種豬場(chǎng)偽狂犬病凈化技術(shù)規(guī)范

種豬場(chǎng)偽狂犬病凈化技術(shù)規(guī)范范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了種豬場(chǎng)豬偽狂犬病凈化的檢測(cè)方法、凈化群的建立、凈化場(chǎng)的維持及綜合生物安全措施。本標(biāo)準(zhǔn)適用于種豬場(chǎng)豬偽狂犬病凈化。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T17823集約化豬場(chǎng)防疫基本要求GB/T17824.2規(guī)模豬場(chǎng)生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程GB/T18641偽狂犬病診斷技術(shù)GB/T35911偽狂犬病病毒熒光PCR檢測(cè)方法NY/T1168畜禽糞便無害化處理技術(shù)規(guī)范NY/T1568標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)建設(shè)規(guī)范DB37/T2384種豬場(chǎng)消毒技術(shù)規(guī)范《病死及病害動(dòng)物無害化處理技術(shù)規(guī)范》農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2017〕25號(hào)《跨省調(diào)運(yùn)乳用種用動(dòng)物產(chǎn)地檢疫規(guī)程》農(nóng)牧發(fā)〔2019〕2號(hào)術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。偽狂犬病Pseudorabies偽狂犬病是由皰疹病毒科皰疹病毒Ⅰ型偽狂犬病毒（PRV）引起的豬及多種家畜和野生動(dòng)物的傳染病。凈化eradication對(duì)種豬場(chǎng)采取一系列措施，達(dá)到消滅和清除豬偽狂犬病的過程。在某一限定的種豬場(chǎng)內(nèi)，根據(jù)豬偽狂犬病的監(jiān)測(cè)結(jié)果，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并淘汰感染豬只，使種豬群中豬偽狂犬病逐漸被清除的疫病控制方法。豬偽狂犬gE基因缺失疫苗PseudorabiesgEgene-deletedvaccine利用豬偽狂犬gE基因缺失病毒株所制成的疫苗。檢測(cè)方法儀器熒光PCR檢測(cè)儀。PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)（根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件選擇，替換4.1.1）。高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：可控溫至4℃、離心速度可達(dá)12000r/min以上。組織研磨器或者研缽。普通冰箱。微量移液器：0.2μL～2μL，1μL～10μL，10μL～100μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。酶標(biāo)儀。恒溫箱。高壓滅菌鍋。耗材1.5mL離心管。0.2mLPCR薄壁管。酶標(biāo)板，移液器吸頭。試劑除非另有說明，在檢測(cè)中使用的試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水應(yīng)符合GB/T6682的要求。商品化DNA抽提試劑，于4℃保存。無水乙醇，-20℃預(yù)冷。75%乙醇，無水乙醇和雙蒸水配制，-20℃預(yù)冷。含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L，-20℃保存，避免反復(fù)凍融。普通PCR引物參照GB/T18641。熒光PCR引物和探針參照GB/T35911。