鉛對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞鈣電流地影響

響姜允申 肖 響姜允申 肖 杭 戴曉青 (南京醫(yī)科大學(xué)毒理教研室, 南京210029)外來(lái)化合物在機(jī)體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)運(yùn)和生物轉(zhuǎn)化過(guò)程與細(xì)胞膜密切相關(guān),而細(xì)胞膜的正常結(jié)構(gòu)對(duì)維持細(xì)胞正常的生理功能和信息傳遞又至關(guān)重,因此外來(lái)化合物在機(jī)體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)與轉(zhuǎn)化過(guò)程中是否會(huì)導(dǎo)致膜損傷(結(jié)構(gòu)或功能)近年來(lái)引起關(guān)。鈣離子的生物學(xué)作用近年來(lái)研究很深入,鈣已作為體內(nèi)第二信使之一,細(xì)胞內(nèi)游離鈣在完成信息傳遞過(guò)程中起著重要作用1,但Ca2+濃度的變化呈穩(wěn)態(tài)狀,當(dāng)這種穩(wěn)態(tài)狀況發(fā)生改變,可引起一系列復(fù)雜的機(jī)體生活動(dòng)異現(xiàn)已知Ca2+不僅溝通細(xì)胞之間的信息流通,還調(diào)節(jié)細(xì)胞的許多基本活動(dòng),包括細(xì)胞運(yùn)增更新及生殖細(xì)胞受精過(guò)程。本次研究試圖通過(guò)膜片鉗技術(shù)研究鉛對(duì)神經(jīng)細(xì)胞鈣通道電流的作用,來(lái)闡明鉛對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的影。1材料與方法11材料122 全細(xì)胞電壓鉗記錄記錄玻璃微電極用細(xì)胞內(nèi)液充灌,電極電阻～M8,尖端直徑～2m,在電極拉制儀NarihgePP83)上拉制后在拋光儀NarihgeMF83)上拋光后使記錄時(shí)最大濾波頻率為5kH。所記錄細(xì)胞直徑為10～27m,封接過(guò)程中在計(jì)算機(jī)Macnoh7100)監(jiān)控下進(jìn)行,用負(fù)壓吸住細(xì)胞,緩慢加大負(fù)壓使電極尖端與細(xì)胞封,直至封接電阻達(dá)1G8以,然后用負(fù)壓吸破細(xì),破膜后患聯(lián)電阻一般仍在1G8以上,檢測(cè)有較大內(nèi)向膜電流再進(jìn)行下一步實(shí)。記錄高閾值Ca2+電流鉗位電壓為-4mV,刺激電壓從4mV起至3mV,階躍1mV。膜電流經(jīng)-放大器(EPC9,HEA,Gemany)放大,Pule+Pulefit軟件采集系統(tǒng)采樣并儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī),用OR處理資全部實(shí)驗(yàn)在室溫2～27℃進(jìn)所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,統(tǒng)計(jì)處理用t檢。2 結(jié)果111 試劑醋酸鉛Merck),膠原酶(Sg2低濃度Pb2+即對(duì)鈣通道有抑制作用,21001moLPb2+使鈣電流(Ca)峰值減小7±18%(n=7),01moLPb2+使峰值減小405±83%(n=7),1moLPb2+使峰減小91±112%(n=7)Pb2+作用的閾濃度為001mo,最大作用濃度為1moL,在此劑量范圍內(nèi)Pb2+對(duì)鈣電流的作用隨Pb2+濃度的升高而增。1moLPb2+使Ca2+電流的持續(xù)部分減小720±135%(n=7),01moLPb2+使持續(xù)部分減小263±51%(n=7),001moLPb2+使持續(xù)部ma),胰蛋白酶(Sma),四乙胺(TASma),GTPNa2(Sma),ATP(Sma),尼非地CLCOHHEPES(Sma),DNae(上海實(shí)生細(xì)胞生物制品公司),TTX(河北省水產(chǎn)研究公)。112 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年大鼠(10～15g),雌雄兼用(江蘇省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中)。12 方法121背根神經(jīng)節(jié)DRG)神經(jīng)元的分。