外源性VEGF誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜血管病變

外源性VEGF誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜血管病變【摘要】目的：探討外源性VEGF誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜血管病變的特點(diǎn)。方法：大鼠120只隨機(jī)分為正常對照組、rrVEGF164低、高濃度組。不同時間行熒光素眼底血管造影、視網(wǎng)膜電圖振蕩電位、組織學(xué)檢查。結(jié)果：高濃度組注射rrVEGF164眼從注射后10d表現(xiàn)為眼底后極部視網(wǎng)膜動脈局限性高熒光，2wk時表現(xiàn)為單個視網(wǎng)膜內(nèi)核層毛細(xì)血管管腔窄小，內(nèi)皮細(xì)胞肥大,管腔面積和細(xì)胞面積分別與自身對照眼、4，6wk比較，差異有顯著性。視網(wǎng)膜電圖OPs總波幅2，6wk降低，分別與自身對照眼、4wk比較，差異有顯著性。結(jié)論：高濃度高頻率注射rrVEGF164誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜血管病變主要表現(xiàn)有視網(wǎng)膜水腫，大血管擴(kuò)張，內(nèi)核層毛細(xì)血管管腔變窄、接近閉塞，內(nèi)皮細(xì)胞肥大、增生，周邊部玻璃體視網(wǎng)膜纖維血管樣膜。

【關(guān)鍵詞】視網(wǎng)膜毛細(xì)血管

0引言

VEGF是最重要的促血管形成因子，組織缺血、缺氧是VEGF的啟動因素。缺血性眼病的視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜下新生血管膜等均有VEGF的表達(dá)，眼內(nèi)VEGF濃度明顯升高[1]。目前有關(guān)VEGF的研究大多是離體拮抗外源性VEGF或在體拮抗內(nèi)源性VEGF的藥物抑制實(shí)驗(yàn)，而單獨(dú)應(yīng)用外源性VEGF進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，探討VEGF誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管病變的特點(diǎn)，國內(nèi)外研究甚少。我們探討外源性VEGF誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管病變的特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究藥物拮抗VEGF打下基礎(chǔ)。

1材料和方法

材料Sprague-Daweley大鼠120只隨機(jī)分為3組：正常對照組36只，不作眼內(nèi)注射。VEGF低濃度組36只，實(shí)驗(yàn)眼每次注射濃度為10mg/L的rrVEGF1644μL，自身對照眼注射等量的/LPBS。兩眼均為隔天1次，共2次。VEGF高濃度組48只，實(shí)驗(yàn)眼每次注射濃度為100mg/L的rrVEGF1644μL，自身對照眼注射等量的/LPBS。兩眼均為隔天1次，共4次。分別于2，4，6wk時均作眼底檢查后各隨機(jī)選取6只作眼底熒光血管造影、6只作視網(wǎng)膜電圖振蕩電位檢查，再各隨機(jī)抽取6只處死作組織學(xué)切片、6只處死作透射電子顯微鏡觀察。VEGF高濃度組剩余12只于12wk時處死，隨機(jī)選取各6只行組織學(xué)切片、透射電子顯微鏡檢查。Topcon眼底照相機(jī)，視覺電生理診斷儀，正方測試格，玻璃毛細(xì)管，重組大鼠血管內(nèi)皮生長因子，F(xiàn)ITC-Dextran。

