第十六抗生素類藥物分析演示文稿

第十六抗生素類藥物分析演示文稿當前第1頁\共有103頁\編于星期六\17點優(yōu)選第十六抗生素類藥物分析當前第2頁\共有103頁\編于星期六\17點一、抗生素的定義及特點◆低化學純度－同系物多、異構(gòu)體多、降解物多◆活性組分的變異性－生產(chǎn)過程中條件的變化◆不穩(wěn)定性－不穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)

是指“生物在其生命活動中產(chǎn)生的，能在低微濃度下有選擇地抑制或影響它種生物機能的化學物質(zhì)的總稱”當前第3頁\共有103頁\編于星期六\17點抗生素的分類β－內(nèi)酰胺類抗生素四環(huán)素類抗生素氨基糖苷類抗生素大環(huán)內(nèi)酯類抗生素多烯大環(huán)類抗生素－制菌霉素、兩性霉素多肽類抗生素－放線菌素、多黏菌素酰胺醇類抗生素－氯霉素抗腫瘤類抗生素其他抗生素二、抗生素類藥物的分類按化學結(jié)構(gòu)分當前第4頁\共有103頁\編于星期六\17點三、抗生素類藥物的細菌耐藥性當前第5頁\共有103頁\編于星期六\17點當前第6頁\共有103頁\編于星期六\17點當前第7頁\共有103頁\編于星期六\17點當前第8頁\共有103頁\編于星期六\17點三、抗生素類藥物的細菌耐藥性◆1、耐藥性的種類固有耐藥性：天然耐藥性，由細菌染色體基因決定獲得性耐藥性：◆2、耐藥的機制（1）產(chǎn)生滅活酶，使抗菌藥失活如β-內(nèi)酰胺酶（2）抗菌藥物作用靶位改變（3）降低細菌外膜通透性（4）影響主動流出系統(tǒng)當前第9頁\共有103頁\編于星期六\17點當前第10頁\共有103頁\編于星期六\17點四、抗生素藥物的質(zhì)量分析鑒別試驗㈠1、官能團的顯色反應(yīng)－特殊基團的反應(yīng)2、光譜法－特征吸收3、色譜法－保留行為4、生物學方法－抗菌能力當前第11頁\共有103頁\編于星期六\17點㈡檢查1、影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的檢查項目－水份、酸堿度等2、控制有機和無機雜質(zhì)的檢查項目3、與臨床安全性密切相關(guān)的檢查項目－異常毒性、熱原等4、其他檢查項目－其他共存組分當前第12頁\共有103頁\編于星期六\17點㈢含量或效價測定1、微生物檢定法比濁法管碟瓊脂擴散法－抑菌圈Potency:是指每ml或每mg中含有某種抗生素有效成分的多少U/mg是以抗生素對微生物的殺傷或抑制程度為指標來判斷效價的一種方法方法當前第13頁\共有103頁\編于星期六\17點靈敏度高、需用量少適用范圍廣－純品、不純品、已知的和新的可一次測定同類型抗生素的總效價－無需分離純化與臨床的應(yīng)用要求一致操作繁瑣、費時費力誤差較大是結(jié)構(gòu)復雜和多組分抗生素效價測定的首先方法優(yōu)點㈢含量或效價測定1、微生物檢定法缺點當前第14頁\共有103頁\編于星期六\17點2、物理化學法

HPLCLC-MSUV

容量法準確可靠、專屬性高、操作簡單、省時、樣品用量少1、對結(jié)構(gòu)已知或提純的抗生素2、需要標準品對照儀器分析方法㈢含量或效價測定當前第15頁\共有103頁\編于星期六\17點第二節(jié)β-內(nèi)酰胺類抗生素當前第16頁\共有103頁\編于星期六\17點β-內(nèi)酰胺類抗生素6-氨基青霉烷酸（6-APA）；青霉素類；7-氨基頭孢菌烷酸（7-ACA）；頭孢菌素類；一、結(jié)構(gòu)及分類氫化噻嗪環(huán)氫化噻唑環(huán)當前第17頁\共有103頁\編于星期六\17點青霉素（青霉素鉀、鈉）當前第18頁\共有103頁\編于星期六\17點氨芐西林

