第四章第二節(jié)分光光度計的操作與使用

第四章第二節(jié)分光光度計的操作與使用第一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五可見分光光度法

可見分光光度法是利用測量有色物質對某一單色光的吸收程度來進行測定的?？梢姺止夤舛扔嬛饕考庠磫紊鳂悠肥覚z測器顯示第二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五1．光源：2．單色器：包括狹縫、準直鏡、色散元件棱鏡——對不同波長的光折射率不同色散元件分出光波長不等距光柵——衍射和干涉分出光波長等距鎢燈或鹵鎢燈——可見光源350~1000nm氫燈或氘燈——紫外光源200~360nm第三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五3．吸收池：玻璃——能吸收UV光，僅適用于可見光區(qū)石英——不能吸收紫外光，適用于紫外和可見光區(qū)要求：匹配性（對光的吸收和反射應一致）4．檢測器：將光信號轉變?yōu)殡娦盘柕难b置5．記錄裝置：訊號處理和顯示系統(tǒng)光電池光電管光電倍增管二極管陣列檢測器第四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五

可見分光光度法

一、顯色反應及顯色條件的選擇

1.顯色反應將試樣中被測組分轉化成有色化合物的反應。第五頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五2.顯色劑在顯色反應中與被測組分生成有色化合物的試劑。無機顯色劑：硫氰酸鹽、鉬酸銨、過氧化氫、氨水等。有機顯色劑：如磺基水楊酸、鄰菲羅啉、結晶紫、孔雀綠等；第六頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五3、選擇顯色反應時應考慮的因素：1）靈敏度高2）選擇性高3）生成物穩(wěn)定4）顯色劑在測定波長處無明顯吸收，與有色物最大吸收波長之差（對比度），應滿足

>60nm。第七頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五4、顯色條件的選擇（1）顯色劑用量：固定待測組分的濃度和其他條件只改變顯色劑濃度測定吸光度。做A-顯色劑劑用量cR的關系曲線如圖。選擇曲線變化平坦處作為顯色條件。（2）溶液的pH值固定待測組分的濃度和其他條件只改變溶液的pH值測定吸光度。做A-pH曲線，選擇曲線中吸光度較大且恒定的平坦區(qū)所對應的pH范圍。吸光度與顯色劑用量關系曲線cRcRcRAAA第八頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五（3）顯色溫度固定待測組分的濃度和其他條件只改變反應溫度，測定吸光度。做A-T曲線，選擇曲線中吸光度較大且恒定的平坦區(qū)所對應的溫度范圍。（4）顯色時間及穩(wěn)定時間固定待測組分的濃度和其他條件只改變反應的時間，測定吸光度。做A-t曲線，選擇曲線中吸光度較大且恒定的平坦區(qū)所對應的時間范圍。pHA圖12-9吸光度與pH關系曲線第九頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五（5）、干擾的消除1.加入掩蔽劑選擇掩蔽劑的原則是：掩蔽劑不與待測組分反應；掩蔽劑本身及掩蔽劑與干擾組分的反應產物不干擾待測組分的測定。例：測定Ti4＋，加入H3PO4掩蔽劑使Fe3+(黃色)成為［Fe(PO４)2］3-(無色)，消除Fe3+的干擾。2.分離干擾離子采用適當?shù)姆蛛x方法預先除去干擾物質。第十頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五3.選擇適當?shù)娘@色反應條件

通過控制適宜的顯色條件，消除干擾組分的影響。4.選擇適宜的波長避開干擾物的最大吸收，配制適當?shù)膮⒈纫?，消除干擾組分的影響。5.提高顯色反應的選擇性利用被測物能形成三元絡合物的特點，提高顯色反應的選擇性。第十一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五三、吸光度測定條件的選擇1.選擇適當?shù)娜肷洳ㄩL一般應該選擇λmax為入射光波長。但如果λmax處有共存組分干擾時，則應考慮選擇靈敏度稍低但能避免干擾的入射光波長。

吸光度測定條件的選擇曲線A為鈷絡合物的吸收曲線曲線B為顯色劑的吸收曲線第十二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五2.選擇適當?shù)膮⒈热芤?/p>

