多重耐藥鮑曼不動桿菌β

多重耐藥鮑曼不動桿菌β

【關鍵詞】,多重耐藥鮑曼不動桿菌

［摘要］目的：了解我院臨床分離的多重耐藥鮑曼不動桿菌β內酰胺酶基因分布情況。方法：用三維試驗檢測15株多重耐藥鮑曼不動桿菌ESBLs、AmpC、MBL產(chǎn)酶情況；用PCR方法檢測各種β內酰胺酶基因。結果：三維試驗檢出2株菌產(chǎn)ESBLs；9株菌產(chǎn)AmpC；3株菌合產(chǎn)ESBLs和AmpC酶；3株菌產(chǎn)MBL。PCR檢出15株菌均攜帶blaTEM基因；2株菌攜帶blaPER1基因；14株菌攜帶AmpC基因；未檢出產(chǎn)金屬β內酰胺酶基因。結論：我院多重耐藥的鮑曼不動桿菌多含有blaTEM基因和AmpC基因，也首次發(fā)現(xiàn)部分產(chǎn)PER型ESBLs鮑曼不動桿菌。

［關鍵詞］多重耐藥鮑曼不動桿菌;β內酰胺酶;基因型

StudyontheGenotypeofβlactmasesinMultiresistantAcinetobacterBaumanniiStrain

Abstract：ObjectiveToinvestigatethedistributionongenotypeofβLactmasesinmultiresistantacinetobacterbaumanniistrainisolatedfromourThreedimemensionalextracttestswereperformedtodetectthestrainsofESBLsproducingandAmpCproducingandMBLproducingin15MultiresistantAcinetobactergenotypeofβLactmasesweredetectedbyPCR2strainsESBLsproducingand9strainsAmpCproducing,3strainsESBLsproducingplusAmpCproducingand3strainsMBLproducingwithAmpCproducinghavebeendetectedbythreedimemensionalextract15strainshaveblaTEMgeneand2strainshaveblaPERgene,14strainshaveAmpCgeneandhaven‘tMBLproducinggenebyPCRThemostmultiresistantacinetobacterbaumanniihaveblaTEMandAmpCgene,alittlestrainshaveESBLsofPERtypeandnoMBLofIMPtype.

Keywords：MultiresistantAcinetobacterbaumannii;βLactmases;Genotype

鮑曼不動桿菌是院內感染的重要病原體之一，近年來，許多醫(yī)院鮑曼不動桿菌的分離率在逐年上升，僅次于假單胞菌和大腸埃希菌。同時，多重耐藥的鮑曼不動桿菌已成為醫(yī)院感染的重要病原菌。在其復雜耐藥機制中，產(chǎn)β內酰胺酶是其主要耐藥機制［1］。鮑曼不動桿菌不僅有產(chǎn)廣譜β內酰胺酶，而且近年來還發(fā)現(xiàn)有產(chǎn)超廣譜β內酰胺酶、AmpC酶和碳青霉烯酶的鮑曼不動桿菌［2］，給臨床治療帶來很大困難。為了解我院多重耐藥鮑曼不動桿菌的耐藥機制，我們對本院分離的15株多重耐藥的鮑曼不動桿菌進行了β內酰胺酶基因型研究。

1材料與方法

菌株來源15株只對亞胺培南敏感的多重耐藥鮑曼不動桿菌來自我院2004年7月至2005年1月臨床分離的標本，其中痰液12份、創(chuàng)面3份。均經(jīng)Vitek-32型全自動微生物鑒定儀的VitekGNI鑒定卡統(tǒng)一進行鑒定。

標準菌株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌ATCC700603、高產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌029M標準株由安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院惠贈；大腸埃希菌ATCC25922由本實驗室保存。

耐藥性被研究的15株鮑曼不動桿菌除了2株耐受亞胺培南，其他13株對亞胺培南全部敏感；對頭孢哌酮/舒巴坦有1株敏感，14株中介；有1株對氧氟沙星和環(huán)丙沙星敏感；對氧哌嗪青霉素/他唑巴坦、頭孢吡肟、阿米卡星、頭孢他啶中介各1株；對其他抗生素均耐受。

