分子生物學(xué)第3章可移動的遺傳因子張敏

第三章

可移動的遺傳因子(轉(zhuǎn)座子)和染色體外遺傳因子BarbaraMcClintock1902-1992本文檔共115頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\2點2分DNAtransposableelement本文檔共115頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\2點2分Emerson(1914)在研究玉米果皮色素遺傳時，發(fā)現(xiàn)一種特殊的突變類型：花斑果皮，產(chǎn)生寬窄不同，紅白相間的花斑花斑條紋不穩(wěn)定，可以發(fā)生多次回復(fù)突變，但不知道原因。一、轉(zhuǎn)座因子的發(fā)現(xiàn)和鑒定本文檔共115頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\2點2分

20世紀40年代初，McClintock開始研究玉米植株和糊粉層色素產(chǎn)生的遺傳基礎(chǔ)，她發(fā)現(xiàn)，色素的變化與一系列染色體重組有關(guān)。她觀察到，染色體的斷裂或解離(dissociation)有一個特定的位點，命名為Ds。但Ds不能自行斷裂，受一個激活因子Ac(activator)所控制。Ac可以象普通基因一樣遺傳。但有時可以離開原來的座位，移動到同一染色體的另一個位置上，也可以移動到不同染色體上。本文檔共115頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\2點2分若玉米帶有野生型C基因，則胚乳呈紫色；C基因的突變阻斷了紫色素的合成，那么胚乳呈白色。在胚乳發(fā)育的過程中，突變發(fā)生回復(fù)導(dǎo)致斑點的產(chǎn)生?；貜?fù)突變發(fā)生在早期發(fā)育階段，紫斑就比較大。McClintock推測原來的C突變（無色素）是由一個“可移動的控制因子”引起的，稱解離因子（dissociator，Ds），它可以插入到C基因中（即轉(zhuǎn)座）。另一個可移動的控制因子是激活因子（activator，Ac），它的存在可激活Ds轉(zhuǎn)座，進入C基因或其他基因，也能使Ds從基因中轉(zhuǎn)出，使突變基因產(chǎn)生“回復(fù)突變”，這就是Ac-Ds系統(tǒng)本文檔共115頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\2點2分紫色胚乳無色胚乳紫色斑點胚乳激活Ds轉(zhuǎn)座Ds可轉(zhuǎn)座到C基因正常的C基因表達產(chǎn)生紫色色素被插入失活的C基因在胚發(fā)育時激活Ds，使其從C基因中轉(zhuǎn)座出來突變的c基因正常的C基因突變的c基因回復(fù)成為正常的C基因）本文檔共115頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\2點2分DNAtransposableelement本文檔共115頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\2點2分本章內(nèi)容一、轉(zhuǎn)座子1.分類2.轉(zhuǎn)座機制3.轉(zhuǎn)座的遺傳效應(yīng)二、質(zhì)粒1.質(zhì)粒遺傳學(xué)類型質(zhì)粒DNA特性特殊細菌質(zhì)粒三、遺傳重組1.同源重組2.位點特異性重組3.等位基因間重組本文檔共115頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\2點2分概述在原核生物和真核生物基因組中存在著可以從一個部位轉(zhuǎn)移到另一個部位的一些序列，這些序列稱為轉(zhuǎn)座子。存在病毒、細菌和真核細胞的質(zhì)?；蚧蚪M中。轉(zhuǎn)座子transposon也稱跳躍基因jumpinggene第一節(jié)轉(zhuǎn)座子SectionItransposon

本文檔共115頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\2點2分一、轉(zhuǎn)座子的分類和結(jié)構(gòu)特征轉(zhuǎn)座子的共同特點：①兩端有ITR；②轉(zhuǎn)座后靶位點重復(fù)是正向重復(fù)；③編碼與轉(zhuǎn)座有關(guān)的蛋白質(zhì)；④可在基因組中移動。本文檔共115頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\2點2分1.插入序列（IS）: IS家族的結(jié)構(gòu)：①兩端都有短的正向重復(fù)序列（directrepeats,DR），②略長的反向重復(fù)序列（invertedrepeats，IR）以及1kb左右的編碼區(qū)，③它僅編碼和轉(zhuǎn)座有關(guān)的轉(zhuǎn)座酶。 對靶的選擇有三種形式：隨機選擇，熱點選擇和特異位點的選擇。 TSTransposasegeneTSIRIR本文檔共115頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\2點2分本文檔共115頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\2點2分插入序列（insertionsequence，IS）