工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病93·化工勞動(dòng)保護(hù)2000年第21卷第3期減小93·化工勞動(dòng)保護(hù)2000年第21卷第3期減小63±03%(n=7)Pb2+作用的閾濃度為001moL,最大作用濃度為4mo/L,使電流減小90%以上(n=7)Pb2+作用起效很,經(jīng)沖洗后鈣電流部分恢。22鉛對(duì)峰值的抑制作用明顯大于對(duì)持續(xù)部分的抑制作由于細(xì)胞的體積差,同一個(gè)通道電流在不同的細(xì)胞上差別有時(shí)較大,故要一統(tǒng)一標(biāo),即單位膜面積Ca的電流密。對(duì)照組峰電流的電流密度為421±89APF(n=10),Pb2+明顯降低Ca的電流密:001moLPb2+使Ca的電流密度減小53±071%(n=6),01moLPb2+使流密度減小362±92%(n=6),1mo/LPb2+使其減小839±165%(n=6),顯示在一定劑量范圍內(nèi),Pb2+濃度的增加使電流密度減,提示鉛對(duì)通道的激活有抑制作。Pb2+對(duì)Ca2+電流持續(xù)部分電流密度的影響與對(duì)峰電流的一,但作用較。性,但許多離子都能通過(guò)鈣通道進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性型Ca2+內(nèi)。當(dāng)溶液中有Ca2+時(shí),其他離子內(nèi)流即受到抑制,甚至完全阻斷,競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)流及Ca2+對(duì)其他離子的阻斷作用,提示在鈣通道中存在與Ca2+高度親和的位,Pb2+對(duì)鈣通道的阻斷作用可能與這種位點(diǎn)結(jié)合有。Randald等(1995)將神經(jīng)細(xì)胞的電壓門(mén)控的鈣通道分為L(zhǎng)NTP和Q5種亞型2。但隨著鈣通道新的生物物理特性和藥理學(xué)特性不斷發(fā),其分型會(huì)更我們這次要研究了高閾值鈣通道LNL型鈣通道具有激活閾值電流衰減或失活緩慢的特性3N型鈣通道僅存在于神經(jīng)細(xì)胞和突觸部,其激活時(shí)所需的膜電位較高1。鈣通道電流的持續(xù)部分主要與L型鈣道有。而峰電流主要與N型鈣通道有。我們的結(jié),鉛對(duì)峰電流N型的作用明顯大于對(duì)電流持續(xù)部分L型的作Pb2+對(duì)L型鈣通道的作用可能主要影響細(xì)胞內(nèi)K2nae和蛋白酶活性的調(diào)N型鈣通道的鈣電流,是形成動(dòng)作電位的Ca2+成份電位的原因,這種動(dòng)作電位的特征是復(fù)極化相的中上段呈駝峰狀,不僅影響到動(dòng)作電位的復(fù)極,還可能與神經(jīng)末梢釋放遞質(zhì)有關(guān)4。據(jù)此可以推測(cè)鉛對(duì)其作用影響了遞質(zhì)釋。從我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示了鉛作用于鈣通道的不同位點(diǎn),且程度不。Pb2+對(duì)高閾值鈣通道的作用閾值為001moL,Pb2+達(dá)到1moL時(shí),作用即達(dá)飽,這個(gè)濃度很,說(shuō)明Pb2+對(duì)鈣通道的作用相當(dāng)。另外Pb2+的作用也很,目前尚未見(jiàn)到Pb2+對(duì)DRG細(xì)胞慢效應(yīng)。低濃度Pb2+在通道開(kāi)放時(shí)進(jìn)入神經(jīng)元內(nèi)(包括外周和中樞),激活蛋白激酶C,使Ca2+電流幅度降。低濃度的Pb2+可以抑制Ca2+通過(guò)電壓依賴(lài)性鈣通道進(jìn)入胞,且其對(duì)鈣通道上Ca2+位點(diǎn)的結(jié)合力不僅強(qiáng)過(guò)Ca2+本身,還減DRG神經(jīng)元的高閾值鈣通道電流到達(dá)23值的時(shí)間(Tpak)平均為434±08ms(n=10),Pb2+對(duì)Tpak沒(méi)有影。峰電流產(chǎn)生處的電壓為-1～mV,其中80%的細(xì)胞峰電流產(chǎn)生處的電壓為mV,Pb2+對(duì)峰電流產(chǎn)生處的電壓無(wú)影,提示鉛對(duì)通道電壓依賴(lài)性活無(wú)影通道失活曲線(xiàn)經(jīng)Boltman方程擬合得到,觀察Pb2+對(duì)失活曲線(xiàn)的影,發(fā)現(xiàn)對(duì)照的V/為-167±2mV(n=10),V/即通道電流一半失活的電,各濃度級(jí)Pb2+作用后的V/經(jīng)與對(duì)照組t檢驗(yàn)后無(wú)顯著性差,提示鉛不影響通道失。