主要試劑克拉維酸為南京本原制藥廠贈送，氯唑西林為上海四藥股份有限公司產(chǎn)品，MH瓊脂為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品，胰蛋白大豆肉湯為英國OXOID公司產(chǎn)品。

主要儀器設備微生物鑒定儀為法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的Vitek-32型全自動微生物鑒定儀；冰箱為日本三洋MDF-382型超低溫冰箱；離心機為德國Hettich公司產(chǎn)品MIKRO22R型低溫超速離心機；PCR擴增儀為美國PERKINELMER公司9600型基因擴增儀。

酶提取物制備將分離鑒定的細菌挑取數(shù)個菌落接種到30ml胰蛋白胨大豆肉湯中，35℃恒溫振蕩培育10h~14h，4℃4000r/min離心30min棄上清液，收集沉淀物加mol/LPBS400μl，旋渦混勻后于-80℃反復凍融6次，每次各1h，然后4℃13000r/min離心15min，吸取上清液，經(jīng)過MH瓊脂平板35℃培養(yǎng)過夜，無菌生長方為合格酶提取物，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三維試驗檢測產(chǎn)AmpC酶菌株參照Coudron［3］報告的酶提取物三維試驗作部分改進。將麥氏單位大腸埃希菌ATCC25922菌液均勻涂布在MH瓊脂平皿上，平皿中心貼上30μgFOX紙片，在距FOX紙片邊緣5mm處放射性打出2道長約10mm~15mm對稱狹縫，分別加入酶提取物40μl和酶提取物40μl+2mmol/LCLO4μl，35℃過夜培養(yǎng)。結果判定：若在加入酶提取物的狹縫與抑菌圈交界處出現(xiàn)擴大的長菌區(qū)，而在加入酶提取物+CLO混合液的狹縫與抑菌圈交接處未出現(xiàn)擴大的長菌區(qū)，為三維試驗高產(chǎn)AmpC酶試驗陽性；若兩道狹縫與抑菌圈交接處均未出現(xiàn)擴大的長菌區(qū)，為高產(chǎn)AmpC酶陰性。陰溝腸桿菌029M為高產(chǎn)AmpC酶的陽性對照，肺炎克雷伯菌ATCC700603為陰性對照。

三維試驗檢測ESBLs和同時產(chǎn)AmpC酶菌株參照吳偉元等［4］報道的方法作部分改進。對高產(chǎn)AmpC酶菌株的酶提取物進行頭孢曲松三維試驗，操作方法同上，用CRO紙片代替FOX紙片，并放射性打出4道狹縫，分別加入酶提取物40μl、酶提取物40μl+2mmol/LCLO4μl、酶提取物40μl+2mmol/LCLA4μl、酶提取物40μl+4mmol/LCLO2μl+4mmol/LCLA2μl。

結果判定：若在加入酶提取物、酶提取物+CLO和酶提取物+CLA道狹縫與抑菌圈交接處均出現(xiàn)擴大的長菌區(qū)，而加入酶提取物+CLO+CLA狹縫與抑菌圈交接處未出現(xiàn)擴大的長菌區(qū)，說明該菌同時產(chǎn)AmpC酶和ESBLs；若在加酶提取物和酶提取物+CLA的狹縫與抑菌圈交接處出現(xiàn)擴大長菌區(qū)，而另2道狹縫與抑菌圈交接處均未出現(xiàn)擴大長菌區(qū)，說明該菌只產(chǎn)AmpC酶，不產(chǎn)ESBLs；若在加酶提取物和酶提取物+CLO的狹縫與抑菌圈交接處出現(xiàn)擴大長菌區(qū)，而另2道狹縫與抑菌圈交接處均未出現(xiàn)擴大長菌區(qū)，說明該菌只產(chǎn)ESBLs，不產(chǎn)AmpC酶；若4道狹縫與抑菌圈交接處均出現(xiàn)擴大的長菌區(qū)，說明酶提取物中含有ESBLs、AmpC酶以外的耐酶抑制劑β內酰胺酶或金屬酶，另進行金屬酶檢測。以大腸埃希菌ATCC25922作陰性質控菌株，以肺炎克雷伯菌ATCC700603為ESBLs陽性對照，陰溝腸桿菌029M為高產(chǎn)AmpC酶的陽性對照。