在染色體和質(zhì)粒（包括F因子）中，都含有這類較小的轉(zhuǎn)座子，長度為750～1500bp，只帶有與其轉(zhuǎn)座作用相關(guān)的基因。本文檔共115頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\2點2分

本文檔共115頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\2點2分本文檔共115頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\2點2分

2.復(fù)合轉(zhuǎn)座子（compositetranaposon）復(fù)合轉(zhuǎn)座子含有一個中心區(qū)域和位于兩側(cè)的臂arm除了和自身轉(zhuǎn)座有關(guān)的基因外，中心序列含有抗藥性基因等遺傳信息。復(fù)合轉(zhuǎn)座子兩端的臂由IS序列組成。有的二側(cè)組件相同（如Tn903），有的不同（如Tn10）。有的方向相同（如Tn9），有的方向相反（如Tn903，10，5）。有的皆有功能（如Tn903，10），有的僅右側(cè)組件有功能。本文檔共115頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\2點2分

由耐藥基因和兩個相同的IS序列組成復(fù)合轉(zhuǎn)座子構(gòu)型(倒轉(zhuǎn)重復(fù)或正向重復(fù))。倒轉(zhuǎn)重復(fù)正向重復(fù)IS1IS1IS1IS1抗生素抗性基因本文檔共115頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\2點2分本文檔共115頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\2點2分3.TnA家族TnA是復(fù)制型轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座子。長約5kb左右，中部的編碼區(qū)不僅編碼抗性基因，還編碼轉(zhuǎn)座酶和解離酶。兩端具有末端反向重復(fù)序列，而不是IS，長約38bp左右，任一個缺失都會阻止轉(zhuǎn)座。靶位點具有5bp的正向重復(fù)序列。TnA家族都帶有抗性標記本文檔共115頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023

20本文檔共115頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023

21它是一種溶菌和溶源周期性交替方式生成的噬菌體，可誘發(fā)大腸桿菌突變。如Mu噬菌體。侵入的Mu可在溶源化過程插入寄主DNA任意部位，造成靶點倍生，原噬菌體兩側(cè)各有一個5bp的靶點重復(fù)序列4.轉(zhuǎn)座噬菌體

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22Mu噬菌體的右末端由3kb組成的G片段（可倒轉(zhuǎn)片段）在不同的噬菌體的DNA取向不同。G（+）時，基因S和U表達，產(chǎn)物使之能夠吸附大腸桿菌k12G(-)時，基因S’和U’表達，產(chǎn)物使之能夠吸附大腸桿菌CBar=50nanometers原噬菌體:prophage,整合入宿主DNA中的噬菌體G片段

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23真核生物轉(zhuǎn)座子（了解）真核細胞內(nèi)只要存在轉(zhuǎn)座酶，任何序列片段具有該酶識別的反向重復(fù)末端均可發(fā)生轉(zhuǎn)移最早發(fā)現(xiàn)的是玉米轉(zhuǎn)座子，稱為控制因子通常以非復(fù)制方式轉(zhuǎn)座本文檔共115頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\2點2分二、轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機制

所有的轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機制很相似，可以歸納為兩步反應(yīng)：

①轉(zhuǎn)座子本身的復(fù)制（非復(fù)制型轉(zhuǎn)座子沒有此步）；②靶序列的斷裂及倍生。本文檔共115頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023

