實驗一蘇云金芽孢桿菌ICP基因的檢測

微生物遺傳部分1實驗四、T4噬菌體基因組rII

區(qū)域不同基因突變的互補(bǔ)

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導(dǎo)語T4是研究得最深入的一類大腸桿菌烈性噬菌體，其基因組是雙鏈線性DNA分子，約有1.7x105堿基對，編碼的蛋白質(zhì)超過135種。T4基因組的兩端具有約3～6kb的正向重復(fù)序列，全長比其頭部長650倍，意味著T4DNA是高度螺旋、緊密折疊地裝配在頭部中。T4基因組rII區(qū)域有2個基因rIIA和rIIB，這2個基因突變均表現(xiàn)為快速溶菌，這種快速溶菌突變型的生長對大腸桿菌的不同品系具有選擇性：突變型若感染E.coliC菌株，可以形成大而透明的噬菌斑，因此將E.coliC菌株稱為受納性寄主；突變型若感染E.coliK菌株，則不能復(fù)制其DNA,因此不能形成噬菌斑，因此將E.coliK菌株稱為限制性寄主。S.Benzer巧妙地利用這一特點設(shè)計了經(jīng)典的互補(bǔ)實驗，首次證明順反子（Cistron即基因）是一個必須保持完整才具有正常生理功能的遺傳物質(zhì)最小的功能單位。一個基因或一個順反子是一個完整的結(jié)構(gòu)，所以屬于同一基因的兩個突變型不能互補(bǔ)，如果兩個突變型能夠互補(bǔ)，就說明它們屬于不同的基因突變，影響的不是同一功能。3導(dǎo)語

T4噬菌體是一類專性寄生的原核生物，只能在寄主細(xì)胞內(nèi)繁殖。噬菌體比細(xì)菌繁殖速度快得多，典型的細(xì)菌一般在30min內(nèi)由1個變?yōu)?個，而1個T4噬菌體在相同的時間內(nèi)可以形成將近100個左右的子代噬菌體，因此2h后當(dāng)細(xì)菌和噬菌體都繁殖了4代時，細(xì)菌的數(shù)目是24＝16，而噬菌體的數(shù)目卻是1004＝108！4導(dǎo)語自從1917年發(fā)明在平板上觀察噬菌斑（plaque）的方法后一直延續(xù)至今，噬菌體濃度的測定也是通過計數(shù)噬菌斑的多少。100個細(xì)菌在平板上會形成100個菌落，若108個細(xì)菌在平板上會融合在一起形成一個渾濁層，稱為“l(fā)awn”，為使菌體能形成均勻的一層，首先將細(xì)菌混合在少量熱的液體瓊脂中，然后倒在固體平板的上層，這一液體瓊脂稱為Topagar或Softagar，它會迅速凝固形成一個光滑的表層，細(xì)菌在這一薄層中會長得非常均勻。如果有1個噬菌體存在，它將會感染細(xì)菌，隨后被感染的細(xì)菌裂解后釋放100～200個子代噬菌體，它們又去感染附近的細(xì)菌，如此延續(xù)下去幾個小時，噬菌體就會把這一區(qū)域的細(xì)菌全部吃光，在渾濁均勻?qū)由闲纬梢粋€清晰透明的洞，稱為plaque,因為1個噬菌體形成1個plaque，故噬菌體的濃度便可以計算出。噬菌體的濃度單位稱為噬斑形成單位，表示：PFU/mL。5

一、實驗?zāi)康?/p>

通過實驗了解基因互補(bǔ)的原理，并確定幾個T4快速溶菌突變型是否屬同一基因突變。6

二、實驗原理將2個不同的T4rII突變型共同感染限制性寄主E.coliK菌株,若2個突變的噬菌體不是影響相同的功能,則可表現(xiàn)互補(bǔ)使其各自的DNA在E.coliK菌株中得以復(fù)制,在復(fù)制過程中相互重組,進(jìn)而形成了野生型的噬菌體,野生型的噬菌體經(jīng)反復(fù)感染和裂解限制性寄主,便可形成清晰的噬菌斑。將一系列表型相同的rII突變型,雙雙混合感染限制性宿主進(jìn)行互補(bǔ)實驗，全部rII突變型可以區(qū)分為rIIA和rIIB兩個互補(bǔ)群，同屬于rIIA或rIIB的兩個突變型在混合感染中沒有互補(bǔ)作用，任何一個rIIA突變型和任何一個rIIB突變型在混合感染中都有互補(bǔ)作用，使表型恢復(fù)正常。一系列rIIA突變型在染色體上所占的區(qū)域稱為順反子A，一系列rIIB突變型在染色體上所占的區(qū)域稱為順反子B，由于rII突變型均為點突變，故實驗中必須要有檢測回復(fù)突變的對照。7

