分生實(shí)驗(yàn)：質(zhì)粒的提取和電泳

分生實(shí)驗(yàn)：質(zhì)粒的提取和電泳第一頁，共二十頁，編輯于2023年，星期日上次實(shí)驗(yàn)小結(jié)1、觀察自己組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：轉(zhuǎn)化平板*培養(yǎng)板在37C培養(yǎng)12-16h衛(wèi)星菌：培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)2、實(shí)驗(yàn)中的難點(diǎn)*制備效率高的感受態(tài)細(xì)胞o第二頁，共二十頁，編輯于2023年，星期日小量制備質(zhì)粒和電泳分析實(shí)驗(yàn)四開始實(shí)驗(yàn)操作前：本次實(shí)驗(yàn)介紹10-15min第三頁，共二十頁，編輯于2023年，星期日質(zhì)?！|(zhì)粒載體是存在于細(xì)菌染色體外的小型閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，在宿主細(xì)胞內(nèi)可獨(dú)立自主復(fù)制并賦予宿主細(xì)胞一定的遺傳性狀篩選標(biāo)記MCS（多克隆位點(diǎn)）復(fù)制原點(diǎn)質(zhì)粒第四頁，共二十頁，編輯于2023年，星期日1)培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；2)收集裂解細(xì)菌；3)分離純化質(zhì)粒DNA。

質(zhì)粒提取原理：質(zhì)粒提取有多種方法，但都包含有3個(gè)基本步驟：√去除蛋白質(zhì)√去除基因組DNA√去除RNA*酚-氯仿抽提法*RNase消化？？？第五頁，共二十頁，編輯于2023年，星期日質(zhì)粒DNA與基因組DNA的區(qū)別大腸桿菌遺傳物質(zhì)1、部位不同：2、大小不同：質(zhì)粒分子量較小，大小只有普通細(xì)菌染色體DNA的百分之一?；蚪MDNA分子量較大，細(xì)菌基因組約含3000個(gè)基因，5106

bp?；蚪MDNA容易斷裂線性化第六頁，共二十頁，編輯于2023年，星期日堿裂解法提取質(zhì)粒的原理原理：1、強(qiáng)堿和SDS裂解細(xì)菌，細(xì)菌中的質(zhì)粒或基因組DNA在堿性條件下發(fā)生變性。2、怎樣去除基因組DNA？當(dāng)加入酸性物質(zhì)進(jìn)行中和時(shí)，質(zhì)粒DNA很快復(fù)性，

染色體DNA則和變性蛋白質(zhì)等纏繞在一起難以復(fù)性而形成沉淀，經(jīng)離心隨細(xì)胞碎片一起去除；3、怎樣去除蛋白質(zhì)？（已經(jīng)學(xué)過）留有質(zhì)粒DNA的上清，經(jīng)酚和氯仿去除蛋白質(zhì)后,用乙醇沉淀質(zhì)粒DNA，即得到質(zhì)粒DNA.第七頁，共二十頁，編輯于2023年，星期日1)細(xì)胞懸浮液（溶液I）--懸浮菌體50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.HclPH8.010mmol/LEDTA.Na2PH8.02)細(xì)菌裂解液（溶液II）--裂解菌體0.2mol/L

NaOH1%SDS堿裂解法提取質(zhì)粒試劑：第八頁，共二十頁，編輯于2023年，星期日3）中和液（溶液III）----中和NaOH60ml5mol/L醋酸鉀11.5ml冰醋酸28.5ml水4）20mg/mlRNase----降解細(xì)菌RNA工作濃度30～50

g/ml其他試劑作用和成分同實(shí)驗(yàn)一。質(zhì)粒DNA的制備錄像5分鐘：（8：20~8：25）第九頁，共二十頁，編輯于2023年，星期日（1）（細(xì)菌的收獲：）

取1.5ml工程菌液6,000轉(zhuǎn)/分，離心2min，棄上清。（2）（細(xì)菌的裂解：）

加入200l預(yù)冷的細(xì)胞懸浮液（溶液I）懸浮細(xì)菌加入200l細(xì)菌裂解液（溶液II），顛倒混合離心管內(nèi)容物，待溶液變粘稠為止。注：粘稠：開蓋后出現(xiàn)拉絲現(xiàn)象，證明DNA已經(jīng)游出。（3）（中和：）加入150l中和液，上下顛倒混合后置冰上5min，12,000轉(zhuǎn)/分，4℃離心5min。