注：采用空白對比消除因溶劑和容器的吸收、光的散射和界面反射等因素對透光率的干擾。第十三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五參比溶液的選擇一般遵循以下原則：溶液代號在測定波長處有無吸收試液1無無干擾有干擾有顯色劑2無有無有其它所加試劑3無有無有（或無）參比溶液2+3或（水)2+31(1+掩蔽)后+2+3第十四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五3.控制適宜的吸光度讀數(shù)范圍選A=0.2~0.8第十五頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五

1.當光從一種介質傳播到另一種介質中時，下列（）保持不變。A.波長

C.速度

B.頻率

D.方向

很遺憾，您答錯了答對了！點此進入下一題很遺憾，您答錯了很遺憾，您答錯了課堂練習第十六頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五

2.光的粒子性表現(xiàn)在下述（）性質上。B.頻率

A.能量

C.波長

D.波數(shù)很遺憾，您答錯了答對了！點此進入下一題很遺憾，您答錯了很遺憾，您答錯了課堂練習第十七頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五

3.下列（）光譜屬于分子吸收光譜。B.分子磷光光譜A.分子熒光光譜D.紫外-可見光譜C.分子化學光譜很遺憾，您答錯了答對了！點此進入下一題很遺憾，您答錯了很遺憾，您答錯了課堂練習第十八頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五4.紫外-可見光譜的產生是由于分子在吸收紫外-可見光后，發(fā)生（）類型的躍遷。A.振動能級躍遷B.轉動能級躍遷

C.電子能級躍遷

D.以上答案都不是

很遺憾，您答錯了答對了！點此進入下一題很遺憾，您答錯了很遺憾，您答錯了課堂練習第十九頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五1．朗伯-比耳定律的物理意義是什么？寫出其數(shù)學表達式。2．什么是吸收曲線？什么是標準曲線？它們有何實際意義？3．顯色反應如何選擇？4．吸光度測量條件如何選擇？5．光度分析法中，參比溶液應如何選擇？答案問答題第二十頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五1.答：當一束平行的單色光通過液層厚度為b的有色溶液時，溶液的吸光度A與液層的厚度b和溶液的濃度c成正比。即A=lg(I0/I)=εbc第二十一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五3.答：以入射光波長作橫坐標，用分光光度計測量每一波長下物質對光的吸光度作縱坐標所繪制的曲線，稱為吸收曲線。其作用是：選擇入射光波長，在此波長下測量吸光度，則分析的靈敏度最高。因此，吸收曲線是吸光光度法中選擇測定波長的重要依據。在某特定波長下，用分光光度計測量一系列不同濃度的標準溶液的吸光度，然后以濃度為橫坐標，對應的吸光度值為縱坐標所繪制的曲線，稱為標準曲線（亦稱工作曲線）。它是作為待測物質定量分析的依據。如果在相同條件下測得待測試液的吸光度值，從標準曲線上就可查得待測試液的濃度，這就是標準曲線法。第二十二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五4.答：顯色反應的選擇原則是：（1）選擇生成的有色物質（MR）的ε較大的顯色反應；（2）顯色劑（R）在測定波長處無吸收

，即ε盡可能小；（3）反應生成的有色物質（MR）的組成要恒定，化學性質穩(wěn)定。5.答：吸光度測量條件包括三個主要方面：

（1）入射光波長的選擇：

入射光的波長應根據吸收曲線選擇λmax為宜。因在此波長處ε值最大，使測定具有較高的靈敏度。（2）參比溶液的選擇：

在吸光度的測量中，由于比色皿的反射以及溶劑、試劑等對光的吸收，使得第二十三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五

測得的吸光度值不能真實地反映待測物質對光的吸收

，也就不能真實地反映待測物質的濃度。為了校正上述影響需要正確選擇參比溶液。通過調節(jié)儀器使參比溶液的吸光度為零（A=0）,或透光度T=100%。借此消除上述影響。

