放射免疫分析

放射免疫分析體外放射分析技術(shù)利用放射分析方法或其派生的相關(guān)技術(shù)在體外進(jìn)行體內(nèi)物質(zhì)種類和含量的分析測定。競爭性放射分析——放射免疫分析（RIA）非競爭性放射分析——免疫放射分析（IRMA）2020/11/42

待測物質(zhì)濃度與檢測手段臨床化學(xué)分析10-1210-910-610-310-0pg/mLng/mLmg/mLmg/mLg/L免疫分析TherapeuticDrugsThyroidHormoneFertilityHormoneAllergyCancerMarkersInfectiousDiseaseVitaminsSerumProteins2020/11/43第三章放射免疫分析放射免疫分析法免疫放射分析法臨床應(yīng)用2020/11/44放射免疫分析的創(chuàng)立1959美國Yalow&Berson1960英國Ekim’s1977獲諾貝爾醫(yī)學(xué)生物學(xué)獎醫(yī)學(xué)生物學(xué)超微量分析的里程碑2020/11/451959年，Yalow和Berson創(chuàng)立了放射免疫分析法（RIA），并因此于1977年獲得諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎。這種方法結(jié)合了放射性核素測量的高靈敏性和免疫抗原-抗體反應(yīng)的高特異性兩大特點，開創(chuàng)了生物活性物質(zhì)微量測定技術(shù)的先河。女科學(xué)家R.Yalow放射免疫分析法

（Radioimmunoassay，RIA）2020/11/46基本原理Ag+AbAg-Ab

+

Ag*

Ag*-Ab

競爭結(jié)合：放射性標(biāo)記的抗原（Ag*）和非標(biāo)記的抗原（Ag）在同一反應(yīng)系統(tǒng)中與特異性抗體（Ab）的競爭性結(jié)合。2020/11/47在上反應(yīng)式中：Ag與Ag*的免疫活性相同，即與Ab有相同的親和力；Ab的結(jié)合位點數(shù)＞Ag或Ag*，但＜Ag+Ag*；Ag*與Ab的量是恒定的，Ag是待測量。2020/11/48二種抗原(Ag、Ag*)與Ab結(jié)合的量取決于兩者的濃度比例，Ag量多，則AgAb結(jié)合多，Ag*Ab結(jié)合量就少，即Ag*Ab將隨Ag的增加而減少，呈負(fù)相關(guān)，表現(xiàn)為函數(shù)關(guān)系。在系統(tǒng)中，Ag*Ab的量可通過測定放射性而獲得，再根據(jù)函數(shù)關(guān)系求Ag的量。2020/11/49++++++++BoundFreeAgAb2020/11/410標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線又稱為劑量反應(yīng)曲線，以一系列遞增濃度的Ag及一定量的Ag*與恒定量限量的Ab競爭結(jié)合反應(yīng)而得，是對待測物進(jìn)行定量分析的基礎(chǔ)。2020/11/411標(biāo)準(zhǔn)曲線實例2020/11/412標(biāo)準(zhǔn)曲線:①配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原，分別向其中加入固定量的標(biāo)記抗原和抗體，反應(yīng)平衡后，分離抗原的結(jié)合部分和游離部分，測定*Ag-Ab的放射性B。②B0為標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度=0時的放射性值。2020/11/413放免分析基本條件（一）標(biāo)準(zhǔn)抗原（二）特異性抗體（三）標(biāo)記抗原（四）分離技術(shù)2020/11/414a.概念：是指已知真實含量，且不含對免疫反應(yīng)產(chǎn)生干擾雜志的抗原。b.用途：免疫動物制備抗體——Ab放射性核素標(biāo)記——Ag*

繪制劑量反應(yīng)曲線c.

