中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)基因工程考研精華

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)《基因工程》考研精華2015-06-2417:40:19中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)《基因工程》考研精華基因工程：誕生于20世紀(jì)70年代。概念：是在分子水平上進(jìn)行的操作，指將多種生物體（供體）的基因或基因組提取出來(lái)，或者人工合成基因，按照人們的愿望，嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，經(jīng)過(guò)體外加工重組，轉(zhuǎn)移到另一種生物體（受體）細(xì)胞中，使之能在受體細(xì)胞遺傳并獲得新的遺傳性狀的技術(shù)。三要素：供體受體載體?；蚬こ痰闹饕獌?nèi)容：1.目的基因的獲取2.重組體的制備3.重組體的轉(zhuǎn)化4、克隆鑒定5、目的基因的表達(dá)限制性內(nèi)切酶：是一種能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核酸序列（4-8bp）并由此處切割雙鏈的核酸內(nèi)切酶。1、來(lái)源：原核生物2、性質(zhì)：在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口3、功能：自身保護(hù)作用（R/M體系：保護(hù)自身的DNA不受限制，破壞外源的DNA使之迅速講解）影響限制酶活性的主要因素：1、DNA的純度2、DNA的甲基化程度3、溫度4、緩沖溶液5、DNA的分子結(jié)構(gòu)Klenow片段：E.coliDNA聚合酶I經(jīng)胰蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶部分水解生成的C末端605個(gè)氨基酸殘基片段。該片段保留了DNA聚合酶I的5'-3’聚合酶和3'-5,外切酶活性，但缺少完整酶的5'-3,外切酶活性。功能：1、3’斷的補(bǔ)平；2、DNA3'末端標(biāo)記；3、cDNA第二鏈的合成。平齊末端DNA的連接方法：1、同聚物加尾法2、銜接物法；3、接頭連接發(fā)。雙酶切相對(duì)單酶切的優(yōu)點(diǎn)：可保證插入外源片段的方向，防止載體自連，提高重組率。星號(hào)活性：在非理想的條件下，內(nèi)切酶切割與識(shí)別位點(diǎn)相似但不完全相同的序列，這一現(xiàn)象稱星號(hào)活性。部分酶切：指選用的核酸內(nèi)切酶對(duì)其在DNA分子上的全部識(shí)別序列進(jìn)行不完全的切割。發(fā)生部分酶切的原因：底物DNA純度低；識(shí)別序列甲基化；酶用量不足；反應(yīng)緩沖液和溫度不適宜。堿性磷酸酶和S1磷酸酶的功能：堿性磷酸酶主要是脫磷酸作用，其產(chǎn)物具有5-OH末端，這種功能使它在DNA分子克隆實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮著重要作用，利用該酶可以有效防止粘性末端分子自連。S1核酸酶：是一種高度單鏈特異的核酸內(nèi)切酶，可降解單鏈DNA或RNA,不僅能催化RNA和單鏈DNA分子降解成為5單核甘酸，而且它也能作用于雙鏈核背酸單鏈區(qū)。功能：測(cè)定雜種核酸分子的雜交程度，給RNA分子定位，測(cè)定真核生物基因中間隔子序列的位置，探測(cè)雙螺旋的DNA區(qū)域，從限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端中移去單位鏈突出序列以及打開(kāi)雙鏈cDNA合成期間形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。載體：在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子叫載體?；蚬こ虒?duì)載體的要求：1、在宿主細(xì)胞能獨(dú)立復(fù)制2、有選擇性標(biāo)記3、有一段多克隆位點(diǎn)4、分子量小、拷貝數(shù)多5、容易從宿主細(xì)胞中分離純化質(zhì)粒載體必須具備的條件：1、具有復(fù)制起點(diǎn)2、具有抗菌素抗性基因3、若干限制酶的單一位點(diǎn)4、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)質(zhì)粒的分離：通常加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉（SDS）來(lái)促使大腸桿菌的裂解。1、氯化銫密度梯度離心法2、堿變性法3、微量堿變性法質(zhì)粒載體的基本構(gòu)型：1、共價(jià)閉合環(huán)狀DNA2、開(kāi)環(huán)DNA3、線性DNA表達(dá)型質(zhì)粒載體：主要使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物，如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須使所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄和翻譯之下。