實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌的染色和細(xì)菌細(xì)胞構(gòu)造的觀(guān)察

實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌的染色和細(xì)菌細(xì)胞構(gòu)造的觀(guān)察

Outline

目的要求染色劑和染色的原理實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)程序思考題目的要求學(xué)習(xí)微生物涂片掌握細(xì)菌的一般染色法和革蘭氏染色進(jìn)一步熟練掌握顯微鏡油鏡的使用技術(shù)觀(guān)察和識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞的特殊構(gòu)造染色劑和染色原理借助物理和化學(xué)因素的作用而進(jìn)行的。物理因素：細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對(duì)染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用等;

化學(xué)因素：正負(fù)離子之間的相互吸引等。細(xì)菌的等電點(diǎn)較低，pH值大約在2-5之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶負(fù)電荷；而堿性染料電離時(shí)染料離子帶正電荷。因此，帶負(fù)電荷的細(xì)菌常和帶正電荷的堿性染料進(jìn)行結(jié)合。

微生物染色的基本原理各種染料的特性與用途革蘭氏染色原理細(xì)菌細(xì)胞電鏡照片-----外層為細(xì)胞壁革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌細(xì)胞壁比較革蘭氏陽(yáng)性菌革蘭氏陰性菌革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁組成革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁組成實(shí)驗(yàn)材料涂片染色用的細(xì)菌培養(yǎng)物大腸桿菌（Escherichiacoli)24h的斜面培養(yǎng)物

枯草桿菌（Bacillussubtilis)12-16h的斜面培養(yǎng)物載玻片、接種環(huán)、鑷子、酒精燈、各種染色液、火柴、無(wú)菌牙簽、玻璃鉛筆、蒸餾水。顯微鏡、鏡頭油、擦鏡紙、吸水紙、二甲苯等。示范片

蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis）的芽孢；

膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillusmucillaginosus）的莢膜；

枯草芽孢桿菌的鞭毛。實(shí)驗(yàn)程序涂片---干燥---固定---染色---水洗---干燥---鏡檢

該法可觀(guān)察微生物大小、形狀和細(xì)胞排列狀況，但不能鑒別微生物的特殊構(gòu)造等。

簡(jiǎn)單染色法(各人取牙垢或指甲垢制片觀(guān)察

)

凡是被染上顏色，且具有典型的球狀、桿狀或螺旋狀的目視物都可視為細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)程序從大腸桿菌和金黃色葡萄球菌斜面中挑取菌苔時(shí)必須遵循無(wú)菌操作規(guī)程。

無(wú)菌操作革蘭氏染色1.

涂片2.初染：涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1min，傾去染液，流水沖洗至無(wú)紫色3.媒染：用路哥氏碘液沖去殘水，并覆蓋涂面1min，水洗。4.脫色：除去殘水后，滴加95%酒精脫色約30s，水洗。5.復(fù)染：滴加番紅染色液，染1min，水洗后用吸水紙吸干。6.

鏡檢：觀(guān)察染色結(jié)果并繪圖。染色結(jié)果金黃色葡萄球菌大腸桿菌莢膜染色的方法和步驟1.涂片：取斜面培養(yǎng)72h左右的膠質(zhì)芽孢桿菌涂片，自然干燥，自然固定。2.染色：在已自然晾干的涂面上，滴加1%結(jié)晶紫染色液染色2min，以20%硫酸銅沖洗數(shù)次，再用自來(lái)水沖洗1次，晾干。3.鏡檢：油鏡觀(guān)察示范片并繪圖(菌體紅色，莢膜無(wú)色)。

莢膜薄，易變形，因此在涂片過(guò)程中不能用加熱固定。芽孢染色的方法和步驟1.涂片：培養(yǎng)24h的枯草芽孢桿菌進(jìn)行涂片、干燥、固定，操作方法同簡(jiǎn)單染色法。2.染色：在涂面上鋪一層濾紙，在濾紙上滴加孔雀綠染色液，使濾紙片濕潤(rùn)，放在水浴鍋上以蒸汽加熱（或用酒精燈加熱至冒蒸汽而不沸騰），不斷添加孔雀綠染色液，在冒蒸汽的條件下染色10min，切勿使涂面干涸，也勿使染液沸騰，冷卻后水洗至無(wú)綠色流出為止，再用番紅染色液復(fù)染1min，水洗并風(fēng)干后鏡檢。3.鏡檢：油鏡下觀(guān)察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色鞭毛染色的方法和步驟菌液的制備及涂片:(菌種應(yīng)預(yù)先連續(xù)傳代5-6代)1.接種：先在斜面底部加入0.5-1mL無(wú)菌水，取活化的枯草桿菌1-2環(huán)菌苔，接種于無(wú)菌水中，300C培養(yǎng)15-18h。2.制備菌液：挑取斜面底部近水面處菌苔數(shù)環(huán)，移入1mL與菌種同溫的無(wú)菌水中，280C溫箱保溫10min。3.鞭毛涂片：先用懸滴法觀(guān)察其運(yùn)動(dòng)性，若運(yùn)動(dòng)性很強(qiáng)，即可涂片。涂片后自然干燥、固定。染色：染色液必須新配制，涂片必須充分晾干才能染色。1.

先用剛過(guò)濾的鞭毛染色液A染7.5-8min左右。2.傾去A液，再加鞭毛染色液B液染3-5min，水洗，自然干燥。3.

用c液石炭酸復(fù)紅復(fù)染2min，水洗、晾干、鏡檢。油鏡下觀(guān)察鞭毛的數(shù)目及著生情況