方法大鼠充分散瞳后，30g/L戊巴比妥鈉溶液ip麻醉。結(jié)膜囊表面麻醉，眼科手術(shù)顯微鏡下用30#B-D針頭于背側(cè)角膜緣后1mm處刺穿眼球壁后立即出針，角膜緣行前房穿刺，消毒剪刀將自制玻璃體腔微量注射針針尖剪去，暴露開口。10μL加樣移液器抽取rrVEGF164或PBS4μL注于消毒的點(diǎn)樣紙上。自制玻璃體腔微量注射針立即吸取。沿預(yù)先穿刺好的針孔處以45～50°的角度進(jìn)入眼內(nèi)并緩慢注射，停留約15s后拔針。術(shù)眼涂眼膏，術(shù)后3d用3g/L諾氟沙星滴眼液滴眼，2次/d。注射rrVEGF164或PBS前、后，出現(xiàn)玻璃體出血者不納入實(shí)驗(yàn)對象。散瞳后，ip麻醉大鼠，結(jié)膜囊表面麻醉。暗適應(yīng)30min，暗紅光下安放3個電極，小號銀針柄端連接于電極線末端后，角膜電極插于上方周邊部角膜基質(zhì)層，參考電極置于兩眼連線的中點(diǎn)皮下，地電極置于同側(cè)耳根皮下，黑色膠紙遮蓋未檢查眼。根據(jù)國際臨床視覺電生理學(xué)會制定的視覺電生理標(biāo)準(zhǔn)化方案，設(shè)定刺激參數(shù),雙眼分別記錄視網(wǎng)膜電圖振蕩電位(electroretinographicoscillatorypotentials,ERG-OPs)。散瞳后眼底熒光血管造影，鼠尾靜脈注射50g/LFITC-Dextran，固定動物，注射造影劑后5s，各個方位眼底照相，每次拍片間隔5～10s，持續(xù)3min，選擇性拍片直至注射造影劑50min。剝離視網(wǎng)膜，常規(guī)電鏡制片，每只大鼠每眼隨機(jī)觀察2個銅網(wǎng)，每個銅網(wǎng)隨機(jī)照相2張。同一組、同一眼別的樣本分散，使各組樣本容量達(dá)24張。對視網(wǎng)膜內(nèi)核層單個毛細(xì)血管管腔面積、血管內(nèi)皮細(xì)胞面積進(jìn)行形態(tài)計(jì)量，采用正方測試格計(jì)數(shù)法測量視網(wǎng)膜內(nèi)核層單個毛細(xì)血管管腔面積、血管內(nèi)皮細(xì)胞的面積。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSSforWindows統(tǒng)計(jì)軟件處理。資料正態(tài)檢驗(yàn)，方差齊性檢驗(yàn)后，單因素方差分析，兩因素方差分析，P＜為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性。

2結(jié)果

直接眼底鏡觀察注射rrVEGF164眼低濃度組在注射后1d表現(xiàn)為玻璃體腔輕度混濁，隨后逐漸減輕，至3d恢復(fù)透明。高濃度組在注射后1d表現(xiàn)玻璃體中度混濁，5～6d后玻璃體腔恢復(fù)透明。約10d表現(xiàn)為眼底后極部大血管輕度結(jié)節(jié)樣擴(kuò)張，周圍視網(wǎng)膜輕度水腫，2wk時重度擴(kuò)張，4wk時有所加重。6wk時與4wk時相比無明顯變化。12wk時玻璃體腔出現(xiàn)纖維組織增生，眼底模糊不清。注射PBS眼無玻璃體混濁，低濃度組和注射PBS眼未出現(xiàn)結(jié)節(jié)樣擴(kuò)張和視網(wǎng)膜水腫。

眼底熒光血管造影高濃度組注射rrVEGF164眼視網(wǎng)膜中央動脈約11s開始充盈，灌注時間較正常組延長。注射rrVEGF164后10d表現(xiàn)為眼底后極部視網(wǎng)膜動脈局限性高熒光，熒光素從中央?yún)^(qū)開始消退。2wk時呈結(jié)節(jié)樣擴(kuò)張，隨時間延長而明顯，6wk時與4wk時比較無明顯加重。未見視網(wǎng)膜前新生血管滲漏征象。3mo時玻璃體腔纖維血管樣組織增生，眼底觀察困難，未行造影檢查。