（氨芐青霉素）當前第19頁\共有103頁\編于星期六\17點阿莫西林

（羥氨芐青霉素）當前第20頁\共有103頁\編于星期六\17點普魯卡因青霉素當前第21頁\共有103頁\編于星期六\17點頭孢氨芐當前第22頁\共有103頁\編于星期六\17點頭孢羥氨芐當前第23頁\共有103頁\編于星期六\17點㈡理化性質(zhì)1、酸性與溶解性2、旋光性3、紫外吸收特性4、不穩(wěn)定性當前第24頁\共有103頁\編于星期六\17點酸性一、結(jié)構(gòu)特點與性質(zhì)Na與堿金屬(Na+、K+)成鹽

（一）羧基

易溶于水

當前第25頁\共有103頁\編于星期六\17點與有機堿(普魯卡因)成鹽

難溶于水普魯卡因青霉素當前第26頁\共有103頁\編于星期六\17點（二）手性C

頭孢菌素類

C6C7青霉素類C3C5C6

旋光性﹡﹡﹡﹡﹡當前第27頁\共有103頁\編于星期六\17點

（三）共軛體系

頭孢菌素類母核有共軛體系

青霉素類母核無明顯UV

多數(shù)有苯環(huán)取代基

UV當前第28頁\共有103頁\編于星期六\17點（四）β–內(nèi)酰胺環(huán)的不穩(wěn)定性

水溶液

不穩(wěn)定

干燥純凈

穩(wěn)定

不穩(wěn)定性因素四元環(huán)張力大

酰胺鍵易水解

含水量純度

當前第29頁\共有103頁\編于星期六\17點青霉素類

某些氧化劑酸、堿、青霉素酶（某些金屬離子）（溫度）降解失效（四）β–內(nèi)酰胺環(huán)

當前第30頁\共有103頁\編于星期六\17點與含水量和純度密切相關(guān)青霉素的降解途徑當前第31頁\共有103頁\編于星期六\17點青霉素的降解產(chǎn)物青霉噻唑酸－青霉素酶青霉酸－強酸性環(huán)境青霉烯酸－弱酸性環(huán)境青霉醛－強酸性-加熱青霉胺－強酸性-加熱/青霉素酶-重金屬降解產(chǎn)物當前第32頁\共有103頁\編于星期六\17點二、鑒別反應(yīng)（一）顯色反應(yīng)1、異羥肟酸鐵反應(yīng)當前第33頁\共有103頁\編于星期六\17點2.茚三酮反應(yīng)

α-氨基-氨基茚三酮藍紫色當前第34頁\共有103頁\編于星期六\17點3.雙縮脲反應(yīng)（開環(huán)分解）-內(nèi)酰胺類堿性酒石酸銅紫當前第35頁\共有103頁\編于星期六\17點當前第36頁\共有103頁\編于星期六\17點4.與重氮苯磺酸反應(yīng)橙黃色重氮苯磺酸--56OHHC（偶合）酚羥基頭孢哌酮當前第37頁\共有103頁\編于星期六\17點1.K+、Na+的火焰反應(yīng)（二）各種鹽的反應(yīng)

焰色→鮮黃色

+醋酸氧鈾鋅→↓黃

Na+

焰色→紫色

+0.1%四苯硼鈉→↓白

K+當前第38頁\共有103頁\編于星期六\17點2.沉淀反應(yīng)（青霉素鹽）遇酸→↓在過量HCl或有機溶劑中溶解白青霉素青霉素鈉

青霉素鉀

+H+當前第39頁\共有103頁\編于星期六\17點3.重氮化-偶合反應(yīng)

重氮化-偶合反應(yīng)芳伯氨基當前第40頁\共有103頁\編于星期六\17點光譜法（三）1、UV法樣品、分解產(chǎn)物Cu2+頭孢氨芐λmax=262nm青霉素V鈉

A280nm/A264nm=1.30～1.50當前第41頁\共有103頁\編于星期六\17點當前第42頁\共有103頁\編于星期六\17點2、IR法3180cm-1N-Hβ–內(nèi)酰胺C=O1690cm-1仲酰胺C=O1250cm-1C-O以阿莫西林為例當前第43頁\共有103頁\編于星期六\17點色譜法（四）1、TLC法對照品對照法2、HPLC法當前第44頁\共有103頁\編于星期六\17點三、雜質(zhì)檢查