3討論神經(jīng)元的鈣通道具有廣泛功,它不僅與細(xì)胞的電興奮性有關(guān),還與遞質(zhì)釋基因表達(dá)的調(diào)膜興奮性進(jìn)一步調(diào)節(jié)有。Pb2+可通過(guò)電壓依賴(lài)性鈣通道,受體門(mén)控通道阻止Ca2+進(jìn)入神經(jīng)元,但鉛離子在鈣通道上作用的確切位置還不清。鉛通道對(duì)Ca2+有高度的選擇性和通透94·化工勞動(dòng)保護(hù)2000年第21卷第3期94·化工勞動(dòng)保護(hù)2000年第21卷第3期析魯捷(中國(guó)石化集團(tuán)公司職業(yè)病防治研究中心, 北京102500)1對(duì)象與方法11對(duì)象111接觸:選擇石油煉制業(yè)高溫作業(yè)工人120例,其中男性78例,女性42例,平均年齡307歲(2～48歲),高溫作業(yè)平均工齡121年(～30年)。122 根北京市職業(yè)性健康檢查規(guī)范》進(jìn)行體內(nèi)容包:詳細(xì)詢(xún)問(wèn)受檢者的一般情況,包括既往個(gè)人史和職業(yè)接觸,自覺(jué)癥;臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查包括測(cè)量血,內(nèi)外科檢,神經(jīng)科檢查,五官科檢查,胸透,心電圖檢查,血常尿常谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT)尿素氮UN)和血糖(LU)等化驗(yàn)檢。112對(duì)照:選擇同一企業(yè)勞動(dòng)強(qiáng)度相非高溫作業(yè)工人123例,其中男性87例,性36。平均年齡319歲(2～46歲),平均工齡123年(～28年)兩組人員在文化程度上相近,組間年齡無(wú)顯著性差異(F=148,P>005);組間工齡亦無(wú)顯著性差異(F=138,P>005)。12方法121現(xiàn)場(chǎng)勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)調(diào):對(duì)工作現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行高溫監(jiān)測(cè)并分高溫崗位根高溫作業(yè)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(B420084)確高溫的測(cè)量使用天津氣象海洋儀器廠生產(chǎn)的通風(fēng)干濕表DM2型)。123將結(jié)果輸入PC486機(jī),建立Foxbae數(shù)據(jù)庫(kù),并利用ASVerson604軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分。2結(jié)果21 現(xiàn)場(chǎng)勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)調(diào)查進(jìn)入現(xiàn)場(chǎng)同時(shí)測(cè)量室外及工作場(chǎng)所的氣溫和相對(duì)濕,高溫作業(yè)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各崗位進(jìn)行高溫作業(yè)分,高溫作業(yè)崗位主要為IIII級(jí),結(jié)果如表。22自覺(jué)癥狀(見(jiàn)表2)由表2可見(jiàn),接觸組中疲乏無(wú)力癥狀的申1用1:顧祖維主編1醫(yī)學(xué)發(fā)展(第一卷)1北:人民衛(wèi)生出版,1998164RandallA,eta.PhamaoogcaldsectonofmultpetpesofCa2+channelcurrentsnratcerebelargranueneuon.JNeuoc,1995,1:2995FoxAP,eta.Sngechannelreordngofthreetpeofcacmchannelsnchckenoryneuon.JPhysolLond,1987,39:172MlerRG,eta.Multpecacmchannelsandneuonalfuncto.Scence,1987,23:46SmonsTB,eta.eadentersovneadvenalmedularycellsthoughcacmchannel.JNeuochm,1987,4:383