酶標(biāo)檢測(cè)試劑等效采用PRV-gE基因缺失疫苗配套的商品化鑒別檢測(cè)試劑。核酸檢測(cè)活豬采集扁桃體或全血，病死豬或流產(chǎn)胎兒采集大腦、扁桃體、淋巴結(jié)、肺臟等組織。依據(jù)GB/T18641或GB/T35911，使用PCR方法，檢測(cè)組織中的豬偽狂犬病病毒核酸。血清學(xué)檢測(cè)豬偽狂犬病病毒gB（PRV-gB）抗體檢測(cè)采集豬血，分離血清。采用商品化ELISA試劑盒，檢測(cè)豬血清中的PRV-gB抗體，評(píng)估免疫抗體水平。豬偽狂犬病病毒gE（PRV-gE）特異性抗體檢測(cè)采集豬血，分離血清。采用商品化ELISA試劑盒，檢測(cè)豬血清中的PRV-gE特異性抗體，評(píng)估野毒感染狀態(tài)。合格免疫抗體判定標(biāo)準(zhǔn)個(gè)體免疫抗體合格標(biāo)準(zhǔn)，PRV-gB抗體按所選取的試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。群體免疫抗體合格標(biāo)準(zhǔn)，群體PRV-gB抗體陽性率不低于90%。凈化群的建立凈化策略采用gE基因缺失疫苗免疫、野毒鑒別診斷技術(shù)淘汰陽性感染豬的策略。適時(shí)淘汰生產(chǎn)成績差的母豬。做好引種監(jiān)測(cè)，每年引進(jìn)的公豬和后備豬應(yīng)為全陰性。綜合生物安全措施保障到位。感染狀況普查階段采樣技術(shù)前腔靜脈或扁桃體采樣，并及時(shí)對(duì)血樣或組織樣品規(guī)范保存、送檢。采血過程及制樣過程要防止污染并規(guī)范標(biāo)記。抽樣數(shù)量抽樣要求和數(shù)量參照附錄A中表A.1和表A.2進(jìn)行。置信度95%，預(yù)期流行率5%。根據(jù)野毒抗體陽性率高低，確定具體凈化方案。凈化方案的確定血清樣品PRV-gE抗體陽性率不超過10%，實(shí)行檢測(cè)淘汰-監(jiān)測(cè)與認(rèn)證維持的凈化方案。血清樣品PRV-gE抗體陽性率在10%～20%，實(shí)行強(qiáng)化免疫-檢測(cè)淘汰-補(bǔ)充陰性后備豬-監(jiān)測(cè)與認(rèn)證維持的分步凈化方案。血清樣品PRV-gE抗體陽性率大于20%，該豬群不具備凈化條件。強(qiáng)化免疫階段疫苗PRV-gE基因缺失活疫苗，免疫原性好。有配套的PRV野毒感染鑒別診斷試劑。免疫程序根據(jù)疫苗免疫后抗體跟蹤檢測(cè)情況確定合理的免疫程序。種豬，種母豬和公豬每年普免2次～3次，避免在分娩前7d內(nèi)接種。后備豬群，后備豬配種前8W1次活疫苗免疫；以后按生產(chǎn)種豬的免疫程序進(jìn)行免疫。仔豬，1d～2d日齡滴鼻免疫。45d活疫苗加強(qiáng)免疫。檢測(cè)評(píng)估免疫后3W檢測(cè)gB抗體和gE抗體。當(dāng)gE抗體陰性時(shí)，如果90%的樣品gB抗體陽性，即可認(rèn)為群體免疫合格。臨床評(píng)估通過強(qiáng)化免疫后，豬群應(yīng)無豬偽狂犬病的臨床癥狀。檢測(cè)與淘汰階段隔離淘汰每半年進(jìn)行一次血清學(xué)檢查，全群采樣。陰、陽性豬分群飼養(yǎng)。逐步淘汰和縮小陽性豬群。加強(qiáng)陰性群的隔離與監(jiān)測(cè)，最后建立完全健康的gE陰性豬群。種豬群的檢測(cè)與淘汰當(dāng)種豬群樣品的偽狂犬病野毒感染抗體（gE抗體）陽性率在10%以下時(shí)，如gE抗體陽性，應(yīng)直接淘汰；對(duì)可疑樣品再次檢測(cè)，也可在10d～14d后再抽樣復(fù)核，如仍為可疑，應(yīng)直接淘汰。后備種豬的檢測(cè)與淘汰對(duì)擬選留的后備種豬，可分別在5月齡（或進(jìn)入后備舍）和配種前1個(gè)月檢測(cè)gE抗體，如為陰性，即可作為種豬使用；gE抗體陽性或兩次可疑，應(yīng)淘汰處理。強(qiáng)制凈化階段對(duì)全群豬只進(jìn)行檢測(cè)，剔除全部陽性豬只。