（3）吸光度讀數(shù)范圍的選擇

吸光度值太大或太小時，讀數(shù)波動所引起的吸光度讀數(shù)誤差較大，為了減小讀數(shù)誤差，應使測量的吸光度值控制在A=0.15～1.0（或透光度T在75%～10%）范圍之內?？梢圆捎靡韵麓胧海╝）控制溶液的濃度，如改變試樣的稱量，或改變溶液的稀釋度等；（b）選擇不同厚度的比色皿，以改變光程的長度。第二十四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五6.答：參比溶液的選擇原則如下：

（1）若僅待測物（M）與顯色劑（R）的反應產物（MR）有吸收，可用蒸餾水作參比溶液。（2）若待測物（M）無吸收

，而顯色劑（R）或其它試劑（R′）有吸收

，則用不加試樣的空白溶液作參比溶液。

（3）若試樣中的其它組分有吸收（待測物M之外的組分，如N），但不與顯色劑反應，當顯色劑無吸收時，可用試樣溶液作參比溶液；當顯色劑有吸收時，可在試液中加入適當掩蔽劑將待測組分掩蔽后再加顯色劑，以此溶液作參比溶液。

總之，選擇參比溶液的原則是：應使測得的試液的吸光度能真正反映待測物的濃度。第二十五頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五紫外-可見分光光度法的應用定性分析定量分析應用光譜對照特征數(shù)據比較吸光度比值的比較單一組分的測定多組分的測定第二十六頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五吸光系數(shù)吸光系數(shù)k的物理意義為：液層厚度為1cm的單位濃度溶液的吸光度，它表示物質對特定波長光的吸收能力。一個物質在一定條件下的吸光系數(shù)為定值。通常有兩種表示方法：

摩爾吸光系數(shù)ε

吸光系數(shù)

吸光系數(shù)k

第二十七頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五物理意義是指樣品濃度為1mol·L-1的溶液置于1cm樣品池中，在一定波長下測得的吸光度值。量綱為L·mol-1·cm-1

。ε104102中強吸收弱吸收強吸收（一）摩爾吸光系數(shù)ε第二十八頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五（二）吸光系數(shù)a物理意義是指溶液濃度在1g/L，液層厚度為1cm時，在一定波長下的吸光度值。量綱為L·g-1·cm-1。

吸光系數(shù)和摩爾吸光系數(shù)有如下關系：

a

=ε/M（M為摩爾質量）第二十九頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五例4-1用氯霉素（分子量為323.15）純品配制100mL含2.00mg的溶液，使用1.00cm的吸收池，在波長為278nm處測得其透射率為24.3%，試計算氯霉素在278nm波長處的摩爾吸光系數(shù)和比吸光系數(shù)。解：已知λ=278nmM=323.15g/mol

c=2.00×10-2

T=24.3%

（三）、吸光系數(shù)第三十頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五(四)、吸收光譜

第三十一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五不同濃度KMnO4溶液的吸收光譜（五）、吸收光譜第三十二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五一、定性分析

1.光譜對照同樣條件下測定待測物和標準物的吸收光譜，如果兩者吸收光譜一樣，可認為是同一物質。如無標準物，也可比較標準譜圖集里的光譜。第三十三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五

2.特征數(shù)據比較最大吸收波長λmax和吸光系數(shù)，是用于定性鑒別的主要光譜數(shù)據。

3.吸光度比值的比較

有些物質的光譜上有幾個吸收峰，可在不同的吸收峰（谷）處測得吸光度的比值作為鑒別的依據。

一、定性分析第三十四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五二、定量分析定量分析的依據是

1.單一組分的測定（1）吸光系數(shù)法查得吸光系數(shù)后根據吸光度求得樣品濃度

第三十五頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五例4-5已知維生素B12在361nm處的吸光系數(shù)為20.7。精密稱取樣品30.0mg，加水溶解后稀釋至1000mL，在該波長處用1.00cm吸收池測定溶液的吸光度為0.618，計算樣品溶液中維生素B12的質量分數(shù)。解：已知A=0.618a=20.7l=1.00cm由A=alc樣品中維生素B12含量為

