桂枝中抗過敏活性成分的研究

桂枝中抗過敏活性成分的研究【摘要】目的跟蹤確定中藥桂枝中的抗過敏活性成分。方法桂枝通過70%乙醇溶液提取，不同有機(jī)溶劑萃取及大孔樹脂HP-20、聚酰胺和SephadexLH-20對(duì)樣品進(jìn)行純化，以透明質(zhì)酸酶抑制率為指標(biāo)對(duì)各組分抗過敏活性進(jìn)行跟蹤，確定抗過敏活性最強(qiáng)的組分，通過薄層層析、顯色反應(yīng)和光譜鑒定對(duì)抗過敏活性最強(qiáng)的組分定性。結(jié)果桂枝大孔樹脂40%乙醇洗脫部分的酶抑制率為%，過聚酰胺40%丙酮洗脫部分酶抑制率達(dá)到73%，過凝膠甲醇洗脫后，活性成分酶抑制率最高達(dá)93%。結(jié)論桂枝中強(qiáng)過敏組分為縮合類單寧

【關(guān)鍵詞】桂枝；透明質(zhì)酸酶；縮合類單寧

Abstract：ObjectiveTotrackandascertaintheantiallergiccomponentsofRamuluswasextractedby70%ethanolandorganicsolventsbyturns,thenpurifiedbyDiaionHP-20,polyamideandSephadexthesametime,theantiallergicactivitywascarriedoutbymeasuringtheinhibitionrateonhyaluronidase.ThenthebestantiallergiccomponentswereascertainedbyTLC,colorreactionandspectrumcertification.ResultsTherateofRamulusCinnamomiextractpurifiedbyDiaionHP-20andelutedby40%ethanolwas%,purifiedbypolyamideandelutedby40%acetonewas73%，purifiedbySephadexLH-20andelutedbymethanolwas93%.ConclusionThebestantiallergiccomponentsofRamulusCinnamomiarecondensedtannins.

Keywords：RamulusCinnamomi;Hyaluronidase;Condensedtannins

近十幾年來，隨著物質(zhì)生活水平的提高，環(huán)境社會(huì)因素的影響，過敏性疾病越來越多，其發(fā)病率不斷上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)過敏患者已占世界人口的40％。20％以上的美國(guó)人都曾受到過敏性疾病的困擾；日本厚生省過敏綜合研究報(bào)告顯示，35％的小兒和22％的成人都曾患過不同程度的花粉癥、過敏性皮炎、哮喘、鼻炎等過敏性疾??；在我國(guó)，過敏反應(yīng)的發(fā)病率約占10％，且呈逐年上升的趨勢(shì)。根據(jù)免疫反應(yīng)機(jī)理，過敏反應(yīng)分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型，大多數(shù)過敏反應(yīng)是與體內(nèi)透明質(zhì)酸酶活性有關(guān)的Ⅰ型過敏反應(yīng)［1］。目前，世界各國(guó)治療過敏反應(yīng)的藥物都存在毒副作用大的缺點(diǎn)，從天然植物中提取抗過敏的活性成分，因具有低毒高效的作用效果，越來越受到人們的青睞，可作為新型的食品添加劑和藥物原料，用于保健食品和新藥的研究開發(fā)。

桂枝為樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPres1的干燥嫩莖，臨床上多用于緩和腸胃刺激、強(qiáng)心、改善微循環(huán)、抗炎、抗血小板凝集等［2］。桂枝在抗過敏方面的研究主要是桂枝湯合方或桂枝湯的應(yīng)用。臨床應(yīng)用桂枝湯治疔過敏反應(yīng)以及抑制炎癥反應(yīng)獲得明顯療效?，F(xiàn)代藥理研究表明，桂枝對(duì)嗜異性抗體反應(yīng)顯示出抑制補(bǔ)體活性作用，故其有較強(qiáng)抗過敏作用［3］。國(guó)內(nèi)外研究已證明桂枝具有抗過敏作用，但對(duì)桂枝的具體的抗過敏活性成分還鮮有報(bào)道。本文對(duì)桂枝的抗過敏活性成分進(jìn)行了分離純化和初步鑒定，以透明質(zhì)酸酶抑制率為指標(biāo)進(jìn)行活性跟蹤，為桂枝的進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1器材與方法1儀器與試劑桂枝：市售，產(chǎn)地為廣西；試劑：大孔樹脂HP-20，北京綠百草公司；聚酰胺，浙江臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠；葡聚糖凝膠SephadexLH-20，Amershambioscisences公司；透明質(zhì)酸酶、透明質(zhì)酸鉀，Simga公司；對(duì)二甲氨基苯甲醛，上海試劑二廠；乙酰丙酮：天津試劑廠；鎢酸鈉、磷鉬酸、磷酸：南寧藍(lán)天試劑有限公司；醋酸、石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇、乙醇等均為分析純。

