實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離詳解演示文稿

實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離詳解演示文稿本文檔共48頁；當前第1頁；編輯于星期日\13點6分優(yōu)選實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離本文檔共48頁；當前第2頁；編輯于星期日\13點6分特點：結(jié)構(gòu)都相當簡單,個體多數(shù)十分微小.通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結(jié)構(gòu).微生物包括哪五類：病毒細菌放線菌真菌原生動物原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、基礎(chǔ)知識：

(一)微生物：是一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱．本文檔共48頁；當前第3頁；編輯于星期日\13點6分(二)細菌的常識1、結(jié)構(gòu)2、分裂3、生殖4、變異類型5、在基因工程中的應用本文檔共48頁；當前第4頁；編輯于星期日\13點6分大腸桿菌本文檔共48頁；當前第5頁；編輯于星期日\13點6分細菌的外形與大小大腸桿菌屬于桿狀菌圖1-1常見的三種細菌典型形態(tài)A.球菌B.桿菌C.弧菌本文檔共48頁；當前第6頁；編輯于星期日\13點6分根據(jù)細菌所利用的能源和碳源的不同將細菌分為兩大營養(yǎng)類型。自養(yǎng)菌:異養(yǎng)菌:腐生菌寄生菌大部分病原菌細菌的營養(yǎng)類型光能自養(yǎng)型:光合細菌化能自養(yǎng)型:硝化細菌,鐵細菌,硫細菌大腸桿菌屬于異養(yǎng)兼性厭氧菌本文檔共48頁；當前第7頁；編輯于星期日\13點6分細菌的革蘭氏染色革蘭氏染色法是一種用于細菌的染色法。此法將細菌分為兩類，即革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。所謂革蘭氏陽性菌就是用革蘭氏染液染色后，再用脫色液處理，細菌仍保留染色液的顏色；革蘭氏陰性菌則相反。這兩種菌的差別在于細胞壁的成分不同。大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌本文檔共48頁；當前第8頁；編輯于星期日\13點6分☆

培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。1.培養(yǎng)基的類型(三)細菌的培養(yǎng)成分區(qū)別：瓊脂本文檔共48頁；當前第9頁；編輯于星期日\13點6分2.不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方3.不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮源、無機鹽、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對pH、氧氣、滲透壓的要求．細菌喜葷，霉菌喜素大腸桿菌配方：酵母提取物

0.25g蛋白胨

0.5gNacl

0.5g瓊脂

1g水:50ml本文檔共48頁；當前第10頁；編輯于星期日\13點6分4.培養(yǎng)基的用途液體培養(yǎng)基：擴增細菌、工業(yè)生產(chǎn)固體培養(yǎng)基：純化（分離），鑒定、保藏菌種本文檔共48頁；當前第11頁；編輯于星期日\13點6分單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)?！罹?/p>

本文檔共48頁；當前第12頁；編輯于星期日\13點6分液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長本文檔共48頁；當前第13頁；編輯于星期日\13點6分☆無菌技術(shù)1.無菌技術(shù)的概念

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。成功地培養(yǎng)微生物的關(guān)鍵。本文檔共48頁；當前第14頁；編輯于星期日\13點6分（１）消毒定義：2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別

（2）滅菌的定義：3.常用的消毒與滅菌的方法是指殺滅大部分病原微生物的方法。是指殺滅或清除環(huán)境中一切微生物（包括芽胞、孢子）的方法本文檔共48頁；當前第15頁；編輯于星期日\13點6分消毒的方法：1、100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、用75%酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒4、氯氣消毒水源5、紫外線消毒……本文檔共48頁；當前第16頁；編輯于星期日\13點6分滅菌的方法：1、灼燒滅菌2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.本文檔共48頁；當前第17頁；編輯于星期日\13點6分1、灼燒滅菌滅菌的方法：本文檔共48頁；當前第18頁；編輯于星期日\13點6分2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.本文檔共48頁；當前第19頁；編輯于星期日\13點6分1.無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。思考本文檔共48頁；當前第20頁；編輯于星期日\13點6分實驗用具LB固體培養(yǎng)基大腸桿菌菌液（LB液體培養(yǎng)基）培養(yǎng)皿接種環(huán)酒精棉酒精燈鑷子、火柴、記號筆本文檔共48頁；當前第21頁；編輯于星期日\13點6分本文檔共48頁；當前第22頁；編輯于星期日\13點6分配制培養(yǎng)基包器材滅菌菌種擴增倒平板接種、劃線培養(yǎng)觀察記錄實驗流程本文檔共48頁；當前第23頁；編輯于星期日\13點6分二、大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實驗操作（一）培養(yǎng)基的配置與滅菌取2個250ml的三角瓶中分別裝入50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB固體培養(yǎng)基（剛配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮紙包裝后高壓鍋滅菌15min。LB液體培養(yǎng)基——細菌的擴大培養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基——細菌的劃線分離封口膜：既通氣又不使菌進入本文檔共48頁；當前第24頁；編輯于星期日\13點6分（二）倒平板滅菌后的培養(yǎng)基在無菌操作臺上倒入4個培養(yǎng)皿中，倒后立即置于水平位置上，輕輕晃動，使培養(yǎng)基鋪滿平皿底部，待凝，使之形成平面本文檔共48頁；當前第25頁；編輯于星期日\13點6分注意事項：1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60℃左右時，才能用來倒平板2.滅菌及消毒：無菌操作臺用超凈紫外燈和過濾風滅菌；桌面及人手用酒精棉球消毒