在最后1頭陽性豬淘汰1個(gè)月后，對(duì)種公豬按100%比例、母豬按10%比例采血，再次進(jìn)行PRV-gE特異性抗體檢測(cè)。如抽檢種豬群PRV-gE抗體全部陰性且群體90%的樣品為gB抗體陽性可視為假定豬偽狂陰性群。假定健康階段在最后1頭陽性豬淘汰后1年內(nèi)，種豬群PRV-gE抗體陰性；生產(chǎn)成績正常穩(wěn)定。豬群則進(jìn)入假定健康階段。凈化場(chǎng)的評(píng)估階段評(píng)估時(shí)間在進(jìn)入“假定健康階段”后，按照免疫無疫標(biāo)準(zhǔn)、凈化標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行凈化場(chǎng)評(píng)估。免疫無疫標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)母豬和后備種豬抽檢，豬偽狂犬病病毒gB抗體陽性率不低于90%。種公豬、生產(chǎn)母豬和后備種豬抽檢，豬偽狂犬病病毒gE抗體檢測(cè)均為陰性。連續(xù)兩年以上無臨床病例。凈化標(biāo)準(zhǔn)種公豬、生產(chǎn)母豬和后備種豬抽檢，豬偽狂犬病病毒gE抗體檢測(cè)均為陰性。停止免疫兩年以上，無臨床病例。評(píng)估抽樣評(píng)估專家小組負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)抽樣方案并監(jiān)督抽樣。樣本方案和檢測(cè)方法參照附錄A、附錄B。置信度95%，預(yù)期流行率3%。凈化場(chǎng)的維持階段免疫種豬場(chǎng)要制定并實(shí)施合理的免疫程序，選用合格的豬偽狂犬病gE基因缺失疫苗，按照免疫程序進(jìn)行免疫接種。監(jiān)測(cè)種豬群檢測(cè)每年對(duì)陰性種豬群，監(jiān)測(cè)PRV-gE抗體。抽樣比例參考表A.1。置信度95%，預(yù)期流行率3%。保證基礎(chǔ)群、后備群維持陰性狀態(tài)。后備豬的檢測(cè)在后備豬選留時(shí)進(jìn)行PRV-gE特異性抗體和PRV-gB免疫抗體檢測(cè)，確保轉(zhuǎn)入種豬群的豬只PRV-gE抗體為陰性，PRV-gB免疫抗體水平應(yīng)符合合格標(biāo)準(zhǔn)。后備豬入群必須逐頭檢測(cè)。引種檢疫嚴(yán)格檢疫引進(jìn)豬只。按照農(nóng)牧發(fā)〔2019〕2號(hào)《跨省調(diào)運(yùn)乳用種用動(dòng)物產(chǎn)地檢疫規(guī)程》規(guī)定引進(jìn)豬只。在種豬啟運(yùn)前對(duì)擬引進(jìn)豬只逐頭進(jìn)行檢測(cè)，確保PRV-gE特異性抗體陰性或豬偽狂犬病病毒核酸檢測(cè)陰性，且PRV-gB抗體合格后方可啟運(yùn)引進(jìn)。建立專門隔離飼養(yǎng)舍，引進(jìn)后隔離飼養(yǎng)45d以上經(jīng)檢測(cè)合格后才可混群飼養(yǎng)。使用外來種公豬的精液時(shí)，必須在購買前對(duì)供精種公豬進(jìn)行嚴(yán)格檢疫，保證供精種公豬PRV-gE特異性抗體陰性或豬偽狂犬病病毒核酸檢測(cè)陰性且PRV-gB免疫抗體合格。對(duì)精液進(jìn)行病原核酸檢測(cè)確保檢測(cè)結(jié)果陰性。生產(chǎn)記錄不佳的種豬檢測(cè)要及時(shí)收集病死豬及母豬所生產(chǎn)的弱仔豬、死胎、流產(chǎn)胎兒，進(jìn)行豬偽狂犬病病毒核酸檢測(cè)，檢測(cè)方法按照GB/T18641或GB/T35911執(zhí)行。如果豬偽狂犬病病毒核酸檢測(cè)陽性，則檢測(cè)對(duì)應(yīng)的親本母豬PRV-gE野毒抗體，陽性者淘汰。綜合生物安全措施合理的豬場(chǎng)選址按NY/T1568規(guī)定執(zhí)行，避免病毒經(jīng)空氣傳入。生產(chǎn)模式參照GB/T17823執(zhí)行。