25基因靶序列的斷裂及倍生.ATGCATACGT內(nèi)切酶在靶序列兩邊切出切口靶序列轉(zhuǎn)座子ATGCATACGT轉(zhuǎn)座子ATGCATACGT本文檔共115頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\2點2分1.復(fù)制型轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子復(fù)制轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)座子保留在原位點，另外一個拷貝插入到新位點。與轉(zhuǎn)座酶和解離酶相關(guān)。共聯(lián)體生成和解離，靶序列的切割與復(fù)制。二、轉(zhuǎn)座機制本文檔共115頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\2點2分2.非復(fù)制型轉(zhuǎn)座將供體DNA轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)各切斷一條單鏈并與靶序列的兩個游離末端連接，隨后并沒有復(fù)制過程，而是由轉(zhuǎn)座酶將供體DNA轉(zhuǎn)座因子的另一端也切斷，因此在供體DNA留下一個致死性缺口。轉(zhuǎn)座子的兩條游離單鏈在靶位點退火接合，DNA聚合酶填平缺口。3.保守型轉(zhuǎn)座：一種非復(fù)制型轉(zhuǎn)座，轉(zhuǎn)座子從供體位點上切下來然后插入靶位點，供體位點恢復(fù)原狀。這種機制不僅可以轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)座子本身，還可以將供體的DNA從一個細菌轉(zhuǎn)移到另外一個細菌。與λ噬菌體的整合過程相似。本文檔共115頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\2點2分本文檔共115頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\2點2分轉(zhuǎn)座子的復(fù)制過程質(zhì)粒A質(zhì)粒B質(zhì)粒A質(zhì)粒B細菌經(jīng)幾個世代轉(zhuǎn)座子本文檔共115頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\2點2分轉(zhuǎn)座中復(fù)制子融合為共同體A+B轉(zhuǎn)座子共和體本文檔共115頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\2點2分三、轉(zhuǎn)座作用的模型（Ⅰ）本文檔共115頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\2點2分轉(zhuǎn)座作用的模型（Ⅱ）本文檔共115頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\2點2分非復(fù)制型轉(zhuǎn)座需鏈的斷裂和重排

交叉結(jié)構(gòu)切斷后，釋放出來時發(fā)生非復(fù)制型轉(zhuǎn)座，它將轉(zhuǎn)座子插入到靶DNA，轉(zhuǎn)座子的兩側(cè)為正向重復(fù)序列，供體留下斷裂的雙鏈。轉(zhuǎn)座子不與靶DNA形成共同體。本文檔共115頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\2點2分Tn10轉(zhuǎn)座需要的酶和轉(zhuǎn)座頻率的控制轉(zhuǎn)座酶與轉(zhuǎn)座的頻率相關(guān)，且可能通過同時識別末端反向重復(fù)序列和靶序列才發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)座頻率對細胞和轉(zhuǎn)座子都十分重要。甲基化酶在GATC中6-0-G引入甲基，可以抑制轉(zhuǎn)座酶基因的轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)座酶與IS10R的結(jié)合。本文檔共115頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期三\2點2分多拷貝抑制定義：IS10R插入到多拷貝質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到細菌時，細菌染色體上的Tn10轉(zhuǎn)座率下降。機制：過量的OUTRNA確保在核糖體結(jié)合INRNA之前與INRNA互補配對，使其不能翻譯。本文檔共115頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期三\2點2分本文檔共115頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期三\2點2分順式偏愛性定義：只有編碼轉(zhuǎn)座酶的DNA模板存在時，IS10R開放讀碼框才會有效地轉(zhuǎn)錄并翻譯轉(zhuǎn)座酶。是IS編碼轉(zhuǎn)座酶的普遍現(xiàn)象。機制：一、蛋白質(zhì)合成后（甚至在翻譯過程中），轉(zhuǎn)座酶與DNA緊密結(jié)合，以至于轉(zhuǎn)座酶不可能會分散的別處。二、轉(zhuǎn)座酶未與DNA結(jié)合時，可能不穩(wěn)定。本文檔共115頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期三\2點2分順式偏愛性和多拷貝抑制是Tn10的拷貝增加了但有不引起轉(zhuǎn)座頻率的增加，避免造成不應(yīng)有的損傷。本文檔共115頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期三\2點2分①轉(zhuǎn)座引起插入突變;IS、Tn和Mu噬菌體都可能引起插入突變。

插入位點若在一個順反子（cistron)的前端功能基因中，可能造成極性突變（移碼或終止密碼突變）。指減低蛋白質(zhì)合成速度的基因突變?nèi)?、轉(zhuǎn)座效應(yīng)本文檔共115頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期三\2點2分本文檔共115頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期三\2點2分②

造成插入位點靶DNA的少量堿基對重復(fù)