3.操作時右手無名指和小指夾住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培養(yǎng)皿并打開上蓋的一邊,在酒精燈火焰旁操作.4.需要使錐形瓶的瓶口通過火焰，灼燒滅菌5.平板冷凝后，要將平板倒置,既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染.本文檔共48頁；當前第26頁；編輯于星期日\13點6分（三）大腸桿菌的擴大培養(yǎng)將斜面上培養(yǎng)的大腸桿菌菌種接種到滅菌后的液體培養(yǎng)基中,使其在37℃搖床培養(yǎng)12小時。注意事項:1.火焰旁從斜面上用接種環(huán)取菌;2.取菌前接種環(huán)要用酒精燈灼燒滅菌,冷卻后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞復原.本文檔共48頁；當前第27頁；編輯于星期日\13點6分菌種擴增搖床震蕩培養(yǎng)12h（于LB液體培養(yǎng)基中）本圖來自十一學校本文檔共48頁；當前第28頁；編輯于星期日\13點6分（四）大腸桿菌的劃線分離分離方法:劃線分離法和涂布分離法本文檔共48頁；當前第29頁；編輯于星期日\13點6分1、劃線分離法無菌操作臺上用接種環(huán)取菌后在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線.本文檔共48頁；當前第30頁；編輯于星期日\13點6分平板劃線的操作本文檔共48頁；當前第31頁；編輯于星期日\13點6分不能使用脫脂棉，否則容易吸水，造成污染。本文檔共48頁；當前第32頁；編輯于星期日\13點6分一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個細胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。本文檔共48頁；當前第33頁；編輯于星期日\13點6分本文檔共48頁；當前第34頁；編輯于星期日\13點6分本文檔共48頁；當前第35頁；編輯于星期日\13點6分（四）大腸桿菌的劃線分離注意事項:1.接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次.2.劃線首尾不能相接3.劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)12~24h1、劃線分離法本文檔共48頁；當前第36頁；編輯于星期日\13點6分本文檔共48頁；當前第37頁；編輯于星期日\13點6分問題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。本文檔共48頁；當前第38頁；編輯于星期日\13點6分2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。本文檔共48頁；當前第39頁；編輯于星期日\13點6分分離后,一個菌體便會形成一個菌落,這是消除污染雜菌的通用方法,也是用于篩選高表達量菌株的最簡便方法之一本文檔共48頁；當前第40頁；編輯于星期日\13點6分2、涂布分離法:是指將培養(yǎng)的菌液稀釋一定的倍數(shù),然后取一定量稀釋液加在固體培養(yǎng)基上,用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上.本文檔共48頁；當前第41頁；編輯于星期日\13點6分本文檔共48頁；當前第42頁；編輯于星期日\13點6分劃線分離法和涂布分離法哪個更好呢？劃線分離：方法簡單，但單菌落較難分開。涂布分離：單菌落更易分開，但操作復雜。本文檔共48頁；當前第43頁；編輯于星期日\13點6分（五）大腸桿菌分離后保存1、臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。2、長期保存：甘油冷凍管藏法本文檔共48頁；當前第44頁；編輯于星期日\13點6分1.如何操作才可以盡量避免被雜菌污染?(1)膽大心細，操作快捷。（2）注意滅菌操作原則，滅菌徹底，降低環(huán)境污染概率。（3）注意微生物生長條件，如PH、滲透壓、溫度等。細菌喜堿，喜蛋白質(zhì)，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度本文檔共48頁；當前第45頁；編輯于星期日\13點6分2.在培養(yǎng)后如何判斷是否有雜菌污染?（1）菌落的形態(tài)看，是否濕潤，透明，粘稠，顏色等。是區(qū)別細菌、酵母、放線菌和霉菌關(guān)鍵指標。（2）顯微鏡觀察其形態(tài)、大小、看是否有菌絲、孢子、芽孢。是區(qū)別細菌、酵母、放線菌和霉菌關(guān)鍵指標。（3）上述方法較難區(qū)別同類的不同物種，需借助化學和進一步的形態(tài)觀察，如用革蘭氏染色法等。本文檔共48頁；當前第46頁；編輯于星期日\13