產(chǎn)MBL菌株的檢測所有對亞胺培南耐藥菌株和耐酶抑制劑β內酰胺酶菌株均進行金屬酶檢測。按照文獻［5］等報道的協(xié)同法檢測金屬酶。將麥氏單位待測菌液均勻涂布在MH瓊脂平皿上，稍干后在平皿中心貼上含有EDTA紙片，在其10mm~15mm的周圍分別貼上亞胺培南和頭孢他啶(30μg)紙片，35℃過夜培養(yǎng)觀察結果。若EDTA與其中一種交界處有明顯的抑菌圈擴大現(xiàn)象表示待測菌產(chǎn)金屬碳青霉烯酶。

β內酰胺酶基因檢測根據(jù)EMBL公布的基因，采用Primer軟件設計β內酰胺酶基因TEM、SHV、PER1、VEB、AmpC、IMP1、VIM2型引物。

引物均由上海申能博彩生物公司合成；質粒提取試劑、細菌基因提取試劑、PCR試劑盒為上海申能博彩生物公司產(chǎn)品。

PCR產(chǎn)物在含μg/mlEB的%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外光線下觀察結果,在凝膠成像系統(tǒng)上成像。

2結果

三維試驗檢測結果單純產(chǎn)ESBLs的有3株，單純產(chǎn)AmpC酶的有10株，同時產(chǎn)ESBLs和AmpC酶的有3株。3株菌檢測EDTA與IPM有協(xié)同作用，為MBL陽性。

β內酰胺酶基因檢測被檢測的15株鮑曼不動桿菌均攜帶blaTEM基因，但均不含有SHV型基因；2株三維試驗ESBLs陽性的菌株含有blaPER1基因,未檢測到VEB型產(chǎn)ESBLs基因，三株同時產(chǎn)ESBLs和AmpC酶的菌株未檢測到超廣譜酶基因；在14株鮑曼不動桿菌中檢出有AmpC基因，AmpC基因陰性株為1例ESBLs陽性株，但另一ESBLs陽性而AmpC酶陰性株的AmpC基因檢測為陽性。15株被測菌均未檢出blaIMP1和blaVIM2金屬酶基因。見表2。

表1用于檢測耐藥基因的引物

表2三維試驗PCR方法檢測15株鮑曼不動桿菌ESBLs、AmpC、MBL結果

3討論

多重耐藥的鮑曼不動桿菌是困擾臨床抗感染治療的重要因素，尤其在老年患者、重癥患者和免疫力低下的患者群中，更易引起此類菌的感染。

產(chǎn)β內酰胺酶是鮑曼不動桿菌復雜耐藥機制中主要機制。本文研究的15株多重耐藥的鮑曼不動桿菌，均產(chǎn)生TEM型β內酰胺酶，但未發(fā)現(xiàn)SHV型廣譜酶，不同于國內其他地區(qū)的報道［6］。

產(chǎn)ESBLsblaPER1基因首先在法國發(fā)現(xiàn)于銅綠假單胞菌，后來在土耳其相繼發(fā)現(xiàn)blaPER1基因編碼產(chǎn)ESBLs的鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌［7］。據(jù)調查有46%的鮑曼不動桿菌攜帶該基因而且是不同的生物型。后來在韓國的不同醫(yī)院也發(fā)現(xiàn)PER1型產(chǎn)ESBLs鮑曼不動桿菌廣泛存在于ICU病房，其主要表現(xiàn)為對三、四代頭孢類全部耐藥，而且對氨基甙類、喹諾酮類也表現(xiàn)出明顯的耐藥性。目前在其他國家尚未報道。從本研究得出：從我院多重耐藥的鮑曼不動桿菌中，發(fā)現(xiàn)有產(chǎn)ESBLsblaPER1型基因,這是首次在我國發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌帶有該基因。說明blaPER1型產(chǎn)超廣譜β內酰胺酶鮑曼不動桿菌在我國已經(jīng)存在，雖然數(shù)量不多，但具有一定的流行病學價值，對認識多重耐藥菌的產(chǎn)生有重要意義。該基因是突變而來，還是從其他細菌中轉導而來，有待研究。