藥物

檢查項目

檢查方法

頭孢他啶聚合物HPLC法

頭孢曲松鈉

頭孢哌酮鈉

頭孢噻肟鈉

頭孢呋辛酯有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體HPLC法

頭孢氨芐有關(guān)物質(zhì)反相TLC法

青霉素鉀（鈉）吸收度紫外分光光度法

當前第45頁\共有103頁\編于星期六\17點

1.頭孢他啶聚合物的測定分子排阻色譜法

固定相：葡聚糖凝膠G-10

流動相A：3.5%硫酸銨的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液

流動相B：0.01%十二烷基硫酸鈉

對照品溶液：頭孢他啶對照品100μg/ml

當前第46頁\共有103頁\編于星期六\17點1）系統(tǒng)適用性試驗：理論塔板數(shù)和拖尾因子用1mg/ml藍色葡聚糖2000、流動相A測定；重復性用對照品溶液、流動相B測定。

N不低于900，拖尾因子0.75~1.5，峰面積的RSD應(yīng)小于5.0%

2）測定方法

進樣供試液，用流動相A；進樣對照液，用流動相B。以外標法計算，含頭孢他啶聚合物以頭孢他啶計不得超過0.3%。當前第47頁\共有103頁\編于星期六\17點2.頭孢呋辛酯中有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體的檢查

固定相：ODS

流動相：0.2mol/L磷酸二氫銨-甲醇（62:38）

1）頭孢呋辛酯Δ2-異構(gòu)體的制備：頭孢呋辛酯對照品+流動相頭孢呋辛酯Δ2-異構(gòu)體。

2）系統(tǒng)適用性試驗：各異構(gòu)體之間的R>1.5，以頭孢呋辛酯A異構(gòu)體計算n>1500。當前第48頁\共有103頁\編于星期六\17點

3）異構(gòu)體：

相對保留時間1--被測物

2--標準物異構(gòu)體相對保留時間判斷B異構(gòu)體0.85供試液譜圖中A異構(gòu)體的峰面積A異構(gòu)體1.0與A、B異構(gòu)體峰面積和之比應(yīng)為0.48~0.55。

異構(gòu)體A異構(gòu)體B頭孢呋辛當前第49頁\共有103頁\編于星期六\17點3.頭孢氨芐中有關(guān)物質(zhì)的檢查-反相TLC法

固定相：活化后的硅膠G板置5%（V/V）正十四烷的正己烷溶液中，展至頂部，涼干展開劑：0.1mol/L枸櫞酸-0.2mol/L磷酸氫二鈉-丙酮（120：80：3）

供試液：本品50mg/ml

對照液（1）：本品0.5mg/ml

對照液（2）：α-苯甘氨酸0.5mg/ml

對照液（3）：7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸

0.5mg/ml當前第50頁\共有103頁\編于星期六\17點結(jié)果判斷：供試液如顯雜質(zhì)斑點，與對照液（2）（3）位置相同上所的斑點比較，其顏色不得更深；如顯其他雜質(zhì)斑點，與對照液（1）所顯的主斑點比較，其顏色不得更深。當前第51頁\共有103頁\編于星期六\17點4.青霉素鈉（鉀）的吸收度檢查：供試液1.80mg/ml，

結(jié)果判斷：A280不得大于0.10當前第52頁\共有103頁\編于星期六\17點（一）高效液相色譜法原理：利用青霉素類抗生素在一定條件下在反相硅膠上的保留行為的不同而實現(xiàn)高效分離，并與標準品相對照，而對其進行定量的一種方法。優(yōu)化色譜分析條件（1）Column-CNODSC18C8-Ben（2）mobilephase/flowrate（3）columntemperature（4）detectionwavelength（5）workstationsamplepreparation四、含量測定-容量法和儀器分析法當前第53頁\共有103頁\編于星期六\17點實驗注意事項（1）色譜峰要達到較好的分離－基線分離(baseseparation)（2）需要標準品對照，用外標法定量（3）可同時測定多個組分的含量（4）需要排除制劑中輔料等雜質(zhì)對測定的干擾當前第54頁\共有103頁\編于星期六\17點（二）生物樣本中β-內(nèi)酰胺類抗生素的分析血漿尿樣唾液膽汁生物樣本色譜柱：HypersilODSC18(200mm×4.6mm,I.D.5μm)樣品制備：取血漿200μL，加入內(nèi)標5μL，再加入HCLO4，窩旋提取InternalstandardIS當前第55頁\共有103頁\編于星期六\17點當前第56頁\共有103頁\編于星期六\17點第三節(jié)氨基糖苷類抗生素當前第57頁\共有103頁\編于星期六\17點第三節(jié)氨基糖苷類抗生素鏈霉素雙氫鏈霉素新霉素卡那霉素慶大霉素巴龍霉素當前第58頁\共有103頁\編于星期六\17點鏈霉素鏈霉胍+鏈霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺

苷元糖鏈霉雙糖胺當前第59頁\共有103頁\編于星期六\17點鏈霉素：鏈霉胍鏈霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺當前第60頁\共有103頁\編于星期六\17點巴龍霉素D-葡萄糖胺+脫氧鏈霉胺+D-核糖+巴龍霉糖巴龍胺苷元巴龍二糖胺

糖當前第61頁\共有103頁\編于星期六\17點慶大霉素

糖苷元絳紅糖胺+脫氧鏈霉胺+加洛糖胺

糖當前第62頁\共有103頁\編于星期六\17點絳紅糖胺紫素胺2-脫氧鏈霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺當前第63頁\共有103頁\編于星期六\17點慶大霉素C復合物慶大霉素C1R=HR1、R2=CH3

慶大霉素C2R=R2=H

R1=CH3

慶大霉素C1aR、R1、R2=H

慶大霉素C2aR=CH3R1=R2=H慶大霉素C2bR=R1=HR2=CH3當前第64頁\共有103頁\編于星期六\17點一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)多與硫酸成鹽鏈霉素

3個慶大霉素5個堿性中心堿性（一）水溶性溶解性（二）當前第65頁\共有103頁\編于星期六\17點鏈霉素

pH5～7.5慶大霉素

pH2～12

穩(wěn)定穩(wěn)定性（四）UV（三）當前第66頁\共有103頁\編于星期六\17點坂口反應(yīng)N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)麥芽酚反應(yīng)當前第67頁\共有103頁\編于星期六\17點二、

鑒別

茚三酮反應(yīng)（一）△羥基胺結(jié)構(gòu)當前第68頁\共有103頁\編于星期六\17點

（2）Molisch反應(yīng)具有五碳糖或六碳糖的氨基糖苷類抗生素經(jīng)酸水解后，在鹽酸作用下脫水生成糠醛或羥甲基糠醛，加入α–萘酚（紅紫色）或蒽酮（藍紫色）當前第69頁\共有103頁\編于星期六\17點紅紫色當前第70頁\共有103頁\編于星期六\17點

（3）Elson-Morgan反應(yīng)水解產(chǎn)生的N-甲基-L-葡萄糖胺在堿性溶液中與乙酰丙酮合成吡咯衍生物，再與對二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反應(yīng)，生成櫻桃紅色縮合物。藍紫色當前第71頁\共有103頁\編于星期六\17點

（4）麥芽酚反應(yīng)－鏈霉素的特征反應(yīng)鏈霉素水解得到的鏈霉糖經(jīng)分子重排使環(huán)擴大形成六元環(huán)，然后消除N-甲基葡萄糖胺，再消除鏈霉胍，生成α-甲基-β-羥基-γ-吡喃酮（麥芽酚），該化合物與Fe3+在弱酸性溶液中形成紅紫色配位化合物。當前第72頁\共有103頁\編于星期六\17點紫紅麥芽酚當前第73頁\共有103頁\編于星期六\17點（5）坂口反應(yīng)－鏈霉胍的特有反應(yīng)向鏈霉素的水解產(chǎn)物鏈霉胍與NaBrO2反應(yīng)得產(chǎn)物1；8-羥基喹啉也和NaBrO2反應(yīng)得產(chǎn)物2。產(chǎn)物1和產(chǎn)物2再相互作用生成橙紅色化合物。當前第74頁\共有103頁\編于星期六\17點（八）色譜法（1）TLC法：硫酸慶大霉素的鑒別

點樣：供試液：展開、涼干、碘蒸氣中顯色

對照液

判斷：供試液與對照液所顯斑點的顏色與位置應(yīng)一致。

點樣：供試液

對照液①：硫酸鏈霉素標準品

對照液②：硫酸鏈霉素標準品+硫酸新霉素標準品+硫酸卡那霉素標準品

當前第75頁\共有103頁\編于星期六\17點判定法：供試液中主斑點的位置、顏色、大小應(yīng)與對照液①相同，

對照液②應(yīng)顯示分離清晰的3個斑點否則試驗無效。

（2）HPLC法：硫酸慶大霉素的鑒別

比較供試液與對照液各組分的保留時間。當前第76頁\共有103頁\編于星期六\17點

特殊雜質(zhì)的檢查（1）鏈霉素中鏈霉素B的檢查－TLC法硅膠G板（使用前需活化）、展開劑甲苯-冰乙酸-甲醇（50:25:25）、0.2％二羥萘的乙醇－20％硫酸混合液（2）慶大霉素中組分C的檢查－衍生化后HPLC色譜柱、流動相、檢測波長、衍生化條件的摸索

