齊魯細胞治療CTL細胞資料及回輸注意事項

齊魯細胞治療CTL細胞資料及回輸注意事項1CTL(CytotoxicTLymphocyte)簡介CTL(CytotoxicTLymphocyte)，細胞毒性T細胞，其表面標(biāo)志是CD8。這些細胞的功能就像一個“殺手”，它們可以直接攻擊帶有特殊抗原的靶細胞，在抗病毒感染和抗腫瘤免疫中具有極其重要的用，細胞毒性T細胞也被稱為殺手T細胞。體內(nèi)T細胞經(jīng)過胸腺的陽性選擇和陰性選擇，分化成CD8+T細胞，在機體被感染時，經(jīng)過抗原遞呈細胞將特異性抗原遞呈給CD8+T而使其激活，發(fā)揮免疫清除、免疫調(diào)節(jié)的作用。體外CTL誘導(dǎo)培養(yǎng)首先抽取患者外周血，分離得到外周血單個核細胞（PBMC），分別培養(yǎng)DC及T細胞，DC細胞可以顯著刺激初始型T細胞（na?veTcell）增殖。將抗原負載DC細胞，抗原致敏誘導(dǎo)成熟的DC細胞與T細胞混合培養(yǎng)，通過TCR與抗原肽-MHC分子復(fù)合物結(jié)合提供T細胞活化的第一信號，DC表面的共刺激分子提供第二信號（見圖1），通過DC細胞強大的抗原遞呈功能激活初始CD8+T細胞，激活的CTL細胞回輸至患者體內(nèi)，發(fā)揮強大的免疫清除及免疫調(diào)節(jié)作用，殺傷帶有特殊抗原的靶細胞，達到治療感染性疾病及腫瘤的目的。圖1CTL的殺傷特點：a.殺傷力強；b.直接、連續(xù)、特異性反復(fù)殺傷靶細胞，而且在殺傷靶細胞的過程中本身不受損；c.MHC限制性。2CTL的作用機理CTL對靶細胞的殺傷過程可以分為三個時相：a.接觸相：CTL通過TCR特異性識別靶細胞表面的抗原-MHCI類分子復(fù)合物，在粘附分子輔助下與靶細胞緊密接觸。此過程只需要幾分鐘。b.分泌相：CTL與靶細胞緊密結(jié)合后，CTL活化并使細胞顆粒性內(nèi)容物呈現(xiàn)極化分布，隨即啟動胞吐機制，分泌細胞毒性物質(zhì)，作用于靶細胞，這些毒性物質(zhì)包括穿孔素（perforin）、顆粒酶（granzyme）、顆粒溶解素（granulysin）及淋巴毒素等。c.裂解相：靶細胞死亡過程。一是CTL分泌的穿孔素在靶細胞膜聚合，形成跨膜通道，使靶細胞膜出現(xiàn)大量的小孔，水分子進入靶細胞內(nèi)，導(dǎo)致滲透壓發(fā)生改變，細胞因滲透性溶解而死亡。顆粒酶經(jīng)穿孔素形成的跨膜通道進入細胞內(nèi)激活半胱天冬蛋白酶-10(caspase10)，誘導(dǎo)靶細與靶向藥物聯(lián)合使用提前采血，靶向藥物使用后的第2天回輸，利用ADCC效應(yīng)殺傷腫瘤細胞。單獨使用采血培養(yǎng)，14天左右回輸，首次使用最好連續(xù)回輸兩個周期。綜合治療手術(shù)、放化療、微創(chuàng)治療、靶向藥物治療、免疫細胞治療等治療手段的聯(lián)合治療，首先手術(shù)，然后采用放化療、微創(chuàng)治療、靶向治療等手段降低腫瘤負荷，腫瘤負荷降低后回輸免疫細胞殺傷殘留腫瘤細胞，起到防止復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的作用。治療效果1）提高患者對放化療的敏感性；2）清除體內(nèi)的殘留腫瘤細胞；3）防止腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移4）回輸后可改善機體免疫環(huán)境，增強機體的免疫功能；5）改善患者的生活質(zhì)量，延長生存期4CTL與肝炎乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）引起的一種世界性疾病。HBV是一種嗜肝DNA病毒，非直接致細胞病變，HBV引起的肝損傷是免疫應(yīng)答介導(dǎo)的。HBV的免疫清除對促進肝功能恢復(fù)、防止和減少肝硬化和肝細胞癌的發(fā)生有著最根本的意義。慢性丙型肝炎（CHC）是由丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus，HCV）引起，嚴重威脅人類健康，HCV是除了HBV感染引起肝細胞癌的主要致病因素之一。CHC的治療目前尚無理想藥物，干擾素是目前唯一有效的抗病毒藥物，但是其治療尚難令人滿意，治愈率低且停藥后約一半病例復(fù)發(fā)。近年來研究證明，利用HBV抗原肽刺激急性HBV感染者的外周血單個核細胞，能夠引起特異性HLA-I類分子限制的CTL應(yīng)答。HCV感染所誘發(fā)的細胞毒性T細胞在清除HCV和控制HCV感染中起重要作用。干擾素聯(lián)合利巴韋林是目前公認的治療慢性丙肝的方法，但療效欠滿意，尤其是治療過程中出現(xiàn)的嚴重副作用，使不少患者無法耐受。用HCV多肽抗原在體外誘導(dǎo)、增殖、活化丙肝患者的單個核細胞，獲得體外激活的CTL細胞回輸體內(nèi)后可在體內(nèi)繼續(xù)增殖并聚集在其他靶細胞部位，引起強烈的細胞免疫反應(yīng)而清除丙肝病毒的作用。細胞毒性T淋巴細胞能殺滅表達特異性抗原的靶細胞，在機體抵抗各類病毒感染和/或?qū)е旅庖卟±頁p傷中起著極為重要的作用。CTL的殺傷作用是抗原特異性的，初始CD8+T細胞識別抗原后，進行程序性克隆擴增并分化為CTL，一方面通過CTL表面表達的Fas配體和分泌的TNF-α與靶細胞上的Fas受體（CD95）和TNF受體結(jié)合，誘導(dǎo)感染細胞凋亡；另一方面介導(dǎo)細胞溶解機制，成熟CTL胞質(zhì)釋放大量穿孔素（PF）和顆粒酶等，殺傷感染細胞。此外，活化的CTL還可分泌IFN-γ和淋巴毒素等細胞因子，而IFN-γ一方面可以直接抑制病毒在宿主細胞中的復(fù)制和增殖，另一方面可以激活干擾素調(diào)節(jié)因子1（interferonregulatorfactor-1，TRF-1）和轉(zhuǎn)錄激活子-1（signaltransducersandactivatorsoftranscription-1，STAT-1），繼而活化巨噬細胞，產(chǎn)生廣譜抗病毒效應(yīng)，清除病毒。目前，CTL細胞免疫生物療法以其高效的抗病毒能力、穩(wěn)定的療效成為國際多個權(quán)威醫(yī)學(xué)機構(gòu)共同推薦的慢性丙肝患者治療首選方案，該方案得到了歐洲肝病學(xué)會、美國肝臟病學(xué)會、亞太地區(qū)肝病學(xué)會等多家權(quán)威醫(yī)學(xué)機構(gòu)的一致認可。CTL細胞生物免疫療肝炎的四大優(yōu)勢（