雖然產(chǎn)VEB型ESBLs鮑曼不動桿菌在歐洲已有發(fā)現(xiàn)，但我院并未發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)ESBLs基因型的鮑曼不動桿菌。有3株菌從三維試驗中檢測有ESBLs，而基因檢測為陰性，很可能是高產(chǎn)AmpC酶干擾所致。

在歐洲，產(chǎn)AmpC酶鮑曼不動桿菌已有發(fā)現(xiàn)。在分析西班牙一所醫(yī)院暴發(fā)的鮑曼不動桿菌感染中，發(fā)現(xiàn)染色體上攜帶有AmpC基因編碼的PI(8)為的［8］。該酶由1,152bp開放閱讀框架編碼383個氨基酸組成，與溫和氣單胞、粘質沙雷菌、銅綠假單胞菌產(chǎn)生的AmpC酶和CMY1、FOX2、FOX3酶有%~%的相同；與大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、費勞地枸櫞酸桿菌產(chǎn)生的AmpC酶有35%~40%相同。同時其氨基酸序列與C類頭孢菌素酶密切相關，而且該酶可被舒巴坦、他唑巴坦適量抑制，被克拉維酸很微弱抑制。因為在AmpC基因上沒有發(fā)現(xiàn)AmpR基因，用誘導劑誘導后并無酶量的增加，所以該AmpC酶為非誘導酶。像其他C類β內酰胺酶一樣，該AmpC酶對水解頭孢噻肟的效率比氨芐西林強，也可適量地水解頭孢呋辛和頭孢西丁，但對頭孢噻肟和亞胺培南的水解活性非常弱［9］。然而過量表達對青霉素類、三代頭孢霉素類都有較強的水解作用。從本文可知：產(chǎn)AmpC酶鮑曼不動桿菌在我院多重耐藥的鮑曼不動桿菌中普遍存在,這在我國尚首次報道，由于其過量表達，表現(xiàn)為對β內酰胺酶的水解活性，尤其可水解三代頭孢菌素。同時該AmpC酶為非誘導酶，所以給臨床治療帶來因難，需要引起臨床足夠重視。三維試驗檢測一株菌AmpC酶陰性，而檢出AmpC基因為陽性，可能為低產(chǎn)酶不易檢出所致。可見，三維試驗檢測相關β內酰胺酶有一定的局限性，值得臨床實驗室注意。

從20世紀90年代早期開始，在日本和歐洲就相繼發(fā)現(xiàn)依賴于鋅離子的IMP、VIM型金屬β內酰胺酶的銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和腸桿菌科細菌，可以耐受碳青霉烯類抗生素。金屬β內酰胺酶多以質粒插入到整合子上進行傳播的［10］。盡管有3株菌有協(xié)同試驗檢出為MBL陽性，但并未檢測出相關基因，可能為其他型MBL，或是協(xié)同試驗不確定性所致；2株藥敏結果對亞胺培南耐藥的細菌也未檢測到MBL，可能為其他碳青霉烯酶，有待進一步分析。

由此可見，我院多重耐藥鮑曼不動桿菌對β內酰胺類的耐藥機制主要是同時產(chǎn)TEM型廣譜酶和高產(chǎn)AmpC酶以及產(chǎn)blaPER1型ESBLs所致，是否有其他耐藥機制的并存，我們將繼續(xù)研究。

參考文獻:

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［4］吳偉元，陳民鈞，王輝.陰溝腸桿菌去阻遏持續(xù)高產(chǎn)AmpC酶和超廣譜β內酰胺酶的檢測［J］.中國臨床藥理學雜志，2001，17：914.

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［6］黃支密，陳榆，毛培華，等.鮑蔓不動桿菌耐藥性及β內酰胺酶基因型研究［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2003，11：683685.

［7］VahabogluH,OzturkR,AygunG,etdetectionofPER1typeextendedspectrumbet