二、定量分析第三十六頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五

1.單一組分的測定（2）標準比對法相同條件下，分別配制待測溶液X和標準溶液S，并分別測定吸光度。根據郎伯-比爾定律，可寫出二、定量分析第三十七頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五例4-6為測定維生素B12原料藥含量，準確稱取試樣25.0mg，用蒸餾水溶解后，定量轉移至1000ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度后，搖勻。另稱取同樣重量的B12標準品，用蒸餾水溶解后，稀釋至1000ml，搖勻。在361nm波長處，用1cm比色皿分別測得樣品溶液和標準品溶液的吸光度分別為0.512和0.518。求試樣中B12的百分含量。解：已知Ax

=0.512As

=0.518兩溶液配制、稀釋方法一致二、定量分析第三十八頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五

1.單一組分的測定（3）標準曲線法用標準曲線法測鐵的濃度為例：①配一系列濃度的標準鐵溶液，依次測定吸光度②作c-A圖，即標準曲線三磺基水楊酸合鐵配合物波長420nm③將待測溶液吸光度AX代入標準曲線，讀出濃度二、定量分析第三十九頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五

2.多組分的測定當溶液內有兩個及以上組分并需測得各自含量時，就是多組分的測定。（1）吸收光譜互不重疊（2）吸收光譜部分重疊（3）吸收光譜相互重疊二、定量分析第四十頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五

2.多組分的測定（1）吸收光譜互不重疊此種情況下可以按單組分測定的方法分別求得各個組分濃度二、定量分析第四十一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五

2.多組分的測定（2）吸收光譜部分重疊例如右圖，可先在無干擾處λ2求得a的濃度，再求得b的濃度

依次求得a和b的濃度λ2處：λ1處：二、定量分析第四十二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五

2.多組分的測定（3）吸收光譜相互重疊解方程組法,如右圖λ1處：λ2處：12解方程組可得：二、定量分析第四十三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五2.多組分的測定（3）吸收光譜相互重疊等吸收雙波長消去法例如右圖，選取兩個波長，a物質在這兩波長處的吸光度相同λ1處：λ2處：二、定量分析第四十四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五2.多組分的測定

λ1處：λ2處：兩式相減，得：在這兩個波長處兩組分總的吸光度的差值(⊿A)只和其中一個組分的濃度有關，可以依次求出各組分濃度。二、定量分析第四十五頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五

1.指出下列哪種是紫外-可見分光光度計常用的光源？()

B.激光器

A.硅碳棒

D.鹵鎢燈

C.空心陰極燈

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2.在一定波長處，用2.0cm吸收池測得某樣品溶液的百分比透光率為71%，若改用3.0cm吸收池時，該溶液的吸光度A為（）

A=-LgT=0.15A.0.10

B.0.37

C.0.22

D.0.45

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4.

測定一系列濃度相近的樣品溶液時，常選擇的測定方法為（）B.標準對比法

A.標準曲線法

C.絕對法

D.解方程計算

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5.

在分光光度法中，運用朗伯－比爾定律進行定量分析采用的入射光為（）A.白光C.可見光B.單色光

D.紫外光很遺憾，您答錯了答對了！點此進入下一題很遺憾，您答錯了很遺憾，您答錯了課堂練習第五十頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五

6.許多化合物的吸收曲線表明，它們的最大吸收常常位于200─400nm之間，對這一光譜區(qū)應選用的光源為()

B.能斯特燈

A.氘燈或氫燈

C.鎢燈

D.空心陰極燈燈

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7.雙波長分光光度計和單波長分光光度計的主要區(qū)別是（）B.單色器的個數(shù)A.光源的個數(shù)D.單色器和吸收池的個數(shù)C.吸收池的個數(shù)很遺憾，您答錯了答對了！點此進入下一題很遺憾，您答錯了很遺憾，您答錯了課堂練習第五十二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五

8.符合朗伯-比爾定律的有色溶液稀釋時，其最大吸收峰的波長位置（）A.向長波方向移動

B.向短波方向移動

C.不移動，但最大吸收峰強度降低

D.不移動，但最大吸收峰強度增大

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