IS1、Tn10：造成9bp的重復(fù)。IS3：造成3或4bp的重復(fù)。IS4：造成11bp的重復(fù)。③

插入位點出現(xiàn)新基因

復(fù)合轉(zhuǎn)座子帶有抗性基因（如抗藥性基因ampc)，可產(chǎn)生兩方面效應(yīng)：一個基因的插入突變；出現(xiàn)抗藥基因。本文檔共115頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期三\2點2分④引起染色體畸變

在一個染色體上（甚至不同染色體上）若有同一轉(zhuǎn)座子的兩個拷貝，其提供的相同重組位點，可導(dǎo)致缺失、倒位、插入。方向相同：產(chǎn)生缺失。方向相反：發(fā)生倒位。本文檔共115頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期三\2點2分本文檔共115頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期三\2點2分本文檔共115頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期三\2點2分通過轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的姐妹染色單體間的染色體內(nèi)異位交換

本文檔共115頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期三\2點2分⑥切除效應(yīng)

指轉(zhuǎn)座子從原來位置上消失。

準確切除：使原插入發(fā)生回復(fù)突變。

不準確切除：留下轉(zhuǎn)座子殘跡，產(chǎn)生插入突變，但

轉(zhuǎn)座子標志消失。本文檔共115頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期三\2點2分轉(zhuǎn)座子切離所造成的序列變異本文檔共115頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期三\2點2分

⑦外顯子改組當(dāng)兩個近似的轉(zhuǎn)座子被同一轉(zhuǎn)座酶識別而整合到染色體的鄰近位置時，則位于它們之間的序列有可能被轉(zhuǎn)座酶作用而轉(zhuǎn)座，如果這DNA序列中含有外顯子，則被切離并可能插入另一基因中，這種效應(yīng)稱為外顯子改組(exonshuffling)(圖)。外顯子改組將導(dǎo)致基因組中新基因的產(chǎn)生。

本文檔共115頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期三\2點2分雙轉(zhuǎn)座子插入所引起的外顯子改組示意圖

本文檔共115頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期三\2點2分（1）可使原來相距較遠的基因組合在一起，形成一個操縱子。

（2）把原來兩段分離的DNA序列連在一起，產(chǎn)生一個新蛋白。（3）啟動子部位的插入可使基因打開或關(guān)閉。（4）過多轉(zhuǎn)座（頻率過高）對細胞不利，細胞在長期進化中形成了一些不利于轉(zhuǎn)座的代謝途徑，可與轉(zhuǎn)座過程平衡。

（5）轉(zhuǎn)座基因插入時，大多數(shù)受體基因均被鈍化，但也有基因被激活。（這是因為轉(zhuǎn)座子有自己的啟動子，在使轉(zhuǎn)位酶轉(zhuǎn)錄的同時，也可使相鄰基因轉(zhuǎn)錄）。轉(zhuǎn)座子效應(yīng)的意義本文檔共115頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期三\2點2分

2.轉(zhuǎn)座子作為研究工具1）基因傳遞載體；2）結(jié)構(gòu)重組3）基因突變4）基因表達5）克隆6）基因作圖本文檔共115頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期三\2點2分四、逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子

逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是真核生物轉(zhuǎn)座子的重要類型，以RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座只發(fā)現(xiàn)在真核生物中，它是由逆轉(zhuǎn)錄病毒以其RNA的基因組的DNA拷貝序列插入到宿主細胞的染色體中而產(chǎn)生。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是宿主DNA基因組的組分，可在基因組內(nèi)轉(zhuǎn)座，它在插入位點上產(chǎn)生正向重復(fù)短序列。本文檔共115頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期三\2點2分本文檔共115頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期三\2點2分

1.逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組與逆轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)本文檔共115頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期三\2點2分逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與逆轉(zhuǎn)錄病毒相似，但是env基因通常被破壞。本文檔共115頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期三\2點2分

2.逆轉(zhuǎn)錄病毒與轉(zhuǎn)座結(jié)果有：1）原病毒像溶源性噬菌體DNA，成為宿主基因組的一部分；2）細胞DNA序列可能與病毒序列重組，并經(jīng)過轉(zhuǎn)座作用插入性位點而改變細胞的性質(zhì)。本文檔共115頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期三\2點2分第二節(jié)質(zhì)粒（plasmid）概述