組分C的毒副作用和耐藥性與慶大霉素有差異，導致產(chǎn)品的效價和臨床療效當前第77頁\共有103頁\編于星期六\17點++410.pH吲哚衍生物巰基醋酸鄰苯二醛氨基λmax=330nm衍生化原理

1.當前第78頁\共有103頁\編于星期六\17點1-烷基硫代-2-烷基異吲哚衍生物當前第79頁\共有103頁\編于星期六\17點RP－HPLC方法

2.規(guī)定C125~50%C1a15~40%C2a+C220~50%計算

3.峰面積歸一化法當前第80頁\共有103頁\編于星期六\17點當前第81頁\共有103頁\編于星期六\17點四、

含量測定微生物檢定法各國藥典主要采用HPLC法常用于體內(nèi)藥分

返回當前第82頁\共有103頁\編于星期六\17點第四部分：四環(huán)素類抗生素TrtracyclinesTC當前第83頁\共有103頁\編于星期六\17點

理化特性（1）酸堿兩性－C4（二甲氨基）、C10（酚羥基）（2）旋光性－含有手性中心（一般為左旋）（3）紫外吸收特性－具有共軛雙鍵體系（吸收波長為長波方向）（4）與金屬離子的配位化合物反應(yīng)－酚羥基和烯醇基（5）不穩(wěn)定性－對各種外界條件，包括氧化劑、酸、堿，易形成差向、脫水和異四環(huán)素，顏色加深當前第84頁\共有103頁\編于星期六\17點弱酸性環(huán)境ETC差向四環(huán)素當前第85頁\共有103頁\編于星期六\17點強酸性環(huán)境ATC脫水四環(huán)素當前第86頁\共有103頁\編于星期六\17點堿性環(huán)境EATC異四環(huán)素差向脫水四環(huán)素當前第87頁\共有103頁\編于星期六\17點二、

鑒別試驗

濃H2SO4反應(yīng)（一）黃色朱紅色綠藍深紫色鹽酸多西環(huán)素鹽酸土霉素鹽酸金霉素鹽酸四環(huán)素42SOH鹽酸美他環(huán)素橙紅色當前第88頁\共有103頁\編于星期六\17點FeCl3反應(yīng)（二）褐色橙褐色深褐色紅棕色鹽酸多西環(huán)素鹽酸土霉素鹽酸金霉素鹽酸四環(huán)素3FeCl當前第89頁\共有103頁\編于星期六\17點TLC法（三）鹽酸土霉素的鑒別

HPLC法（五）EDTA

克服痕量金屬造成的拖尾現(xiàn)象比較保留時間當前第90頁\共有103頁\編于星期六\17點三、

特殊雜質(zhì)檢查

·

4-差向四環(huán)素（ETC）

·脫水四環(huán)素（ATC）

·差向脫水四環(huán)素（EATC）

·鹽酸金霉素（CTC）

有關(guān)物質(zhì)（一）HPLC法（2000版）鹽酸四環(huán)素當前第91頁\共有103頁\編于星期六\17點四環(huán)素有關(guān)物質(zhì)TLC圖I.供試液(5mg/ml)ETC(0.2mg/ml)

ATC(0.025mg/ml)IV.EATC(0.025mg/ml)CTC(0.1mg/ml)VI.混合液4％0.5％0.5％2％當前第92頁\共有103頁\編于星期六\17點吸收度（二）nmmax355268l、鹽酸四環(huán)素當前第93頁\共有103頁\編于星期六\17點雜質(zhì)吸收度

取供試品配成每10mg/ml的溶液至4cm的吸收池中，在530nm處測定，其吸收度不得超過0.12。應(yīng)嚴格控制溫度和時間當前第94頁\共有103頁\編于星期六\17點四、

含量測定HPLC法

鹽酸四環(huán)素的測定

系統(tǒng)適用性試驗：鹽酸四環(huán)素、有關(guān)物質(zhì)及ATC峰間的分離度均應(yīng)符合要求。

定量方法：外標法以