堿裂解法提取質(zhì)粒操作步驟開始操作：第十頁，共二十頁，編輯于2023年，星期日（去除蛋白質(zhì)）

（4）將上清移至另一離心管中(注意不要混入白色沉淀物)，加入等體積的TE飽和的酚/氯仿/異戊醇(25：24:1)混和液，振蕩混勻1min，12,000轉(zhuǎn)/分離心5min。（5）將上層水相移至另一離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)溶液，振蕩混勻1min，12,000轉(zhuǎn)/分離心5min。（沉淀DNA）（6）將上層水相移至另一離心管中，加入2.5倍體積的無水乙醇，置-20℃沉淀10－15min。上午實(shí)驗(yàn)結(jié)束第十一頁，共二十頁，編輯于2023年，星期日下午實(shí)驗(yàn)內(nèi)容１繼續(xù)提取質(zhì)粒：獲取及溶解沉淀的質(zhì)粒DNA2質(zhì)粒DNA電泳分析：第十二頁，共二十頁，編輯于2023年，星期日（7）12,000轉(zhuǎn)/分離心5min。

棄上清，室溫干燥質(zhì)粒DNA5-10min。（去除RNA）（8）用20l含RNase的水溶解質(zhì)粒DNA，輕輕吹打混合。37℃保溫10min20l質(zhì)粒DNA溶液取出10l放于另一個(gè)離心管中備用剩余10l用于下一步酶切繼續(xù)實(shí)驗(yàn)操作第十三頁，共二十頁，編輯于2023年，星期日取10

l

的質(zhì)粒DNA加2

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上樣液混勻。加到0.8%瓊脂糖凝膠的加樣孔內(nèi)。電泳條件：100V40min。電泳結(jié)束后照像保存，結(jié)果分析。質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳第十四頁，共二十頁，編輯于2023年，星期日質(zhì)粒提取方法質(zhì)粒的量質(zhì)粒的純度要求決定使用不同的方法質(zhì)粒的大小質(zhì)粒過大：溫和裂解質(zhì)粒大小適中：堿裂解，煮沸法如：如：大量提取質(zhì)粒：二次擴(kuò)增細(xì)菌，純化方法要復(fù)雜小量提取質(zhì)粒：?jiǎn)慰寺∨囵B(yǎng)，普通堿裂解法質(zhì)粒純度：要求高純度、無內(nèi)毒素等等（滿足各種轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的要求）要求不同的純化方法電泳時(shí)講授10-20min第十五頁，共二十頁，編輯于2023年，星期日方法舉例：經(jīng)典的方法：CsCl-溴化乙錠梯度密度離心特點(diǎn)：純度最高（可獲得高質(zhì)量的超螺旋質(zhì)粒DNA）、最貴、最麻煩應(yīng)用：大量制備質(zhì)粒；基因注射，基因轉(zhuǎn)染等對(duì)質(zhì)粒質(zhì)量要求高的實(shí)驗(yàn)缺口環(huán)狀或線狀DNA閉環(huán)質(zhì)粒DNA原理：不同結(jié)構(gòu)和大小的DNA參入的溴化乙錠的量不一樣從而在CsCl梯度密度離心中處于不同的位置第十六頁，共二十頁，編輯于2023年，星期日特點(diǎn)：小量質(zhì)粒制備、最簡(jiǎn)便、快捷應(yīng)用：質(zhì)粒酶切鑒定、克?。ù痔幔y(cè)序、轉(zhuǎn)染（細(xì)提）質(zhì)粒提取試劑盒常用方法：小量堿裂解法滿足不同需要的試劑盒純化原理：離子交換柱層析等小量制備質(zhì)粒kit大量制備質(zhì)粒kit去除內(nèi)毒素制備質(zhì)粒kit可用于大部分分生實(shí)驗(yàn)第十七頁，共二十頁，編輯于2023年，星期日質(zhì)粒的電泳質(zhì)粒DNA的3種形式泳動(dòng)速度:超螺旋>線性>開環(huán)

質(zhì)粒DNA的存在形式有3種:1、共價(jià)閉環(huán)DNA:常以超螺旋形式存在2、開環(huán)DNA:質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，因此可以自由旋轉(zhuǎn)從而消除張力,形成松弛的環(huán)狀分子

3、線性DNA:因質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂而造成.開環(huán)超螺旋線性第十八頁，共二十頁，編輯于2023年，星期日重組質(zhì)粒的鑒定平板篩選：大多數(shù)情況下，平板篩選只能區(qū)分含有或未含有質(zhì)粒的細(xì)胞，卻無法區(qū)分