質(zhì)粒為多數(shù)細菌和某些真核生物細胞的染色體外的雙鏈環(huán)狀DNA分子。它的大小范圍從1kb至200kb以上不等。本文檔共115頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期三\2點2分1.F質(zhì)粒（Fplasmid）為性質(zhì)粒；一、質(zhì)粒的遺傳學(xué)類型2.R質(zhì)粒（Rplasmid）為耐藥性質(zhì)粒；3.Col質(zhì)粒（Colplasmid）含有合成大腸桿菌素（colicin）基因的質(zhì)粒；4.噬菌體質(zhì)粒（phagemid，噬粒）能把完整的質(zhì)粒引入某種噬菌體DNA成為嵌合體，其遺傳行為取決于某個復(fù)制子的強弱及是否受阻的情況本文檔共115頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期三\2點2分

二、質(zhì)粒的特性（一）質(zhì)粒的復(fù)制

質(zhì)粒DNA的復(fù)制由細菌染色體的多種酶系統(tǒng)來完成，不同的質(zhì)粒在宿主細胞內(nèi)采用的酶系統(tǒng)不同，在宿主細胞中復(fù)制程度有很大差別。

本文檔共115頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期三\2點2分

質(zhì)粒DNA在細菌中的復(fù)制類型有兩種：1.嚴謹型質(zhì)粒復(fù)制；2.松弛型質(zhì)粒復(fù)制。

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其復(fù)制的方式為半保留復(fù)制，并在復(fù)制周期內(nèi)保持環(huán)狀結(jié)構(gòu)；復(fù)制形式：單向復(fù)制、雙向復(fù)制和單雙向復(fù)制。本文檔共115頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期三\2點2分質(zhì)粒的復(fù)制主要是通過θ型復(fù)制和滾環(huán)復(fù)制兩種方式之一進行的，其中以θ型復(fù)制為主。在θ型復(fù)制中，有單向復(fù)制和雙向復(fù)制兩種類型。革蘭氏陰性細菌中多數(shù)質(zhì)粒是以θ型方式復(fù)制，R1、R100等是單向復(fù)制，F(xiàn)、R6k等是雙向復(fù)制類型。質(zhì)粒復(fù)制的方式

本文檔共115頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期三\2點2分質(zhì)粒滾環(huán)復(fù)制示意圖

在革蘭氏陽性細菌中大多數(shù)質(zhì)粒是以滾環(huán)方式復(fù)制。本文檔共115頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期三\2點2分（二）質(zhì)粒的不相容性

質(zhì)粒的不相容性是指不同的細菌質(zhì)粒不能在相同細胞中同時存在的現(xiàn)象。即當(dāng)某種質(zhì)粒在宿主細胞內(nèi)存在時，將阻止其他類質(zhì)粒進入細胞寄宿。不相容性是由于兩種質(zhì)粒中具有類似的阻遏物及質(zhì)粒DNA隨機復(fù)制所致結(jié)果。本文檔共115頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期三\2點2分

在自然條件下，許多質(zhì)粒都可通過細菌的接合作用將質(zhì)粒復(fù)制子轉(zhuǎn)移到新的宿主細菌內(nèi)，見右（三）質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性本文檔共115頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期三\2點2分