穿梭質(zhì)粒載體：人工構(gòu)建的具有兩種不同重復(fù)起點(diǎn)和選擇標(biāo)記，可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。大腸桿菌表達(dá)載體的操縱元件：阻遏基因I，操縱基因0,啟動(dòng)基因P，核糖體結(jié)合位序列，轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。質(zhì)粒載體不穩(wěn)定的因素：1、結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性：DNA的插入，缺失和重排都會(huì)造成質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。2、分離的不穩(wěn)定:在寄主菌細(xì)胞分裂的過(guò)程中，有一個(gè)細(xì)胞沒(méi)有獲得質(zhì)粒拷貝，并最終繁殖成無(wú)質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群體。影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素：1、新陳代謝負(fù)荷a、復(fù)制負(fù)荷b、轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷2、質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)3、寄主菌的重組體系PCR的原理和特點(diǎn)：原理：類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高，使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸，這種變性、復(fù)性、延伸的過(guò)程，就是一個(gè)PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。特點(diǎn)：1、靈敏度高2、簡(jiǎn)便快捷3、對(duì)標(biāo)本的純度要求低反向PCR:是用反向互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段，對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的位置序列進(jìn)行擴(kuò)增。RT-PCR：是以反轉(zhuǎn)錄的cDNA做模板進(jìn)行的PCR反應(yīng)，用于測(cè)定基因表達(dá)的強(qiáng)度和鑒定已知序列是否發(fā)生突變，呈現(xiàn)mRNA多態(tài)性，克隆mRNA5'和3'末端序列，以及從非常少量的mRNA樣品構(gòu)建大容量的cDNA文庫(kù)。多重PCR:在一個(gè)反應(yīng)體系中，使用一對(duì)以上引物的PCR反應(yīng)，稱為多重PCR。熒光定量PCR：通過(guò)熒光染料火熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件，可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析、計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量。引物設(shè)計(jì)的基本原則：1、引物一般在18-30Bp為宜。2、避免引物內(nèi)部出現(xiàn)出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)、回文結(jié)構(gòu)。3、GC和AT堿基均勻分布4、避免出現(xiàn)兩引物堿基末端互補(bǔ)5、引物3'末端堿基一般應(yīng)與DNA嚴(yán)格配對(duì)6、引物堿基序列不能與非擴(kuò)增區(qū)有同源性。PCR產(chǎn)物不正常的原因：1、沒(méi)有PCR產(chǎn)物a/TAQ酶失活b、引物使用錯(cuò)誤c、是否完全解鏈。2、沒(méi)有特異性條帶a/退火溫度過(guò)低，退貨延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)b/循環(huán)次數(shù)過(guò)多c/引物與TAQ酶的濃度過(guò)高d/Mg離子濃度過(guò)高3、沒(méi)有目的條帶，出現(xiàn)片狀。a/循環(huán)次數(shù)過(guò)多b/TAQ酶濃度過(guò)高c、引物特異性不強(qiáng)d/Mg離子濃度過(guò)高目的基因：那些已被或者準(zhǔn)備要分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的特定基因或DNA片段?；蛭膸?kù)：又稱DNA文庫(kù)，是指某個(gè)生物的DNA或cDNA片段，與適當(dāng)?shù)妮d體在體外重組后，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并通過(guò)一定的選擇機(jī)制篩選后得到的大量的陽(yáng)性菌落（或噬菌體），所有菌落或噬菌體的集合，即為該生物的基因文庫(kù)。