1）免疫調(diào)節(jié)，減時增效

CTL細胞免疫生物療法以誘導(dǎo)肝細胞產(chǎn)生大量細胞因子，來協(xié)助清除病毒，同時有效調(diào)節(jié)細胞因子的活性，以達到有效降低免疫損傷的目的。（

2）綜合治療，兼容性強

CTL細胞免疫生物療法是抗病毒、調(diào)免疫、促恢復(fù)的全方位治療方法，抗乙/丙肝病毒作用較單一療法高出5倍以上。此外，CTL細胞免疫生物療法有很強的兼容性，肝炎患者使用其他治療方法無效時，可改用CTL細胞免疫生物療法，調(diào)整免疫狀態(tài)，扭轉(zhuǎn)抗病毒進程。（

3）特效制劑，一并治療合并癥

一般如果丙肝合并肝硬化、脂肪肝、糖尿病、心臟病、膽道感染等，都難以治療。如許多難治性丙肝病人血清鐵較高，肝細胞內(nèi)含鐵也多，影響療效。CTL細胞免疫生物療法采用體外導(dǎo)入的特效制劑能夠與過多的鐵進行結(jié)合，排出體外，同時還起到免疫調(diào)節(jié)作用。（

4）療效穩(wěn)定，愈不復(fù)發(fā)

CTL細胞免疫生物療法產(chǎn)生的大量細胞因子可有效阻斷乙/丙肝病毒的Fas表達，減少產(chǎn)生膜蛋白分子；同時激活細胞免疫誘導(dǎo)，二者結(jié)合導(dǎo)致病毒凋亡。