三、實驗材料和用具菌種：E.coliC(受納性寄主)和E.coliK（限制性菌株）過夜培養(yǎng)物T4rII突變型26，28，29：點樣濃度為1x108/ml,倒平板濃度為1x109/mlHA平板9塊（效價測定用5塊）HSA試管3mLx9只20l、200l移液器各一支，Tip48oC水浴8

四．實驗方法和內(nèi)容

（一）噬菌體T4裂解液的制備

1．雙層平板法制備裂解液（1）將E.coliC接種3mLHB中，37℃震蕩培養(yǎng)5—6小時。（2）制備HA平板，待凝固后置50℃烘30分鐘備用。（3）取小試管一只，加0.5mL菌懸液，加0.2mL濃度為105～106的T4儲存液，再加入3mL50℃左右的HSA（軟瓊脂培養(yǎng)基），混合均勻后倒在HA平板上層，凝固后37℃培養(yǎng)過夜。（4）用涂棒將HA平板上層軟瓊脂刮入離心管，加入3mLHB，靜置30分鐘，加2—3滴氯仿，劇烈震蕩半分鐘。（5）4000rpm離心15min，取出上清液，加幾滴氯仿，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?（一）噬菌體T4裂解液的制備

2．液體法制備裂解液（1）將E.coliC接種3mLHB中，37℃震蕩培養(yǎng)2~3小時。（2）加入1%體積的T4儲存液（或單噬斑1個），繼續(xù)震蕩培養(yǎng)5小時，一般應(yīng)測OD600值，當(dāng)OD值下降又回升時停止培養(yǎng)。（3）加2~3滴氯仿，震蕩半分鐘，4000rpm離心15分鐘，取上清液加幾滴氯仿，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?0（二）裂解液效價測定

將E.coliC接種3mLHB中，37℃震蕩培養(yǎng)5小時。制備HA平板，待凝固后置50℃烘30分鐘備用。將T4裂解液依次稀釋至10-7。取一只小試管，加入0.2mLE.coliC，加入T4裂解液0.1mL（10-6，10-7），每個稀釋度兩只試管，再加入2.5mLHAS（50℃左右），混合均勻后迅速倒在HA平板上層，凝固后，37℃倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)6小時后，便可以計數(shù)噬菌斑，計算裂解液效價。檢測回復(fù)突變，取一只小試管，加入0.2mLE.coliK，加入T4裂解液0.1mL（10-5），再加入2.5mLHAS（50℃左右），混合均勻后迅速倒在HA平板上層，凝固后，37℃倒置培養(yǎng)。11

（三）互補(bǔ)實驗1）取E.coliK，接種于HB培養(yǎng)基，37oC，180rpm振蕩培養(yǎng)過夜。2）首先制備好4塊HA平板，將裝有HSA（軟瓊脂）的試管置于48oC水浴保溫。3）在每一HA平板的底部預(yù)先標(biāo)記好以下內(nèi)容：Nophage,26X,28X,29X12（三）互補(bǔ)實驗4）在每支HSA試管中加0.2mlE.coliK過夜培養(yǎng)物。5）將第一支HSA試管倒到“無噬菌體”的平板上，用做回復(fù)突變的對照。6）往第二支HSA試管中加0.1mlrII26(1x109/mL),混合好后倒“26x”平板，其它的噬菌體均以相同的方式倒好平板。7）將噬菌體26，28，29分別進(jìn)行10倍稀釋。8）用接種環(huán)或用移液器吸取3-5l各種稀釋后的噬菌體懸液（1x108/ml），小心點到每一平板相應(yīng)的位置上。13實驗注意事項：

點樣時應(yīng)小心勿將瓊脂劃破！各種噬菌體的點樣位點必須有一定間隔，防止連成片不易分析結(jié)果！點完樣后不要立即翻動平板，待所點樣品完全干后，再倒置平板培養(yǎng)！14

五．實驗報告：（一）實驗結(jié)果用+或表示，如點樣位置上有較多的噬菌斑則為，無噬菌斑則為，但要與對照平板比較，檢查每一rII突變