基因組文庫(kù)：指將某種生物的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長(zhǎng)度范圍的DNA片段，再與合適的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽(yáng)性菌落。這個(gè)群體就稱為該生物的基因組文庫(kù)，其目的是分離有用的目的基因和保存某種生物的全部基因?；蚪M文庫(kù)構(gòu)建的程序：1、載體的制備2、高純度大相對(duì)分子質(zhì)量基因組DNA的提取和大片段的被3、高純度大相對(duì)分子質(zhì)量基因組DNA的部分酶切與脈沖電泳分級(jí)分離。4、載體與外源片段的鏈接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞?；蚪M文庫(kù)的優(yōu)點(diǎn)：1、cDNA克隆只能反映著mRNA的分子結(jié)構(gòu)，沒(méi)有包括基因組的間隔序列2、cDNA文庫(kù)中，不同克隆mRNA的分布狀態(tài)總是反映著mRNA的分布狀態(tài)。3、從cDNA克隆中，不能克隆到基因組DNA中非轉(zhuǎn)錄段序列，不能用于研究基因編碼區(qū)外調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能。cDNA文庫(kù):指將某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA片段分別與克隆載體重組，儲(chǔ)存于某種受體菌中，該群體就稱為該生物基因組的cDNA文庫(kù)。cDNA文庫(kù)的構(gòu)建：1、細(xì)胞總RNA的提取和mRNA的分離2、第一條cDNA的合成3、第二條cDNA合成4、雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體。CDNA文庫(kù)的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1、cDNA以mRNA為材料，特別適用于某些RNA病毒等的基因組結(jié)構(gòu)，研究有關(guān)基因的克隆分離。2、cDNA文庫(kù)的篩選比較簡(jiǎn)單易行。3、每一個(gè)cDNA文庫(kù)都含有一個(gè)mRNA序列。這樣在目的基因的選擇中，出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率就會(huì)比較小，因此，陽(yáng)性雜交信號(hào)一般都是有意義的，由此選擇出來(lái)的陽(yáng)性克隆將會(huì)含有目的基因。4、cDNA文庫(kù)可用于在細(xì)菌中能進(jìn)行表達(dá)的基因的克隆，直接應(yīng)用與基因工程操作。5、cDNA克隆還可用于真核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)和功能的研究。缺點(diǎn)：1、包含的遺傳信息要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于基因組DNA文庫(kù)，并且受細(xì)胞來(lái)源或發(fā)育時(shí)期的影響。2、雖然反應(yīng)mRNA分子結(jié)構(gòu)和功能信息，但不能直接識(shí)別基因內(nèi)含子序列序列和編碼區(qū)外大調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)和功能方面的信息。3、相應(yīng)于高豐度的mRNA的cDNA克隆所占的比例較高，分離比較容易，而相對(duì)于低豐度的mRNA的cDNA的克隆所占比例較小，分離比較困難。圖為克隆的原理：圖為克隆又稱定位克隆，用該方法分離基因是根據(jù)功能基因在基因組中都有相對(duì)穩(wěn)定的基因座，在利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行精確定位的基礎(chǔ)上，用于目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選DNA文庫(kù)，從而構(gòu)建目的基因區(qū)域的物理圖譜，在利用此物理圖譜通過(guò)染色體步移逐步逼近目的基因或通過(guò)染色體登陸的方法，最終克隆目的基因并通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)可以研究目的基因的功能。程序：1、建立目的基因的遺傳分離群體2、找到與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記3、用遺傳圖或物理作圖將目的基因定位在染色體特定位置4、構(gòu)建含有大插入片段的基因組文庫(kù)5、以與目的基因連鎖的分子標(biāo)記為探針篩選基因組文庫(kù)6.用陽(yáng)性克隆構(gòu)建目的基因區(qū)域的跨疊群7、通過(guò)染色體步移、登陸或跳查，獲得含有目標(biāo)基因的大片段克隆8、通過(guò)亞克隆獲得目標(biāo)的小片段克隆9、通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)驗(yàn)證，最終確定目標(biāo)基因的堿基序列。