CTL細胞生物免疫療法可聯(lián)合聯(lián)合利巴韋林、免疫促進劑一起使用，對干擾素及傳統(tǒng)治療無效的疑難病情可采用聯(lián)合療法，聯(lián)合療法突破傳統(tǒng)干擾素單一治療局限，提高免疫細胞的活性，不斷增加細胞濃度，進而實現(xiàn)對丙肝病毒的長效抑制和清除，真正實現(xiàn)了對丙肝的標(biāo)本兼治。5CTL細胞的適應(yīng)征與禁忌征5.1CTL細胞的適應(yīng)癥各種免疫原性較強的腫瘤，如：肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、腎癌、惡性黑色素瘤等；原發(fā)灶去除后（手術(shù)、放療等），免疫力低下，恢復(fù)慢，預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。如胃癌術(shù)后、肺癌術(shù)后、肝癌術(shù)后等；腫瘤廣泛轉(zhuǎn)移，無法進行手術(shù)者，可與化療配合使用；對放化療不敏感或者無法耐受的腫瘤患者；常規(guī)治療后（手術(shù)及放化療）需要提高身體免疫力者；腫瘤臨床康復(fù)后的腫瘤復(fù)發(fā)預(yù)防；乙/丙型肝炎患者?；颊弑仨毻瑫r符合下列條件生活自理，卡氏體力狀況評分標(biāo)準(zhǔn)60分以上；預(yù)期生存期＞3個月的患者；實驗室檢查必須符合下列條件：淋巴細胞絕對值＞0.8*109/L，血小板＞50*109/L，血紅蛋白＞70g/L；病人有自知能力，能簽署知情或志愿同意書；通過手術(shù)或其他方式能夠獲得一定數(shù)量的腫瘤組織的患者，可以制備個體特異性的腫瘤抗原。5.2CTL細胞的禁忌癥臟器移植者；T細胞淋巴瘤、T細胞白血病，由于本身即是免疫細胞的病變，所以亦不適用；HIV陽性，或者有其他嚴重的自身免疫性疾病者；不可控制的感染性疾病；對細胞培養(yǎng)過程中所用生物制劑過敏者，以及4周內(nèi)大量使用過糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑者；懷孕或哺乳期婦女；肝、腎、心臟等主要器官功能不全者，具體器官標(biāo)準(zhǔn)如下：心臟：IV級以上肝臟：達到國內(nèi)肝功能分級C級以上腎臟：腎功能衰竭及尿毒癥肺：出現(xiàn)嚴重的呼吸衰竭癥狀，累及到其他臟器，如肝、腎功能腦：腦轉(zhuǎn)移并伴意識障礙者6采血及注意事項6.1采血前工作6.1.11）進行患者篩查：包括乙肝、丙肝、艾滋病毒、梅毒等感染。極晚期患者需進行血培養(yǎng)檢查，以排除患者患菌血癥。（艾滋病陽性患者不能進行細胞培養(yǎng)；菌血癥患者不能進行細胞培養(yǎng)）?；颊咝杼峁┮韵聶z查結(jié)果：血常規(guī)（患者未經(jīng)其他治療時，7天內(nèi)有效），此結(jié)果必須提供；感染篩查（患者未經(jīng)其他治療時，30天內(nèi)有效），此結(jié)果必須提供；腫瘤標(biāo)志物（患者未經(jīng)其他治療時，30天內(nèi)有效），此結(jié)果建議提供；以進行治療評價；CT或X光片、B超（患者未經(jīng)其他治療時，30天內(nèi)有效），此結(jié)果建議提供，以進行治療評價；病毒拷貝數(shù)檢測（患者未經(jīng)其他治療時，7天內(nèi)有效），對慢性病毒感染患者，此結(jié)果建議提供，以進行治療評價；血生化全項（患者未經(jīng)其他治療時，7天內(nèi)有效），此結(jié)果建議提供；以進行治療評價。2）檢查患者血常規(guī)，根據(jù)淋巴細胞比例和淋巴細胞絕對值決定患者抽血量。抽血量（mL）=（80∕淋巴細胞絕對值）×109（計算取血量超過100mL原則上不能進行細胞培養(yǎng)）注：淋巴細胞絕對值=人外周血白細胞數(shù)×人外周血淋巴細胞百分數(shù)健康人外周血淋巴細胞絕對值正常范圍：0.8-4×109/L健康人外周血淋巴細胞百分數(shù)正常范圍：0.2-0.4（20%-40%）健康人外周血白細胞數(shù)正常范圍：4-10×109/L3）腫瘤患者抽血前沒有任何感染、發(fā)熱（腫瘤熱除外）以及心、肝、肺、腎功能異常。