要求：高純度高準(zhǔn)確度良好的穩(wěn)定性

（一）標(biāo)準(zhǔn)抗原

2020/11/415（二）特異性抗體

a.對特異性結(jié)合抗體的要求：1．親和力（affinity）高：指單個抗體分子與抗原決定簇特異結(jié)合的能力，用親和常數(shù)Ka值表示，反映靈敏度，Ka應(yīng)達(dá)109~1012mol/L。2．特異性高：與待測抗原的結(jié)合力高，而與待測抗原類似物的結(jié)合能力（交叉反應(yīng)率）低。3．滴度（效價）高：指將血清稀釋時能與抗原發(fā)生反應(yīng)的最高稀釋度。它反映抗血清中有效抗體的濃度。稀釋倍數(shù)越高，滴度(titer)越高，表示抗體的效價越高。4．穩(wěn)定性好：能長期保存，化學(xué)性質(zhì)、效價穩(wěn)定。2020/11/416b.抗血清的制備：1.大分子物質(zhì)可直接免疫動物誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，但是小分子物質(zhì)為半抗原，必須與載體結(jié)合制成人工抗原（半抗原-蛋白質(zhì)），才能進(jìn)行免疫。2．選擇合適的免疫動物：兔、鼠、羊。3．應(yīng)用佐劑：福氏完全佐劑與不完全佐劑（羊毛脂、石蠟油+卡介苗）。4．選擇合適的免疫方法：劑量、接種途徑（腹股溝、腋窩、脊柱兩側(cè)皮內(nèi)多點）、間隔時間（加強(qiáng)）與次數(shù)。2020/11/417c.單克隆抗體的使用：特異性高

親和力低，不一定優(yōu)于傳統(tǒng)的多克隆抗體2020/11/418對標(biāo)記抗原的要求：1．放射性比活度高：即單位物質(zhì)的放射性強(qiáng)度高，一般至少達(dá)到370GBq/mmol。2．免疫活性：與標(biāo)記前一致。3．放射化學(xué)純度高：應(yīng)>95%。4．穩(wěn)定性好：標(biāo)記的同位素不易脫落。（三）標(biāo)記抗原

2020/11/419常用標(biāo)記核素：（1）125I：γ射線，半衰期60天（2）3H：β射線，半衰期12.3年測量儀器：（1）γ計數(shù)儀（2）β液體閃爍計數(shù)器

2020/11/420兩種標(biāo)記方法的優(yōu)缺點

3H標(biāo)記物125I標(biāo)記物

貨架期長貨架期短以3H置換H，對原物質(zhì)以125I取代H，可能影響免疫活性無改變免疫活性標(biāo)記難度大，比活度低標(biāo)記方法簡單，比活度高Β射線測量效率低γ射線測量效率高廢棄物處理較困難廢棄物處理較容易2020/11/421a.對分離方法的要求：1．使抗原-抗體復(fù)合物（B）與游離抗原（F）盡可能分離完全；2．分離后便于放射性測量；3．分離效果不受外界干擾因素的影響；4．操作簡便、分離迅速、重復(fù)性好；5．與游離標(biāo)記物的非特異性結(jié)合盡可能??；6.試劑來源廣泛、價格低廉。（四）分離技術(shù)

2020/11/422b.常用的分離方法

1.雙抗體法特點：分離完全，非特異結(jié)合小，環(huán)境影響小，效價高，但分離時間長，成本高。2020/11/4232.沉淀法聚乙二醇（w=6000）特點：快速，價廉，來源方便，受環(huán)境影響大3.雙抗體PEG法將雙抗體和沉淀法兩者結(jié)合進(jìn)行分離。本法具有兩種方法的優(yōu)點，并克服了雙抗體分離時間長和沉淀法非特異性結(jié)合高的缺點。2020/11/4244．固相分離法將抗體通過特殊技術(shù)聯(lián)結(jié)在固相載體上，免疫反應(yīng)在固相載體上完成，達(dá)到平衡后形成固相的Ag-Ab