存在的問(wèn)題：1、需要有精確的遺傳圖譜2、遺傳圖譜上離目的基因很近的分子標(biāo)記在物理圖譜上還相距甚遠(yuǎn)3、高等植物基因組極其復(fù)雜，存在大量重復(fù)序列，在實(shí)際操作中會(huì)遇到走不動(dòng)的難題。感受態(tài)細(xì)胞：具有攝取外源DNA分子能力的細(xì)胞。常用的轉(zhuǎn)化方法：1、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法2、化學(xué)轉(zhuǎn)化法3、電穿孔發(fā)植物基因工程轉(zhuǎn)化的具體方法：以載體為媒介的遺傳轉(zhuǎn)化和外源目的DNA的直接轉(zhuǎn)化1、載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（最常用的轉(zhuǎn)移方法）將外源基因重組進(jìn)入適合的載體系統(tǒng)，通過(guò)載體將攜帶的外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，整合在核染色體中并隨核染色體復(fù)制而表達(dá)。2、外源基因直接導(dǎo)入法a、化學(xué)刺激法b、基因槍轟擊法c、微注射法主要選擇基因：新霉素抗性基因慶大霉素抗性基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因報(bào)告基因：指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測(cè)定，常用判斷外源基因是否能成功的導(dǎo)入體細(xì)胞，是否啟動(dòng)表達(dá)的一類特殊用途是基因，不依賴于外界選擇壓力的存在，這一點(diǎn)也是它與選擇基因的區(qū)別。種類：B-葡萄糖甘酸酶基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)基酶基因熒光素酶基因理想報(bào)告基因應(yīng)具備的條件：1、受體細(xì)胞不存在相應(yīng)的內(nèi)源等位基因活性2、它的產(chǎn)物是唯一的，且不會(huì)損害受體細(xì)胞3、具有快速、靈敏、廉價(jià)、定量和可重復(fù)的檢測(cè)特性。轉(zhuǎn)基因植物的鑒定方法：1、DNA水平的鑒定檢測(cè)內(nèi)容（是否整合拷貝數(shù)整合位置）檢測(cè)方法：特異性PCRWestern雜交植物基因工程存在的問(wèn)題：1、技術(shù)問(wèn)題a/提高轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)率b、建立高頻再生的基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)c/提高對(duì)轉(zhuǎn)化外源基因表達(dá)的調(diào)控能力d、提高轉(zhuǎn)化外源基因的遺傳穩(wěn)定性2、潛在問(wèn)題a/安全問(wèn)題b、環(huán)境及生態(tài)問(wèn)題c/對(duì)其它安全措施的反效應(yīng)d/公眾的接受。表達(dá)載體：能夠表達(dá)外源基因的載體，包含有啟動(dòng)子、終止子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始密碼子和終止密碼子等表達(dá)原件。簡(jiǎn)并引物：根據(jù)肽鏈的氨基酸序列，并充分考慮密碼子的簡(jiǎn)并性而設(shè)計(jì)的，用于PCR擴(kuò)增的混合引物之間具有不同的堿基組成，但堿基的數(shù)量是相同的包涵體：在某些生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密的積聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹，或形成無(wú)膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)成為包涵體。穿梭載體：能夠在兩類不同的宿主內(nèi)復(fù)制、增殖和選擇的載體，有兩個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，既能在細(xì)菌又能在真核細(xì)胞中進(jìn)行的選擇標(biāo)記，很容易從一個(gè)宿主轉(zhuǎn)移到另一個(gè)宿主。感受態(tài)細(xì)胞：能夠攝取外源DNA分子能力的細(xì)胞。問(wèn)答：基因工程的主要操作內(nèi)容？1、目的基因的獲取2、重組體的制備3、重組體的轉(zhuǎn)化4、克隆鑒定5、目的基因的表達(dá)影響限制酶活性的因素？1、DNA的純度雜質(zhì)：蛋白質(zhì)、酚、氯仿、SDS、EDTA等都會(huì)影響酶的活性。方法：純化DNA加大酶用量延長(zhǎng)保溫時(shí)間擴(kuò)大反應(yīng)體積2、DNA的甲基化程度3、溫度4、緩沖液質(zhì)粒載體必須具備的基本特征？1、獨(dú)立復(fù)制2、有選擇標(biāo)記3、有獨(dú)立的酶切位點(diǎn)4、能轉(zhuǎn)化但不擴(kuò)散cDNA文庫(kù)與基因組文庫(kù)的主要差別？1、基因組文庫(kù)克隆的是任何基因，cDNA文庫(kù)克隆的是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因。