體內(nèi)烏頭類生物堿毒物檢測(cè)方法概述

體內(nèi)烏頭類生物堿毒物檢測(cè)方法概述【摘要】概述了利用薄層層析法、紫外分光光度法、高效液相色譜法、高效液相－質(zhì)譜聯(lián)用、多級(jí)質(zhì)譜等方法檢測(cè)體內(nèi)烏頭類生物堿毒物的方法，旨在為臨床診斷和鑒定提供有益的借鑒。

【關(guān)鍵詞】烏頭；生物堿；毒物檢測(cè)；高效液相色譜法

烏頭類生物堿是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜和生物活性較強(qiáng)的中藥成分，絕大部分存在于烏頭屬和翠雀屬植物中。烏頭屬植物在我國(guó)有170余種，資源十分豐富，其中有的為常用中藥材，如川烏、草烏、附子等，可用于鎮(zhèn)痛、麻醉、消炎和治療風(fēng)濕等疾病，功效顯著從已灌服烏頭堿3h后的家兔膽汁中提取出代謝物，在薄層色譜上快速地展開用碘化鉍鉀溶液顯色，進(jìn)行了初步快速研究。實(shí)驗(yàn)表明：①采用的烏頭總堿的提取方法以及TLC檢識(shí)條件均可用于烏頭堿在動(dòng)物體內(nèi)代謝產(chǎn)物的研究，可為因服用烏頭堿類藥物而導(dǎo)致中毒的法醫(yī)學(xué)快速鑒定提供依據(jù)和方法。②給藥3h后，烏頭堿在兔體內(nèi)的代謝產(chǎn)物大量集中在肝臟而不是膽汁中，因此毒物的檢測(cè)應(yīng)重點(diǎn)在肝臟。

2高效液相色譜法

高效液相色譜法是20世紀(jì)60年代末迅速發(fā)展起來(lái)的一種新型分離分析技術(shù)，分離效能高、分析速度快、檢測(cè)靈敏度高，對(duì)藥物動(dòng)力學(xué)和臨床藥學(xué)研究的重要性越來(lái)越突出。

王慕鄒等［12］在1983年就較早地利用HPLC測(cè)定了10種烏頭植物中的烏頭堿、中烏堿和次烏堿的含量。發(fā)現(xiàn)雖然烏頭類生物堿的最大吸收為230nm左右，但在該波長(zhǎng)雜質(zhì)干擾大，而在240nm檢測(cè)基線更穩(wěn)定，可分析各種烏頭中的生物堿含量，為檢測(cè)烏頭類生物堿提供了可行的方法。

張興華等［13］初步探索應(yīng)用HPLC以甲醇－mol/L碳酸銨水溶液－二氯甲烷為流動(dòng)相，在ODS反相色譜柱上，以丁卡因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，波長(zhǎng)為235nm的紫外光，檢測(cè)了烏頭堿注射入家兔靜脈后血液中的濃度情況，給出了從血液中定量分析烏頭堿的方法。實(shí)驗(yàn)所用乙醚作溶劑來(lái)提取血液中烏頭堿具有雜質(zhì)少、毒性小和便于操作等優(yōu)點(diǎn)；采用丁卡因作內(nèi)標(biāo)較諸文獻(xiàn)［12］能更好地消除處理過程及色譜檢驗(yàn)過程中的誤差，提高測(cè)定的準(zhǔn)確性；采用以無(wú)機(jī)銨鹽作為改性劑的流動(dòng)相較文獻(xiàn)［12，14］中采用有機(jī)胺具有毒性低和堿性小的特點(diǎn)，對(duì)色譜柱損害小。

在對(duì)生物堿高烏甲素的藥理活性和毒性已有報(bào)道，而其代謝產(chǎn)物不明的情況下，XieFM等［15］針對(duì)高烏甲素研究了其在小鼠體內(nèi)的代謝過程和產(chǎn)物。作者采用分離效率高的HPLC分離小鼠尿液中的代謝產(chǎn)物，然后用靈敏度高、選擇性強(qiáng)的電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)各個(gè)化合物，再與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，檢測(cè)到了此化合物原型和它的4個(gè)代謝產(chǎn)物，為針對(duì)檢測(cè)化合物高烏甲素的中毒提供了依據(jù)。

武紅喜等［16］在實(shí)際中毒案例中，應(yīng)用HPLC選擇了理想的流動(dòng)相和色譜柱，結(jié)合薄層層析和紫外光譜分析，成功地檢出了烏頭堿成分，烏頭堿紫外吸收在234nm處有最大吸收。并將其成功地運(yùn)用到實(shí)際中毒案例中，通過對(duì)死者的檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)烏頭堿成分已經(jīng)達(dá)到致死量，確定了中毒原因。該方法不足在于靈敏度低，檢出限較高。