組織學(xué)觀察光鏡下低濃度組可見視網(wǎng)膜水腫，各個層次厚度無明顯變化。未見突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞。高濃度組10d時輕度視網(wǎng)膜水腫，2wk時視網(wǎng)膜水腫加重，6wk時視網(wǎng)膜內(nèi)界膜不完整，視網(wǎng)膜前纖維組織樣增生，12wk時在眼底周邊部玻璃體視網(wǎng)膜纖維血管樣組織增生。透射電鏡顯示正常大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞呈扁長形，細(xì)胞核較大，突入毛細(xì)血管管腔內(nèi)。胞質(zhì)稀少，含有高爾基體、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等超微結(jié)構(gòu)。高濃度組實(shí)驗(yàn)眼2wk時表現(xiàn)為視網(wǎng)膜內(nèi)核層單個毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大、管腔面積變窄，4wk與6wk時血管管腔、細(xì)胞面積恢復(fù)正常，但是6wk時血管內(nèi)皮細(xì)胞增生明顯。12wk血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，毛細(xì)血管接近閉塞。內(nèi)核層單個視網(wǎng)膜毛細(xì)血管管腔面積和單個視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞面積經(jīng)配伍設(shè)計(jì)兩因素方差分析，注射rrVEGF164眼同一濃度不同時間各組間比較：100mg/L組差異有顯著性，單個視網(wǎng)膜毛細(xì)血管管腔面積F＝，P＝。進(jìn)一步用多個樣本均數(shù)q檢驗(yàn)，4wk與6wk組差異無顯著性，P＝，2wk組與4wk組，2wk組與6wk組差異有顯著性。單個視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞面積F＝，P＝。進(jìn)一步用多個樣本均數(shù)q檢驗(yàn)，4wk組與6wk組比較差異無顯著性，P＝，2wk組與4wk組，2wk組與6wk組差異有顯著性(表1)。

視網(wǎng)膜電圖振蕩電位總波幅經(jīng)配伍設(shè)計(jì)兩因素方差分析，同一濃度不同時間各組間比較：100mg/L組差異有顯著性，F(xiàn)＝，P＝。進(jìn)一步用多個樣本均數(shù)q檢驗(yàn)，2wk組與6wk組比較，差異無顯著性，P＝。2wk組與4wk組，6wk組與4wk組差異有顯著性。

3討論

玻璃體腔注射的量過低，玻璃體腔藥物濃度、藥物在玻璃體內(nèi)的彌散受影響。Dureau等研究發(fā)現(xiàn)注射量為3μL或者5μL具有丟失量少、可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)。而Hayashi等的經(jīng)驗(yàn)是：對200～250g的白化病大鼠注射玻璃體的液體量的原則是最大量不超過玻璃體容積的10%。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇大鼠玻璃體腔內(nèi)注射rrVEGF164的體積為4μL，前房穿刺可防止注射后眼壓升高。高分子量右旋糖苷標(biāo)記的熒光素不會從血管內(nèi)漏出，背景熒光很低。為了比較清晰的顯示視網(wǎng)膜血管病變，不遺漏可能出現(xiàn)的早期新生血管，我們選擇50g/LFITC-dextran1mL鼠尾靜脈注射眼底血管造影，大鼠視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)顯示清晰。正常大鼠眼底熒光血管造影與人眼比較，具有灌注時間短、熒光素完全消退時間延長等特點(diǎn)。我們推測可能與大鼠體表面積少、高分子量的右旋糖苷標(biāo)記物使熒光素衰減慢有關(guān)。