（四）質(zhì)粒的選擇性標記用于人工轉(zhuǎn)化、基因工程。常用的選擇性標記是抗生素抗性1、ampr：編碼β-內(nèi)酰胺酶

，可使氨芐青霉素的抗菌作用消失2、tetr：編碼399aa的膜結(jié)合蛋白，阻止四環(huán)素進入細菌內(nèi)。3、camr

：編碼四聚體細胞質(zhì)蛋白，該蛋白催化氯霉素羥乙酰氧基衍生物的生成，此產(chǎn)物不能與核糖體50S亞基結(jié)合。目前，實驗室中常用的質(zhì)粒載體有一個或兩個抗生素抗性基因。本文檔共115頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期三\2點2分三、特殊細菌質(zhì)粒（一）F質(zhì)粒--性質(zhì)粒F質(zhì)粒是一種環(huán)狀的DNA分子，分子量為94.5kb，F(xiàn)質(zhì)粒有整合進入細菌染色體而產(chǎn)生Hfr(highfrequencyofrecombination)細胞的能力。（二）R質(zhì)?！退幮再|(zhì)粒R質(zhì)粒是由抗性轉(zhuǎn)移因子(RTF)和r決定子兩個DNA片段組成的，其耐藥性使宿主對抗生素產(chǎn)生抗性，該耐藥性可以自我復(fù)制。本文檔共115頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期三\2點2分（三）Col質(zhì)?！竽c桿菌質(zhì)粒Col質(zhì)粒是能產(chǎn)生大腸桿菌素的大腸桿菌質(zhì)粒，它可抑制不含Col質(zhì)粒的細菌生長。Col質(zhì)粒中使用最多的是ColE1，常用于重組DNA研究和體外DNA復(fù)制系統(tǒng)。本文檔共115頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期三\2點2分四、真核生物中的質(zhì)粒在動物細胞中發(fā)現(xiàn)環(huán)狀DNA分子，它可能是質(zhì)粒，也可能是污染的病毒。在有性繁殖的高等生物細胞中，質(zhì)粒DNA是不能進行轉(zhuǎn)移的。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)單細胞真核生物酵母中有質(zhì)粒存在，如酵母中的2μm質(zhì)粒。2μm質(zhì)粒是一種很有用的載體，通過DNA重組技術(shù)，2μm質(zhì)?？蓪⑼庠椿蚩寺〗湍讣毎?。本文檔共115頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期三\2點2分真核生物的DNA質(zhì)粒

環(huán)狀DNA質(zhì)粒：酵母2mm質(zhì)粒，植物線立體中的環(huán)狀DNA質(zhì)粒，人和動物的核DNA質(zhì)粒等，它們都是不知其功能的隱蔽質(zhì)粒。線狀DNA質(zhì)粒：乳酸克魯維酵母的嗜殺線狀DNA質(zhì)粒，植物線粒體中與雄性不育有關(guān)的線狀DNA質(zhì)粒。本文檔共115頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期三\2點2分真核生物的RNA質(zhì)粒有殼體的dsRNA質(zhì)粒：由蛋白質(zhì)殼體包裹，存在于某些真菌和植物細胞中，由于它們酷似病毒，所以也常被稱作真菌病毒和植物隱蔽病毒，或稱類病毒顆粒，典型代表是釀酒酵母的嗜殺dsRNA質(zhì)粒。與RNA病毒的主要區(qū)別是它們不具有感染性．無殼體的dsRNA質(zhì)粒：存在于脂質(zhì)小囊中的栗疫菌減毒dsRNA質(zhì)粒，玉米線粒體中與雄性不育有關(guān)的dsRNA質(zhì)粒。本文檔共115頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期三\2點2分第三節(jié)遺傳重組

(geneticrecombination)

幾個概念：同源染色體，姊妹染色體，等位基因，單倍體，二倍體。本文檔共115頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期三\2點2分同源染色體同源染色體就是二倍體生物細胞核中，一條來自父方，一條來自母方，大小、形態(tài)結(jié)構(gòu)一般彼此相似，代謝和遺傳功能相似，在減數(shù)分裂過程中配對的一對染色體。(homologouschromosomes)

本文檔共115頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期三\2點2分姊妹染色體一條染色體有兩條染色單體，這兩條染色單體稱為姊妹染色體本文檔共115頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期三\2點2分等位基因

等位基因是指在體細胞內(nèi)位于同源染色體相同位置上的基因本文檔共115頁；當(dāng)前第75頁；編輯于星期三\2點2分單倍體(haploid)、二倍體(diploid)含有配子染色體數(shù)的生物稱單倍體(n)，它具有正常體細胞染色體數(shù)的一半。二倍體(2n)是指細胞含有兩組染色體的個體