1996年YoshiokaN等［17］較系統(tǒng)地報(bào)道了一例因誤食烏頭堿而中毒死亡的例子。他們?cè)谄渌劳?4h后用GasChromatography/SelectedIonMonitoring方法分析了病人血清和尿液中的烏頭堿含量。結(jié)果在血清中僅發(fā)現(xiàn)微量的Jesaconitine，而無(wú)烏頭堿、中烏堿和次烏堿，這可能與死亡時(shí)間過長(zhǎng)有關(guān)。相反在尿液中清晰地檢測(cè)到了烏頭堿及其代謝物中烏堿、次烏堿和Jesaconitine，18h后的生物堿濃度遠(yuǎn)低于13h后的濃度，說明這段時(shí)間內(nèi)生物堿吸收、代謝和排泄相對(duì)較快。GC/SIM方法對(duì)體液特別是對(duì)血液中生物堿檢測(cè)的應(yīng)用，說明該方法對(duì)臨床上鑒定中毒者是否因?yàn)躅^堿中毒的死因具有實(shí)用意義和借鑒意義。同時(shí)這種靈敏的方法同樣可應(yīng)用于烏頭生物堿的吸收、分布和代謝等基礎(chǔ)性研究。

3高效液相－質(zhì)譜、高效液相－多級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用

由于GC/MS方法需要繁瑣的提取和化合物衍生化過程，OhtaH等［18］首次選擇已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥物領(lǐng)域的HPLC，結(jié)合紫外吸收檢測(cè)、固相提取和快原子轟擊質(zhì)譜方法研究了烏頭堿中毒者血液和尿液化學(xué)成分。即用液相色譜/快原子轟擊質(zhì)譜法從血液中檢測(cè)到了4種有毒烏頭類化合物，即烏頭堿、中烏堿、次烏堿和Jesaconitine，洗脫劑采用優(yōu)化后的四氫呋喃－％三氟乙酸體系，為判斷是否烏頭堿中毒提供了依據(jù)。作者考慮到這些生物堿結(jié)構(gòu)中均含有酯鍵，為了在HPLC/FAB-MS過程中選擇合適的溶劑溶解標(biāo)準(zhǔn)品，專門研究了它們?cè)诓煌軇┲械姆€(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)這些生物堿在堿性溶液中水解最快，在甲醇和乙醇中不穩(wěn)定，在乙氰、四氫呋喃和稀鹽酸中最穩(wěn)定，因此可以用這些穩(wěn)定的溶劑溶解樣品。文獻(xiàn)［18］中提到血液中生物堿的致死濃度為100－470ng/ml，而應(yīng)用HPLC/FAB-MS和固相提取相結(jié)合方法的檢測(cè)限能達(dá)到50ng/ml，因此即使有其它成分干擾，也能從血液和尿液中檢測(cè)到毒物的濃度。以上這些結(jié)論對(duì)于準(zhǔn)確檢測(cè)生物堿種類和判斷中毒原因具有重要意義。

XieFM,ZhangHG等［15，19～21］利用多級(jí)質(zhì)譜可以根據(jù)裂解碎片和裂解規(guī)律推測(cè)化合物的特點(diǎn)，采用固相萃取柱富集、液相色譜/電噴霧離子阱質(zhì)譜法研究了烏頭堿在兔體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。通過提取兔的尿液，對(duì)照空白尿液與給藥后尿樣的二級(jí)全掃描總離子流色譜圖，發(fā)現(xiàn)給藥后尿樣二級(jí)全掃描譜圖中有5個(gè)新增的色譜峰，通過檢測(cè)保留時(shí)間和裂解碎片，將這5個(gè)代謝產(chǎn)物鑒定為烏頭堿、16-O-去甲烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、16-O-去甲基苯甲酰烏頭原堿和烏頭原堿。

之后，在以上方法基礎(chǔ)上引入SIM方法針對(duì)4名中毒患者的尿樣進(jìn)行了HPLC/ESI-MSn分析，根據(jù)化合物保留時(shí)間從中檢測(cè)到了烏頭堿、中烏堿、次烏堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰中烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、16-O-去甲烏頭堿和16-O-去甲次烏頭原堿。該方法的靈敏度已達(dá)到1ng/ml，因此雖然烏頭堿代謝非常快，但通過色譜聯(lián)用技術(shù)仍能檢測(cè)到其在人體內(nèi)的存在，對(duì)中毒者尿樣的檢測(cè)是有效的。表1烏頭類生物堿在不同溶劑中的半衰期

4小結(jié)

本文概述了目前臨床上檢測(cè)體內(nèi)烏頭堿毒物的手段和方法。臨床試驗(yàn)表明，運(yùn)用高效液相色譜、多級(jí)質(zhì)譜結(jié)合代謝動(dòng)力學(xué)分析體內(nèi)組織中烏頭類生物堿及其代謝產(chǎn)物，在臨床上鑒定是否屬烏頭生物堿中毒是可行的，具有操作簡(jiǎn)便、樣品需量小、雜質(zhì)分離效果良好、靈敏度較高和重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。但是對(duì)于降解迅速的毒物，檢驗(yàn)如不及時(shí)或檢材保存不當(dāng)，毒物的迅速降解可造成檢出量的顯著差異，因此毒理學(xué)鑒定不但應(yīng)依據(jù)檢出的絕對(duì)毒物濃度，還應(yīng)依據(jù)相對(duì)毒物濃度、尸檢發(fā)現(xiàn)及現(xiàn)場(chǎng)勘查才能作出正確結(jié)論。

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