復(fù)合物，可與游離部分分離。此方法具有操作簡便，迅速，分離效果好，非特異性結(jié)合低等優(yōu)點。2020/11/4252020/11/4265.磁化分離法6.葡萄球菌A蛋白分離法（SPA分離法）7.微孔濾膜法2020/11/427放免分析的優(yōu)點靈敏度高特異性強(qiáng)精確度高用血量少缺點：污染；放射性核素衰變及不穩(wěn)定2020/11/428第三章放射免疫分析放射免疫分析法免疫放射分析法臨床應(yīng)用2020/11/4291968年，Miles和Hales創(chuàng)立了免疫放射分析法（IRMA）。IRMA與IRA不同，它是將放射性核素標(biāo)記在抗體上，而不是標(biāo)記在抗原上。同時所用的標(biāo)記抗體與待測抗原比較是過量的。

Ag+Ab*Ag-Ab*+Ab*BF由上式可見，IRMA不存在競爭反應(yīng)，是待測抗原直接與標(biāo)記抗體反應(yīng)。待測抗原的量與抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物的量成正相關(guān)關(guān)系。

免疫放射分析法

（immunoradiometricassay，IRMA）2020/11/4301.單位點IRMA單位點（one-site）IRMA是利用過量的標(biāo)記抗體（Ab*）與待測抗原（Ag）進(jìn)行免疫結(jié)合反應(yīng)，形成抗原標(biāo)記抗體復(fù)合物，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡后，再用固相抗原免疫吸附劑（SP-Ag）與剩余的標(biāo)記抗體結(jié)合，并將其分離。2020/11/4312.雙位點IRMA將抗體1結(jié)合于固相表面，加入標(biāo)本后，待測抗原與固相抗體形成抗原-抗體復(fù)合物，并留在固相表面。洗去其他物質(zhì)后，加入標(biāo)記抗體2，在固相表面形成抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，再洗去多余標(biāo)記抗體，即可達(dá)到分離目的。2020/11/432競爭性分析與非競爭分析的比較2020/11/433第三章放射免疫分析放射免疫分析法免疫放射分析法臨床應(yīng)用2020/11/434放射免疫分析技術(shù)的臨床應(yīng)用一甲狀腺疾病二代謝類疾病三骨和礦物質(zhì)代謝四腫瘤五心血管疾病六器官移植中的藥物監(jiān)控2020/11/435一甲狀腺疾病TSH促甲狀腺激素STSH高靈敏度甲狀腺激素FT3血清游離三碘甲狀腺原氨酸FT4游離甲狀腺素TgAb抗甲狀腺球蛋白抗體TmAb抗甲狀腺微粒體抗體2020/11/436臨床上確診為甲狀腺功能亢進(jìn)的步驟STSH,FT3,FT4STSH↓,FT3↑,FT4↑STSH↓,FT3↑,FT4正常STSH↓,FT3↑,FT4正常確診甲亢攝131Ⅰ率攝131Ⅰ率攝131Ⅰ率↑攝131Ⅰ率↓T4甲亢（伴有甲腫）病人服T3，（多無甲腫，F(xiàn)T4有時↓）攝131Ⅰ率↑攝131Ⅰ率↓T4甲亢（伴有甲腫）病人服T3，（多無甲腫）攝131Ⅰ率攝131Ⅰ率↑或正常攝131Ⅰ率↓①毒性彌漫性甲腫（Graves?。诙嘟Y(jié)節(jié)甲腫（結(jié)節(jié)性甲亢）③大的單個結(jié)節(jié)（自主性結(jié)節(jié)甲亢）有甲腫時多為：①亞甲炎伴甲亢②碘致甲亢③甲狀腺內(nèi)轉(zhuǎn)移癌伴甲亢無甲腫時多為醫(yī)源性甲亢2020/11/437臨床上確診為甲狀腺功能減退的步驟STSH,FT4STSH↑,FT4↓原發(fā)性甲低有甲狀腺腫無甲狀腺腫抗甲狀腺抗體陽性①131I治療后②甲狀腺手術(shù)后或甲腺外照射③無甲狀腺腫克丁病橋本甲狀腺炎抗甲狀腺抗體陰性①激素合成障礙②藥物引起（碘、鋰）③碘缺乏癥（地甲腫）抗甲狀腺抗體陽性抗甲狀腺抗體陽性抗甲狀腺抗體陰性2020/11/438二代謝類疾病胰島素原（proinsulin）正常生理條件下，胰島素原分子釋放很少，占總分泌5%-10%，因此不考慮其對胰島素測定的影響。