儀器：RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；GSY-Ⅱ恒溫水浴箱；UV-1601PC紫外分光光度計(jì)；LABCONCO真空冷凍干燥系統(tǒng)；XWT-S小型臺(tái)式紀(jì)錄儀；全自動(dòng)點(diǎn)樣儀。2抗過敏活性成分的提取和純化桂枝有效成分的粗提取取桂枝樣品粉碎，過20目篩，方案1用石油醚熱回流提取3h，方案2用醋酸乙酯熱回流提取3h，方案3為用70%乙醇溶液70℃提取1h。各方案分別重復(fù)提取3次，合并提取液，對(duì)3種粗提方案的提取液真空濃縮、冷凍干燥，分別得到樣品桂1，桂2，桂3，分別對(duì)各樣品進(jìn)行透明質(zhì)酸酶實(shí)驗(yàn)。桂枝粗提物的萃取分離

將透明質(zhì)酸酶抑制率最強(qiáng)組分溶解，依次用氯仿、醋酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，得到氯仿相、醋酸乙酯相、正丁醇相、剩余水相4種成分的萃取液，經(jīng)真空濃縮，冷凍干燥得到樣品桂4，桂5，桂6，桂7，分別對(duì)樣品進(jìn)行透明質(zhì)酸酶實(shí)驗(yàn)。大孔樹脂對(duì)有效成分的純化大孔樹脂裝柱，柱長(zhǎng)70cm,內(nèi)徑cm,先用蒸餾水以1BV/h的流速清洗4BV，以4%HCl溶液清洗2BV，用蒸餾水洗脫至中性，再以3%NaOH溶液洗2BV，再以蒸餾水洗脫至中性。將桂枝透明質(zhì)酸酶抑制率最強(qiáng)萃取組分進(jìn)行溶解吸附，依次用蒸餾水、10%乙醇、40%乙醇、70%乙醇梯度洗脫，洗脫體積分別為2BV，2BV，3BV，2BV，流速為1BV/h。依次收集洗脫組分，減壓濃縮，冷凍干燥，分別得到樣品桂8、桂9、桂10、桂11，分別對(duì)樣品進(jìn)行透明質(zhì)酸酶實(shí)驗(yàn)。聚酰胺對(duì)有效成分的進(jìn)一步純化將用95%乙醇浸泡除去氣泡的聚酰胺裝柱，柱長(zhǎng)49cm，內(nèi)徑cm，先用95%乙醇以1BV/h的流速清洗4BV，以5%的氫氧化鈉溶液清洗2BV，再以10%的醋酸水溶液清洗2BV，最后用蒸餾水洗脫至中性，將過大孔后桂枝透明質(zhì)酸酶抑制率最強(qiáng)組分進(jìn)行溶解吸附，依次用20%，40%，60%丙酮梯度洗脫，洗脫體積各2BV，流速為1BV/h。依次收集洗脫組分，減壓濃縮，冷凍干燥，分別得到樣品桂12、桂13、桂14，分別對(duì)樣品進(jìn)行透明質(zhì)酸酶實(shí)驗(yàn)?？偡雍康臏y(cè)定-采用Folin-Ciocalteau法［4］采用Folin-Ciocalteu試劑進(jìn)行測(cè)定，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物。按照參考文獻(xiàn)［4］測(cè)定，以吸光值為縱坐標(biāo)，以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=7，R2=6。精確量取1ml樣液在同等條件下操作，測(cè)其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚含量。葡聚糖凝膠SephadexLH-20對(duì)有效成分的進(jìn)一步純化凝膠裝柱，柱長(zhǎng)44cm，內(nèi)徑cm，流速為1ml/min，稱取聚酰胺分離后透明質(zhì)酸酶抑制率最強(qiáng)組分樣品g，用少量甲醇溶解。將溶液全部轉(zhuǎn)移到SephadexLH-20凝膠柱，用甲醇洗脫,根據(jù)色譜峰對(duì)洗脫樣品進(jìn)行收集，減壓濃縮，冷凍干燥，分別得到樣品桂15、桂16，測(cè)定透明質(zhì)酸酶抑制率。透明質(zhì)酸酶抑制實(shí)驗(yàn)-采用Elson-Morgan法［5～7］透明質(zhì)酸酶抑制率=［-］/×100%

式中：A為對(duì)照溶液的OD值B為對(duì)照空白溶液的OD值；C為試樣溶液的OD值D為試樣空白的OD值3抗過敏活性成分的初步鑒定對(duì)過凝膠后抗過敏活性最強(qiáng)組分進(jìn)行鑒定。薄板層析定性鑒定［8］和顯色反應(yīng)［9］取樣品適量，配制成甲醇溶液，使用點(diǎn)樣器點(diǎn)樣，在層析缸中，由醋酸乙酯∶甲酸∶水溶液上行展開到終點(diǎn)后，取出，依次用2%FeCl3溶液和茴香醛-硫酸溶液顯色；取樣品溶液與明膠溶液、溴水、香草醛－鹽酸溶液和濃硫酸進(jìn)行顯色反應(yīng)，觀察現(xiàn)象。光譜的定性鑒定［10］紫外可見光譜的掃描范圍是200～800nm；紅外掃描范圍400～4000cm-1。