6.1.2由醫(yī)生據(jù)患者病情提出CTL細胞治療并填寫患者信息表，患者簽署知情同意書。6.1.3目前無其它治療；手術(shù)時間安排；化療時間安排；放療時間安排；靶向治療時間安排；抗病毒治療時間安排。6.1.4醫(yī)生結(jié)合實驗室檢查結(jié)果和臨床安排確認采血時間并通知業(yè)務(wù)人員（最好根據(jù)手術(shù)、放化療的療程同時制定好回輸計劃及采血時間）。6.1.5主管醫(yī)生收到患者繳費相應(yīng)單據(jù)后安排人員進行采血操作。6.1.盡量空腹抽血，若抽血時間較晚也可適當(dāng)進食，但勿食用油膩食物或進食過量，且最好在進食2-3小時后抽血；抽血前不能輸液；手術(shù)病人應(yīng)術(shù)前取血；化療病人應(yīng)在化療療程開始前取血或化療后血象恢復(fù)正常后取血；放療病人應(yīng)在放療療程開始前取血或放療后血象恢復(fù)正常后取血；連續(xù)兩個療程治療時，取血和回輸細胞在時間上會有交叉，取血必須在細胞回輸之前。6.2采血用具的準(zhǔn)備6.2.1一次性使用真空采血針組件（BloodCollectionSet）；肝素抗凝管；采血袋。6.2.2棉簽、碘伏、膠帶和止血帶。6.2.3見附件中《采血操作規(guī)程》。7回輸及注意事項7.1回輸日期的通知和確認7.1.1業(yè)務(wù)員在采血后一周內(nèi)以E-MAIL形式通知主管醫(yī)生下周回輸安排，并以電話、短信形式提醒醫(yī)生查看E-MAIL7.1.27.1.37.2CTL細胞的包裝和質(zhì)量檢驗單7.2.1標(biāo)準(zhǔn)回輸袋100mLCTL7.2.2細胞質(zhì)量報告單（包括微生物檢測、內(nèi)毒素檢測和產(chǎn)品細胞數(shù)量，并有報告人和審核人姓名，同時加蓋質(zhì)檢章）；細胞回輸簽收單。7.3CTL細胞的運輸7.3.17.3.2簽收產(chǎn)品和產(chǎn)品質(zhì)量報告；在CTL細胞回輸簽收單上簽名。7.4CTL細胞回輸7.4.1生理鹽水、治療盤及相關(guān)物品（由醫(yī)院提供）；輸血器、7號或更大號套針管（由公司提供）。7.4.27.4.3回輸前首先核對CTL7.4.4連接100mL生理鹽水與輸血器，將輸血器原裝所帶大號針頭換成套管針并排氣；將針頭與病人血管連接固定，觀察生理鹽水點滴情況；預(yù)處理：一般不需任何預(yù)處理，但若患者為過敏體質(zhì)或其它情況需根據(jù)醫(yī)囑加入相應(yīng)處理，比如回輸前提前15分鐘肌肉注射非那根25mg；如果生理鹽水點滴通順，換上細胞轉(zhuǎn)輸袋，調(diào)節(jié)速度為30-40滴/分；一般病人觀察10分鐘后如沒有特殊反應(yīng)，將滴速改為60-80滴/分，直至輸完；若患者有心血管方面疾病應(yīng)按醫(yī)囑控制滴速?；剌斶^程中可叮囑家屬或護士每隔5-10分鐘輕輕擠壓轉(zhuǎn)輸袋底部，使沉淀細胞重新懸?。患毎剌斖戤吅髮⑤斞鬟B接上剩余的生理鹽水，沖洗輸血器內(nèi)剩余的細胞；管內(nèi)細胞沖洗干凈后回輸完成。7.4.

8其他注意事項8.1知情同意書書面證明患者本人或家屬已了解CTL細胞治療的情況并同意接受治療，由醫(yī)院保留。8.2回輸方案的制定單獨使用CTL細胞時，一般在采血后第14天開始第一次回輸，具體回輸計劃在采血后7天內(nèi)告知主管醫(yī)生；如CTL細胞配合手術(shù)、放化療使用，需要醫(yī)生提供手術(shù)、放化療的療程及時間安排，并與公司技術(shù)人員一起制定回輸計劃，并確定采血時間。8.3血液、細胞的儲存及運輸要求血液樣本采集完成后要求在10-20℃之間儲存，采血管垂直放置，采血袋水平放置，8小時內(nèi)運輸?shù)竭_實驗室；細胞在收獲后回輸前要求在10-20℃之間儲存和運輸，在12小時內(nèi)完成回輸。