在病理情況下，如胰島素瘤，血中胰島素原可達(dá)50%-70%。目前，市場上已有用純胰島素原做為標(biāo)準(zhǔn)品的放免藥盒，可用來直接測定血清或血漿中的胰島素原含量。2020/11/439人真胰島素(insulinspecific)不經(jīng)處理的血漿，通過放免法測得的胰島素稱為免疫反應(yīng)性胰島素（IRI），IRI與胰島素原有明顯的交叉反應(yīng)，當(dāng)血清中胰島素原含量較高時，應(yīng)考慮對胰島素測定的影響。人真胰島素放免分析可特異性測定人血清中與胰島素原無交叉反應(yīng)的胰島素水平，是確切評價β細(xì)胞功能和胰島素敏感性的關(guān)鍵指標(biāo)。2020/11/440三骨和礦物質(zhì)代謝1,25二羥基維生素D及25羥基維生素D體內(nèi)維生素D經(jīng)日光紫外線照射、且在C1和C25位羥基化后，才能轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘木S生素D代謝物。測定血清中1,25二羥基維生素D及25羥基維生素D的濃度可鑒別與維生素代謝有關(guān)的疾病。目前國內(nèi)用維生素D放免藥盒用于維生素D缺乏癥、骨營養(yǎng)不良、肝炎和藥物性維生素D紊亂、甲狀旁腺功能亢進(jìn)或減退的測定。2020/11/441降鈣素（CT）和甲狀旁腺激素（PTH）CT及PTH參與鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制：當(dāng)血鈣降低時，PTH分泌增加，作用于骨促進(jìn)溶骨，鈣自骨釋出，同時作用于腎使腎小管對鈣回吸增多。血鈣上升則刺激甲狀腺分泌CT抑制骨鈣釋放，同時促進(jìn)腎小球?qū)︹}的排出。CT和PTH的分泌功能彼此成反饋關(guān)系，機(jī)體通過它們互相拮抗作用維持代謝的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。降鈣素和甲狀旁腺激素對鈣代謝的調(diào)節(jié)不僅取決于它們在血中含量的絕對值，更重要是它們的比值。因此測定它們的比值對內(nèi)分泌代謝病研究很有價值。2020/11/442骨鈣素（OC）骨鈣素由成骨細(xì)胞合成，在合成過程中不斷有少量骨鈣素釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，骨鈣素的水平直接反映骨骼生成狀況，其檢測可以幫助評價骨骼更新程度，高水平的骨鈣素與骨代謝病相關(guān)。整分子骨鈣素放免藥盒（intactOCIRMAkit）可以用于軟骨病、Paget骨病、甲狀腺功能亢進(jìn)、腎性營養(yǎng)不良、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的檢測。2020/11/443四腫瘤甲胎蛋白（AFP）甲胎蛋白作為一種腫瘤特異性抗原，對早期診斷原發(fā)性肝癌具有較高靈敏性和特異性。陽性率在60%~85%。癌胚抗原（CEA）癌胚抗原首先是從結(jié)腸癌和胚胎組織中提取的一種腫瘤相關(guān)抗原，癌胚抗原升高和消化道腫瘤密切相關(guān)。胃癌患者陽性率可高達(dá)50%以上。2020/11/444糖類抗原（carbohydrateantigen，CA）CA50——胰腺癌、肝癌、結(jié)、直腸癌、卵巢癌、子宮癌、胃癌、肺癌、食道癌。CA19-9——對胰腺癌和膽囊癌診斷有較高特異性，陽性率＞80%，絕對值升高明顯。CA125——非粘液性卵巢癌診斷特異性強(qiáng)。CYFRA21-1——肺癌的診斷和療效觀察。2020/11/445五心血管疾病內(nèi)皮素（