本文檔共115頁；當(dāng)前第76頁；編輯于星期三\2點2分遺傳重組的含義

廣義：指任何產(chǎn)生新的基因組合，造成基因型變化的過程，包括獨立分配和交換。（減數(shù)分裂）

狹義：指涉及DNA分子內(nèi)的斷裂并重新連接而造成基因重新組合的過程，即基因交換。廣義和狹義本文檔共115頁；當(dāng)前第77頁；編輯于星期三\2點2分遺傳重組的類型1.同源重組（homologousrecombination）2.位點特異性重組（site-specificrecombination）3.轉(zhuǎn)座作用（transposition）4.異常重組（illegitimaterecombination）本文檔共115頁；當(dāng)前第78頁；編輯于星期三\2點2分

一、同源重組(homologousrecombination)1.同源重組的產(chǎn)生同源重組指發(fā)生DNA的同源序列之間，涉及的是大片段同源DNA序列的交換。2.同源重組的機制目前，大家比較公認的是Holliday模型。3.同源重組的主要途徑根據(jù)涉及的蛋白質(zhì)不同，在大腸桿菌的同源重組分為四種類型：RecBCD途徑、RecE

途徑、RecF途徑和Red途徑本文檔共115頁；當(dāng)前第79頁；編輯于星期三\2點2分本文檔共115頁；當(dāng)前第80頁；編輯于星期三\2點2分本文檔共115頁；當(dāng)前第81頁；編輯于星期三\2點2分本文檔共115頁；當(dāng)前第82頁；編輯于星期三\2點2分本文檔共115頁；當(dāng)前第83頁；編輯于星期三\2點2分遺傳重組的證明本文檔共115頁；當(dāng)前第84頁；編輯于星期三\2點2分二、位點特異性重組(sitespecificrecombination)概念指不依賴于DNA序列的同源性，而依賴于能與某些酶相結(jié)合的特異DNA序列間存在的基因重組；這些酶能催化特異的DNA鏈斷裂和重新連接，發(fā)動位點特異性重組。特點1）位點特異性重組是在某些特異DNA序列（位點）發(fā)生的重組；2）重組中DNA序列發(fā)生了重排。本文檔共115頁；當(dāng)前第85頁；編輯于星期三\2點2分例如：噬菌體的整合酶識別噬菌體DNA和宿主染色體的特異靶位點，而后發(fā)生的選擇性整合。本文檔共115頁；當(dāng)前第86頁；編輯于星期三\2點2分本文檔共115頁；當(dāng)前第87頁；編輯于星期三\2點2分

通過attP和attB間的相互重組，環(huán)狀的噬菌體DNA轉(zhuǎn)換為整合的原噬菌體，原噬菌體通過attL和attR間的相互重組而切除本文檔共115頁；當(dāng)前第88頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023

89(二)抗體VDJ重排

利根川進揭示了抗體基因重排機制，獲1987年Nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎3-D結(jié)構(gòu)本文檔共115頁；當(dāng)前第89頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023

90抗體背景知識針對上百萬或上億萬的外來抗原，人體免疫細胞能產(chǎn)生相應(yīng)于每種抗原的抗體，按照一個基因一條多肽連的說法是否說人類細胞有如此多的抗體基因呢？本文檔共115頁；當(dāng)前第90頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023

91IgGIgAIgMIgDIgE人體含量最多的抗體尤其存在于對抗微生物及其毒素的細胞外液人體上皮黏液漿液性分泌物中的主要抗體IgM是最早出現(xiàn)的免疫球蛋白,是抵御細菌的第一道防線主要表達在淋巴細胞表面體表保護性抗體，早期抗微生物抗體，與變態(tài)反應(yīng)癥狀密切相關(guān)各類免疫球蛋白的生物學(xué)的生物學(xué)特征本文檔共115頁；當(dāng)前第91頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023

92基因工程抗體藥物本文檔共115頁；當(dāng)前第92頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023抗體(antibody),又叫免疫球蛋白(Immunoglobulin),由四條鏈組成：兩條重鏈，兩條輕鏈.輕鏈有兩種:λ鏈和κ鏈抗體與外來抗原結(jié)合位點稱為可變區(qū)（V區(qū)），決定抗體特異性和多樣性.其他部分稱為恒定區(qū)（C區(qū)），對同一類抗體C區(qū)是不變的抗體的蛋白序列本文檔共115頁；當(dāng)前第93頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023