2結(jié)果

桂枝的粗提方法的確定使用3種方案對(duì)桂枝進(jìn)行粗提，提取樣品進(jìn)行透明質(zhì)酸酶實(shí)驗(yàn)。從表1可以看出，采用70%乙醇溶液提取得到的桂枝粗提物即樣3的透明質(zhì)酸酶抑制率最高，提取率也最高，因此采用70%乙醇溶液對(duì)桂枝進(jìn)行粗提。表1桂枝不同粗提方法抗過敏活性和提取率比較

提取率=樣品干燥稱質(zhì)量/總稱取量×100%

桂枝粗提物的萃取分離對(duì)桂枝粗提物用不同極性的有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取分離，對(duì)各不同極性的組分進(jìn)行透明質(zhì)酸酶抑制率的測(cè)定，從圖1可以看出，桂枝提取物有效成分集中在中等極性的醋酸乙酯部分，其抑制率為%，而且它的回收率也相對(duì)較高為%。

大孔樹脂對(duì)有效成分的純化對(duì)萃取分離后得到的透明質(zhì)酸酶抑制率最強(qiáng)的組分過大孔樹脂，樣品的總回收率達(dá)到%。對(duì)得到的4個(gè)組分測(cè)定透明質(zhì)酸酶抑制率，從圖2可以看出，桂枝提取物過大孔樹脂后透明質(zhì)酸酶抑制率得到了進(jìn)一步的提高，其中以桂10即40%乙醇洗脫部分為最高，達(dá)到%，回收率為%。

聚酰胺對(duì)有效成分的進(jìn)一步純化對(duì)于桂枝大孔樹脂40%乙醇洗脫組分過聚酰胺柱，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步純化，得到3個(gè)樣品。從圖3可以看出，樣品過聚酰胺后透明質(zhì)酸酶抑制率得到了進(jìn)一步的提高，其中40%丙酮洗脫部分達(dá)到了73%，屬較強(qiáng)抗過敏組分，回收率也達(dá)到59%。測(cè)定桂13的多酚含量為85%，由此可以預(yù)測(cè)其中抗過敏作用最強(qiáng)的成分主要為酚類物質(zhì)，為以后的進(jìn)一步純化提供了理論上的幫助。

葡聚糖凝膠SephadexLH-20對(duì)有效成分的進(jìn)一步純化對(duì)桂枝聚酰胺40%丙酮洗脫部分過凝膠柱，樣品的總回收率為94%，記錄的色譜峰為兩個(gè)明顯的肩峰組成，證明其組成可能為兩種單體物質(zhì)，得到樣品測(cè)定透明質(zhì)酸酶抑制率，桂15達(dá)到了93%，為強(qiáng)抗過敏組分。見圖4。

強(qiáng)抗過敏成分桂15的初步鑒定

薄層層析定性鑒定桂15在薄板展開后，經(jīng)三氯化鐵溶液顯色為暗綠色，表明含有酚羥基，斑點(diǎn)再經(jīng)過茴香醛－濃硫酸溶液顯色為橙色，呈現(xiàn)縮合單寧的特征。樣品溶液進(jìn)行試管預(yù)測(cè)，可使明膠溶液出現(xiàn)沉淀，使溴水混濁，可使香草醛－鹽酸和濃硫酸顯紅色，這些都呈現(xiàn)縮合單寧的特征。

樣15的光譜定性鑒定由圖5所示，樣品在紫外光譜區(qū)有吸收，在可見光譜區(qū)基本無(wú)吸收，278nm處有中等強(qiáng)度吸收峰，207nm處有強(qiáng)吸收峰，說明分子中含有苯環(huán)，吸收譜帶呈現(xiàn)典型的芳香官能團(tuán)特征。

3結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明桂枝提取物具有很高的透明質(zhì)酸酶抑制率，具有強(qiáng)抗過敏作用，經(jīng)過大孔樹脂、聚酰胺純化后，活性成分抑制率為73%，樣品總酚含量為85%，經(jīng)凝膠純化后其抑制率達(dá)到了93%，屬?gòu)?qiáng)抗過敏組分，通過薄層層析和顯色反應(yīng)確定此強(qiáng)抗過敏組分為縮合類丹寧，紫外、紅外掃描進(jìn)一步證實(shí)其結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)，顯示了芳香官能團(tuán)的特征。結(jié)合樟科植物桂枝所含的化學(xué)成分推測(cè)可能為兒茶素、表兒茶素類及其二聚體到五聚體等單體化合物。

雖然已經(jīng)確定桂枝抗過敏組分為縮合類丹寧，但抗過敏作用的機(jī)制還沒有提出，有待進(jìn)一步研究。

【參考文獻(xiàn)】

［1］LarryG.Arthoropodallergensandhumanhealth［J］.Annualreviewofentomology,2002,47:39.

［2］肖培根.新編中藥志，第3卷［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2002：575.

［3］王宗新，張曉蘭.桂枝麻黃各半湯加減治療蕁麻疹66例［J］.河南中醫(yī)，2005,25：14.

［4］王福榮.釀酒分析與檢測(cè),第1版［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005：97.

［5］平井孝一.甜茶抽出物抗紛ルレギ作用と食品ヘの的