執(zhí)行自繁自養(yǎng)、全進(jìn)全出、提前斷奶及“兩點(diǎn)式”或“三點(diǎn)式”的生產(chǎn)模式，阻斷豬場(chǎng)間、豬群間、批間、引種、轉(zhuǎn)場(chǎng)疫病傳播。飼養(yǎng)管理按GB/T17824.2的規(guī)定執(zhí)行，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，減少應(yīng)激。做好通風(fēng)、保溫、適宜的飼養(yǎng)密度。種豬場(chǎng)的凈道與污道要分開。分胎次飼養(yǎng)、分類別飼養(yǎng)、分類管理，隔離、阻斷疫病傳播?？茖W(xué)規(guī)范用藥，種豬禁用皮質(zhì)類固醇類藥物。消毒措施按DB37/T2384的規(guī)定執(zhí)行。嚴(yán)格做好人員、物品、用具、車輛、豬舍內(nèi)外環(huán)境以及糞便排泄物和污水的消毒。無害化處理措施病死豬及母豬所生產(chǎn)的弱仔豬、死胎、流產(chǎn)胎兒按農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2017〕25號(hào)《病死及病害動(dòng)物無害化處理技術(shù)規(guī)范》的規(guī)定處理。糞便處理按NY/T1168的規(guī)定。有害生物防治措施禁止在豬場(chǎng)內(nèi)飼養(yǎng)犬、貓等其它易感動(dòng)物。每6個(gè)月至少開展1次全方位徹底滅鼠。定期殺蟲、防蠅。其它生物安全措施保障獨(dú)立、隔離的公豬站的生物安全，加強(qiáng)人工授精檢測(cè)與管理，防止精液傳播。加強(qiáng)生產(chǎn)流程管理。重點(diǎn)在容易轉(zhuǎn)陽的階段，全部清空1～2批，徹底消毒，空欄。保持凈化工作的連續(xù)性。檔案管理做好生產(chǎn)記錄、飼料和飼料添加劑購進(jìn)和使用記錄、獸藥購進(jìn)和使用記錄、免疫記錄、消毒記錄、病死豬無害化處理記錄、防疫監(jiān)測(cè)記錄、疾病診療記錄、運(yùn)輸車輛記錄、糞便及污物無害化處理記錄和銷售記錄等。記錄保存不少于2年。

（資料性附錄）

豬偽狂犬病免疫無疫評(píng)估實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法及抽樣要求豬偽狂犬病免疫無疫評(píng)估實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法及抽樣要求檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)方法抽樣種群抽樣數(shù)量樣本類型抗體檢測(cè)gE-ELISA種公豬生產(chǎn)公豬存欄50頭以下，100%采樣；生產(chǎn)公豬存欄50頭以上，按照證明無疫公式計(jì)算（置信度95%，預(yù)期流行率3%）。將采樣數(shù)量按照存欄比例分配到不同棟舍后隨機(jī)抽樣。血清生產(chǎn)母豬后備種豬按照證明無疫公式計(jì)算采樣數(shù)量（置信度95%，預(yù)期流行率3%）；隨機(jī)抽樣，覆蓋不同豬群。血清抗體檢測(cè)gB-ELISA生產(chǎn)母豬按照預(yù)估期望值公式計(jì)算采樣數(shù)量（置信度95%，預(yù)期合格率90%，相對(duì)誤差10%）。將采樣數(shù)量按照存欄比例分配到不同棟舍后隨機(jī)抽樣。血清后備種豬按照預(yù)估期望值公式計(jì)算采樣數(shù)量（置信度95%，預(yù)期合格率90%，相對(duì)誤差10%）。將采樣數(shù)量按照存欄比例分配到不同棟舍后隨機(jī)抽樣。血清豬偽狂犬病凈化抽樣參考數(shù)量群體數(shù)量

（N）感染情況評(píng)價(jià)感染情況評(píng)價(jià)預(yù)期流行率（P）預(yù)期流行率（P）3%（豬）5%（豬）5043371006347150735120078543008456400885850090597509360100094601500966120009661350097625000986275009862100