分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與常見問題解答

RNA提取原理與注意事項(xiàng)PCR原理與常見問題Real-timePCR介紹內(nèi)容本文檔共51頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分商品化提取試劑盒原理：

異硫氰酸胍（GIT）-酚法

GIT與十二烷基肌氨酸鈉（Sarcosyl）作用使蛋白質(zhì)變性，從而釋放RNA；GIT與β－巰基乙醇共同作用抑制RNase的活性；一定條件下（各家試劑條件不同），RNA不溶于乙醇，而DNA和蛋白質(zhì)溶于乙醇溶液，通過濾柱時(shí)，RNA掛柱，DNA和蛋白質(zhì)溶于濾液；在逐步洗脫的過程中，RNA不斷被純化；最后用水洗脫。本文檔共51頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分杜絕外源酶的污染：嚴(yán)格戴好帽子，口罩，手套。實(shí)驗(yàn)所涉及的離心管，Tip頭，移液器桿，電泳槽，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面等要徹底處理。實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保RNase-Free。RNA提取的注意事項(xiàng)（外界環(huán)境中多含Rnase，且RNA極不穩(wěn)定）RNasefreeDNasefree本文檔共51頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分阻止內(nèi)源酶的活性：

選擇合適的勻漿方法。選擇合適的裂解液?？刂坪脴悠返钠鹗剂?。本文檔共51頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分RNA提取原理與注意事項(xiàng)PCR原理與常見問題Real-timePCR本文檔共51頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分PCR技術(shù)的基本原理模板DNA的變性：93℃-95℃左右，模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：Ta=Tm-3~5℃引物的延伸：TaqDNA聚合酶之5’-3’DNA聚合酶活性變性--退火--延伸三個(gè)步驟

本文檔共51頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分引物的復(fù)性溫度

通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）＋2（A+T）復(fù)性溫度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合本文檔共51頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍本文檔共51頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分模板DNA95℃本文檔共51頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物本文檔共51頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶本文檔共51頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束第2輪開始本文檔共51頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq本文檔共51頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束本文檔共51頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

本文檔共51頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系（100ul體系）10×擴(kuò)增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul本文檔共51頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分PCR反應(yīng)五要素模板（template）引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）Mg2+（magnesium）本文檔共51頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。本文檔共51頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分（2）引物濃度0.1-0.5mol/L濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶0.5-2.5U/50l酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。本文檔共51頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分（4）dNTPdNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。本文檔共51頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。本文檔共51頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分EB染色原理：

EB插入DNA堿基對(duì)之間的結(jié)合本文檔共51頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分PCR常見問題無擴(kuò)增產(chǎn)物非特異性擴(kuò)增拖尾假陽性本文檔共51頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分無擴(kuò)增產(chǎn)物現(xiàn)象：陽對(duì)照有條帶，而樣品則無M樣品A樣品B陽性對(duì)照本文檔共51頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分純度：含有抑制物濃度：含量低質(zhì)量：RNA被降解操作：體系配制有誤，模板加入有誤

原因純化模板或者使用優(yōu)質(zhì)試劑盒提取模板RNA加大模板的用量重新提取RNA，并做好無Rnase前處理重新配置擴(kuò)增體系，重新PCR對(duì)策本文檔共51頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分

非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。本文檔共51頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多

原因重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)減少酶量降低鎂離子濃度適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)對(duì)策本文檔共51頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。

M12本文檔共51頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分模板不純Buffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多

原因純化模板更換Buffer適當(dāng)提高退火溫度適量用酶適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度減少循環(huán)次數(shù)對(duì)策本文檔共51頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染

原因開管輕柔，防止形成氣溶膠；防止靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外更換試劑、耗材試劑分裝，貯存適當(dāng)。更換實(shí)驗(yàn)室和所有試劑耗材。假陽性現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)策本文檔共51頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分PCR中應(yīng)注意的事項(xiàng)（一）防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作（二）設(shè)立對(duì)照：陽性對(duì)照：陽性模板陰性對(duì)照：陰性模板試劑對(duì)照：除模板外的所有組分本文檔共51頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分Real-timePCR技術(shù)介紹本文檔共51頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法本文檔共51頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)原理常規(guī)PCR技術(shù)：

對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析本文檔共51頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理定量原理介紹三個(gè)概念：擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值如何對(duì)起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析本文檔共51頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-----------擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線圖：橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集熒光基團(tuán)熒光檢測(cè)元件本文檔共51頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------熒光閾值熒光信號(hào)閾值（threshold）：

前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過域值本文檔共51頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定義：

PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t)value本文檔共51頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------Ct值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量相同模板在同一臺(tái)PCR儀上相同條件下重復(fù)96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖終點(diǎn)處檢測(cè)產(chǎn)物量不恒定，誤差大；Ct值則極具重現(xiàn)性起點(diǎn)量是樣本中原來的DNA量，更有意義；終點(diǎn)量經(jīng)過PCR放大，并非研究所期望的數(shù)據(jù)本文檔共51頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分非特異性熒光標(biāo)記：1、SYBRGreenⅠ特異性熒光標(biāo)記：2、TaqMan3、MolecularBeacon實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹

本文檔共51頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分－SYBRGreenⅠ法本文檔共51頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分SYBRGreenⅠ法SYBRGreenⅠ能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreenⅠ只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無熒光復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA，SYBRGreenⅠ發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號(hào)（一般設(shè)置在復(fù)性階段）。SYBRGreen本文檔共51頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation本文檔共51頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析溫度熒光強(qiáng)度TmTm值：DNA解鏈一半時(shí)的溫度本文檔共51頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分--TaqMan法本文檔共51頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期二\10點(diǎn)31分與目標(biāo)序列互補(bǔ)TaqMan---水解型雜交探針

5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)探針完整，