94人體有5種主要的重鏈，形成5類免疫球蛋白本文檔共115頁；當(dāng)前第94頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023

95抗體基因是多基因片段編碼的:V區(qū)抗體輕鏈中主要由V基因編碼，J基因編碼最后12個氨基酸；抗體重鏈中V和J之間還有一些D（diversity）基因片段C區(qū)由C基因編碼1.抗體的基因本文檔共115頁；當(dāng)前第95頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023

96抗體基因片段在基因組中的分布FamilyVGenesCGenesManMouseManMouseLambda<3002>64Kappa<300~100011Heavy~300>100098EachimmunoglobulinfamilyconsistsofaclusterofVgeneslinkedtoitsCgene(s).本文檔共115頁；當(dāng)前第96頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023

97ThelambdafamilyconsistsofVgenesegmentslinkedtoasmallnumberofJ-Cgenesegments.λ輕鏈基因多樣性—胚系DNA中ThehumanandmousekappafamiliesconsistofVgenesegmentslinkedto5JsegmentsconnectedtoasingleCgenesegment.κ輕鏈基因多樣性—胚系DNA中本文檔共115頁；當(dāng)前第97頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023

98Asinglegeneclusterinmancontainsalltheinformationforheavy-chaingeneassembly.抗體重鏈基因多樣性—胚系DNA中本文檔共115頁；當(dāng)前第98頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023

99

那么，抗體基因何時發(fā)生重排?

如何重排?

有無規(guī)律可循?本文檔共115頁；當(dāng)前第99頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023

1002.抗體的重排機制胚系DNA中并不存在每條H鏈和每條L鏈的完整基因,而是在B細胞的早期發(fā)育過程中,通過小段的基因片段拼接而成.如κ輕鏈:一個Vκ和一個Jκ連接成Vκ-Jκ,當(dāng)B細胞抗體基因被轉(zhuǎn)錄后,細胞核RNA的剪接使得Vκ-Jκ與Cκ相連接.(1)、可變區(qū)重排特點輕鏈重排特點V-J輕鏈有兩大家族：κ和λ(大部分抗體是κ輕鏈)重鏈重排特點V-D-J本文檔共115頁；當(dāng)前第100頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023

101抗體κ、λ輕鏈可變區(qū)重排過程本文檔共115頁；當(dāng)前第101頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023

102D-JV-DV-D-J抗體重鏈可變區(qū)重排過程本文檔共115頁；當(dāng)前第102頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023

103a.基因兩旁有保守的共有序列7聚體、9聚體（consensussequence）b.7聚體和9聚體間有非保守的重排信號序列(recombinationsignalsequence,RSS)，12bp或23bpc.重排規(guī)則:12/23規(guī)則，即12bp的信號序列總是與23bp的信號序列連接，從而保證重鏈與輕鏈的正確連接

(2)、重排及重排信號

本文檔共115頁；當(dāng)前第103頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023

104232323121212蘭色：7聚體綠色：9聚體重鏈可變區(qū)的VDJ重排本文檔共115頁；當(dāng)前第104頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023

105(3).重組酶a.重組激活基因，RAG（recombinationactivatinggens）基因編碼的重組酶:識別RSSs和切斷七聚體和基因片段。RAG-1和RAG-2在Pre-T和Pre-B細胞表達，因此成熟的淋巴細胞不再進行抗原受體基因的重排。b.TdT（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶）：不需要模板將核苷酸加到DNA單鏈斷裂處。本文檔共115頁；當(dāng)前第105頁；編輯于星期三\2點2分6/25/2023

106關(guān)于VDJ重排的總結(jié):抗體的多樣性和抗原結(jié)合的特異性由其可變區(qū)決定,因此重排是指H鏈和L鏈可變區(qū)的重排,重排產(chǎn)生堿基的丟失和增加；重排發(fā)生在DNA水平,而剪接發(fā)生在RNA水平；L鏈可變區(qū)發(fā)生V-J重排,H鏈發(fā)生V-D-J重排；抗體多樣性產(chǎn)生的原因一方面是B細胞成熟前發(fā)生的重排，另一方面是體細胞突變。當(dāng)一個產(chǎn)生抗體的細胞克隆增殖時，如果遇到外來抗原