2、基因組文庫(kù)克隆的是全部遺傳信息，不受時(shí)空影響；cDNA克隆的是不完全編碼DNA序列，它受發(fā)育和調(diào)控因子的影響。3、基因組文庫(kù)中的編碼基因是真實(shí)基因，很有外顯子和內(nèi)含子，而cDNA文庫(kù)克隆的是不含內(nèi)含子的基因。真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)：1、全基因組測(cè)序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理表達(dá)比較清楚，遺傳操作簡(jiǎn)便。2、具有原核細(xì)菌無(wú)法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)。3、能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中4、大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡(jiǎn)單、成本低廉5、不含有特異性病毒、不產(chǎn)生內(nèi)毒素。PCR技術(shù)產(chǎn)生污染的主要原因和預(yù)防方法？污染原因：1、樣本間交叉污染2、PCR試劑污染3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染4、實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染A/預(yù)防方法:防止污染：試劑小量分裝，吸頭及EP管一次性使用；器皿及工作區(qū)域要分開(kāi);無(wú)菌操作B、設(shè)立對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照包括：標(biāo)本對(duì)照和試劑對(duì)照。影響基因工程菌不穩(wěn)定的原因?qū)Σ撸炕蚬こ痰倪z傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式：重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失，整個(gè)重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸。工程菌遺傳不穩(wěn)定性產(chǎn)生的機(jī)制：受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對(duì)外源重組DNA分子的降解；外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長(zhǎng)代謝；產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)、關(guān)閉合成途徑、啟動(dòng)降解程序；重組質(zhì)粒在降解過(guò)程中的不均勻分配；受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子的缺失重排。改善基因工程菌不穩(wěn)定的策略：1、改進(jìn)載體受體系統(tǒng)2、施加選擇壓力：根據(jù)抗藥性標(biāo)記加入添加相應(yīng)的抗生素等。3、控制目的基因的過(guò)量表達(dá)。PCR的基本原理是什么？用PCR擴(kuò)增是，必須預(yù)先得知什么信息？1/DNA的半保留復(fù)制的原理，在體外進(jìn)行DNA的變性、復(fù)性和引物延伸。2、至少要知道足夠合成一對(duì)引物的靶DNA序列。當(dāng)兩種限制性內(nèi)切酶的作用條件不同時(shí)，若要進(jìn)行雙酶切，應(yīng)采取什么措施？要避免星號(hào)活性及部分酶切。A、先用低鹽緩沖液中活性最高的酶切，再補(bǔ)鹽和第二酶；b、用一種酶消化后，將DNA重新溶解到適合第二種酶的緩沖液，加第二種酶消化。C/先低溫酶，后高溫酶d/使用通用緩沖液。怎樣將一個(gè)平末端DNA片段插入到EcoR1限制位點(diǎn)中去？化學(xué)合成一些長(zhǎng)為10bp含有EcoR1識(shí)別位點(diǎn)的短的DNA片段，然后與待克隆片段兩端連接起來(lái)，如果用EcoR1切割這種連接片段就會(huì)產(chǎn)生EcoR1的單鏈末端，這種片段就可以插入到任何EcoR1的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)中。大腸桿菌表達(dá)載體中啟動(dòng)子必須具備的條件？1、選擇強(qiáng)的啟動(dòng)子及其相關(guān)的調(diào)控序列，是構(gòu)建一個(gè)高效表達(dá)載體首先要考慮的問(wèn)題2、這個(gè)啟動(dòng)子應(yīng)能呈現(xiàn)一種限制的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平3、啟動(dòng)子應(yīng)是可誘導(dǎo)的。如何提高外源基因的表達(dá)效率？1.優(yōu)化發(fā)酵條件，包括誘導(dǎo)時(shí)間這些因素。2.優(yōu)化密碼子（偏好密碼子）3.換啟動(dòng)子4.換載體5.換宿主菌.目的基因的克隆方法：1、根據(jù)基因表達(dá)的產(chǎn)物蛋白質(zhì)進(jìn)行基因克??；主要步驟：分離蛋白-明確氨基酸