生物（青枯、黑脛等病菌），設(shè)置溫、濕度梯度、菌劑使用濃度等環(huán)境變量，研究煙苗病情指數(shù)，表現(xiàn)優(yōu)良的作為菌劑備選。第十六頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三（4）大田試驗選擇菌劑配方根據(jù)實驗室盆栽結(jié)果，多點選擇合適的煙田，跟蹤菌劑在煙草生長期內(nèi)在根際、葉際的定植規(guī)律，研究對煙草品質(zhì)的影響。實驗結(jié)果表現(xiàn)較好的菌劑作為生產(chǎn)備選。第十七頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三（5）確定菌種生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)，開展中試研究，確定產(chǎn)品劑型、存放條件。與企業(yè)合作，研究菌劑發(fā)酵生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)和技術(shù)參數(shù)，降低成本，以工業(yè)化生產(chǎn)為前提，研究所選用基質(zhì)配方的規(guī)模化生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)，并確定生產(chǎn)各環(huán)節(jié)的相應(yīng)技術(shù)參數(shù)，為功能生物有機肥的研發(fā)提供支撐。研究液態(tài)、固態(tài)菌劑的保存方法及相應(yīng)保存時間，活菌或數(shù)量變化趨勢，研究不同保存環(huán)境條件（光、溫度、pH、含水量等）對菌劑活力影響，優(yōu)化得出適宜的生產(chǎn)、保存及運輸條件。第十八頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三（6）研究菌劑在土壤中遷移、繁殖規(guī)律，對土壤微生態(tài)的影響。抗生素標(biāo)記菌劑分別對田間煙苗采用灌根等接種技術(shù)，研究在煙草根際、葉際、維管束定植規(guī)律，PCR-DGGE、克隆文庫技術(shù)、T-RFLP、Biolog等技術(shù)研究菌劑對土壤微生物生態(tài)影響，闡明菌劑的施用對煙草土傳病害病原菌的拮抗作用及抑制病原菌生長的機理。第十九頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三2、技術(shù)路線第二十頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三五、預(yù)期達到的目標(biāo)1、成果形式（1）構(gòu)建適應(yīng)桂陽煙區(qū)特點的益生微生物菌庫1個，菌庫容量高于20種微生物。（2）產(chǎn)品：田間證明有效，達到申請國家微生物肥料產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的微生物菌劑產(chǎn)品1-2個，并已通過中試生產(chǎn)。（3）論文2-4篇。（4）專利1-2項。（5）施用項目研發(fā)的菌劑后，植煙土壤微生態(tài)改良、土傳病害降低，發(fā)病指數(shù)比對照煙田病情指數(shù)降低20%。第二十一頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三2、經(jīng)濟指標(biāo)：預(yù)計項目結(jié)束后，每畝煙草施用菌劑10公斤，按3元/公斤，每年推廣20萬畝，控制生產(chǎn)成本不高于0.7元/公斤，此項目5年內(nèi)新增產(chǎn)值就達300萬元之多，本項目生產(chǎn)菌劑在防治煙草青枯病、黑脛病的同時，具有防治茄科作物土傳病害的潛力，通過在煙草栽培中的示范性應(yīng)用，將會帶來可觀的經(jīng)濟效益。第二十二頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三六、具體實施措施

1、建立項目組，以項目的形式實施郴州市煙草科學(xué)研究所、河南工程學(xué)院資源與環(huán)境工程學(xué)院共同牽頭，郴州市煙草公司桂陽縣分公司，三個單位根據(jù)各自特點具體組織實施。

2、在河南工程學(xué)院和重慶市煙草研究所建立菌種選育研究平臺，進行菌株選育和分析研究。

3、項目組將成立技術(shù)組，研發(fā)關(guān)鍵技術(shù)，引進成熟經(jīng)驗，制定祥盡的技術(shù)實施方案。

4、研究、試驗、示范、培訓(xùn)、具體實施相結(jié)合。第二十三頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三七、項目開展的條件及已經(jīng)進行的部分工作（一）項目開展的條件1、市、縣公司的大力支持，煙農(nóng)的迫切需要。2、相關(guān)文獻得成功報道、已有的工作基礎(chǔ)可確保項目的可行性。3、已經(jīng)組建了具有豐富經(jīng)驗的7人工作團隊，項目展開具有具有可靠的硬件配備4、已有相應(yīng)的菌劑中試廠家。第二十四頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三（二）已有的工作基礎(chǔ)：1、項目申報單位湖南省煙草公司郴州市公司在從傳統(tǒng)煙葉生產(chǎn)向現(xiàn)代煙草農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)變方面，做了許多有益的研究與探索，并取得良好成效，積累了豐富的經(jīng)驗。。2、郴州市公司與河南工程學(xué)院在2010就開展了針對桂陽縣旱田煙草青枯病生物防治的科研工作，連續(xù)兩年從桂陽仁義石坡、桂陽樟市曹新橋曹溪、桂陽樟市山背、桂陽仁義王泗煙草青枯病發(fā)病嚴(yán)重地區(qū)取樣70個，調(diào)查煙草青枯病發(fā)病株與未發(fā)病株、旱田與水田根際微生物群落種群均一度、種群豐富度，種群類別等指標(biāo)，并進行跟蹤、對比分析，兩年中共分離出優(yōu)勢細菌60余株、芽孢桿菌87株，分離出煙草青枯病病原菌5株。第二十五頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三第二十六頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三項目組已從重慶市、湖北省恩施市煙田取樣，分離出優(yōu)勢細菌、芽胞桿菌上簽株。項目組已開展綠色木霉、哈茨木霉等菌株與病原菌拮抗的相關(guān)研究。已成功將分離出的煙草青枯病原菌進行利福霉素、青霉素等抗生素標(biāo)記。實驗室拮抗實驗已經(jīng)展開，并在盆栽比較實驗中選取到相比對照切實降低青枯病數(shù)量的菌株三株。實驗室已經(jīng)開展抗生素標(biāo)記菌株在不同環(huán)境下環(huán)境行為研究。第二十七頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期三菌株平板涂布濃度生長情況Q33-6RIF20mg/mL150μL++