研究糖尿病視網(wǎng)膜病變時最常用的指標(biāo)是振蕩電位各子波波幅的總和。實(shí)驗(yàn)中我們誘導(dǎo)的早期視網(wǎng)膜血管病變在一定程度上類似于糖尿病性視網(wǎng)膜病變的早期改變,但未發(fā)現(xiàn)明顯的視網(wǎng)膜缺血無灌注區(qū)域?？赡苡腥缦略颍篤EGF的濃度和刺激時間不足；極周邊部視網(wǎng)膜即使出現(xiàn)上述病變，造影時的角度、動物麻醉時的眼位固定狀態(tài)也可能影響造影時觀察，難以發(fā)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高濃度組2wk時視網(wǎng)膜內(nèi)核層血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大，血管管腔面積減少。我們推測這種改變影響組織的血液供應(yīng)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜的缺血。因此可能引起的OPs改變先于a，b波的改變。因此我們選擇OPs的總波幅作為觀察指標(biāo)。結(jié)果顯示高濃度組2wk時SAOPs降低，說明血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大，毛細(xì)血管管腔變窄導(dǎo)致了視網(wǎng)膜缺血。

VEGF作為一種重要的促進(jìn)新生血管形成因子，已被人們所認(rèn)識。VEGF的明膠微球置于獼猴的視網(wǎng)膜下后，視網(wǎng)膜下新生血管的形成率為92％。Alikcacem等將VEGF緩釋裝置置入兔的玻璃體腔，誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變與增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變類似。Tolentino等認(rèn)為VEGF誘導(dǎo)的獼猴視網(wǎng)膜出血、水腫、靜脈串珠、毛細(xì)血管閉塞、微血管瘤、視網(wǎng)膜內(nèi)血管組織增生等視網(wǎng)膜病變類似于糖尿病性視網(wǎng)膜病變和其他缺血性視網(wǎng)膜病變。采用ADPase染色的方法，證明周邊部眼底存在視網(wǎng)膜前新生血管。VEGF誘導(dǎo)猴視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大亦有報道。本研究顯示：低濃度作用，玻璃體視網(wǎng)膜血管病變不明顯。高濃度短時間作用可以誘導(dǎo)視網(wǎng)膜內(nèi)核層毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大，管腔面積減少。高濃度較長時間可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生。高濃度長時間作用可以出現(xiàn)視網(wǎng)膜內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，管腔面積接近閉塞，玻璃體視網(wǎng)膜纖維血管樣組織。但是，在高濃度作用4wk時，誘導(dǎo)的病變僅限于視網(wǎng)膜血管曲張，視網(wǎng)膜內(nèi)核層的毛細(xì)血管管腔、血管內(nèi)皮細(xì)胞未出現(xiàn)變化。我們推測在rrVEGF164作用2wk至6wk之間，也就是血管內(nèi)皮細(xì)胞從肥大到增生的演變過程中，存在某種更替機(jī)制?？赡茉?wk時外源性的rrVEGF164對血管內(nèi)皮細(xì)胞處于作用階段，表現(xiàn)為細(xì)胞代償性肥大。在4wk時玻璃體腔外源性的rrVEGF164的濃度不足以再起刺激作用。在6wk或更晚期階段，在先期階段外源性的rrVEGF164作用下，內(nèi)源性的機(jī)制被啟動，而表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，甚至玻璃體視網(wǎng)膜纖維血管樣組織增生。

產(chǎn)生視網(wǎng)膜前新生血管，必須要有足夠強(qiáng)度的刺激因素，而且要具備足夠的刺激時間。視網(wǎng)膜層間的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖可以認(rèn)為是視網(wǎng)膜內(nèi)新生血管形成的征象，但是這種新生血管因?yàn)橄鄬o止，不會產(chǎn)生滲漏等改變，因此不同于視網(wǎng)膜前、視網(wǎng)膜下的新生血管，它的臨床意義不大。我們推測早期的血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大，血管管腔面積減少，影響視網(wǎng)膜局部血液供應(yīng)，視網(wǎng)膜水腫，局限性缺血、缺氧，導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能發(fā)生改變，視網(wǎng)膜電圖振蕩電位總波幅降低。但是rrVEGF誘導(dǎo)的這種視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大的確切原因、病理意義，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、數(shù)目的動態(tài)變化有待更深層次的研究。

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