豬口腔液在疫病監(jiān)測(cè)上的應(yīng)用進(jìn)展

豬口腔液在疫病監(jiān)測(cè)上的應(yīng)用進(jìn)展近年來(lái)，豬疫病病原監(jiān)測(cè)將采用豬口腔液采集新技術(shù)。采樣技術(shù)將從傳統(tǒng)的機(jī)體損傷性逐漸向非應(yīng)激性采集方式轉(zhuǎn)變。以往病原監(jiān)測(cè)采集的樣品主要以血液、扁桃體、肺和淋巴結(jié)等為主。扁桃體和血液樣品的采集需在豬活體上進(jìn)行，采樣難度大，易給豬群造成較大應(yīng)激及不良反應(yīng)，在實(shí)際采樣工作中常遇到養(yǎng)殖場(chǎng)戶不配合情況。而肺和淋巴結(jié)等組織往往需從屠宰場(chǎng)采集，樣品難以準(zhǔn)確反映本地豬群疫病管理的實(shí)際情況。而豬口腔液樣品采集技術(shù)操作簡(jiǎn)易、成本低廉，適合大面積推廣，對(duì)豬只無(wú)損傷，更加符合動(dòng)物福利原則。所謂口腔液，即是指豬口腔中的唾液和血清滲出液的混合液體，血清滲出液是通過(guò)口腔黏膜和口腔黏膜上的齒齦溝和毛細(xì)血管進(jìn)入口腔。業(yè)已證實(shí)，口腔液具有廣泛的生物學(xué)功能，口腔液樣品既可用作抗體檢測(cè)，又可用于PCR檢測(cè)抗原，可替代血清樣品，為豬群傳染病監(jiān)測(cè)提供有效的技術(shù)手段，口蹄疫病毒、非洲豬瘟病毒、經(jīng)典豬瘟病毒、流感病毒、藍(lán)耳病病毒、以及還有其他的一些病原體都可以采用口腔液進(jìn)行檢測(cè)。雖然口腔液樣品主要采自于斷奶豬和生長(zhǎng)育肥豬，但也適用于后備種豬、生產(chǎn)母豬和生產(chǎn)公豬。1.豬口腔液采集方法將100％純棉繩懸掛于豬欄的干凈區(qū)域，直徑1.3cm的繩子用于保育豬口腔液采集，直徑1.6cm的繩子則用于生長(zhǎng)育肥豬和生產(chǎn)公母豬。繩子上端打結(jié)，并做好固定。懸掛處應(yīng)遠(yuǎn)離飼槽和豬排便區(qū)，懸掛高度應(yīng)高于豬身但保證豬能接近和啃咬，任豬咀嚼，30min后收取棉繩，刮取和擠壓上面的口腔液至塑料板或玻璃皿中，再將口腔液吸取至試管中備用，理論上至少能收集到4mL的采樣量，但一般認(rèn)為≥1mL為有效采集量。如果口腔液樣品比較干凈，則無(wú)需再作處理；如果樣品混有顆粒物，則低速離心10min即可。2.口腔液檢測(cè)的注意事項(xiàng)(1)口腔液檢測(cè)并非疫病診斷或檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中的程序，僅用于豬群中循環(huán)抗體或抗原的檢測(cè)和評(píng)估。(2)口腔液樣品不要混樣。(3)棉繩吸收性最好，合成纖維繩則效果稍差。(4)有的豬群第一次可能不太情愿啃咬繩子，可先將繩子供其玩弄，或在繩子上噴灑糖溶液，一旦習(xí)慣養(yǎng)成，而后再采集就方便了。(5)豬上午活動(dòng)敏捷，因此宜于在該時(shí)間段采樣，午后則可能花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)。(6)繩子的懸掛高度應(yīng)與豬肩胛部平。(7)豬有喜新厭舊的心理，已經(jīng)使用的繩子不宜再用。豬口腔液采集新技術(shù)一個(gè)樣本可覆蓋多豬只，可同時(shí)檢測(cè)多種疫病病原，減少人力物力的耗費(fèi)，大幅提高疫病檢測(cè)效率，能夠更加全面地掌握豬群的整體狀況?？谇灰翰杉椒ê?jiǎn)便，易學(xué)易用，速度快，應(yīng)急小，費(fèi)用低，不需要專門器材和特殊的技巧訓(xùn)練，并可減少應(yīng)激，改善動(dòng)物福利，有助于豬群生長(zhǎng)性能的提高，是評(píng)估豬群實(shí)時(shí)健康動(dòng)態(tài)的良好工具。------------------------------------------------------------------北京中科基因技術(shù)有限公司系動(dòng)物疫病檢測(cè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室連鎖機(jī)構(gòu)，致力于打造動(dòng)物健康管理及安全畜產(chǎn)品生產(chǎn)生態(tài)圈。公司以在全國(guó)通過(guò)CMA認(rèn)證的數(shù)十家動(dòng)物疫病檢測(cè)診斷服務(wù)平臺(tái)為技術(shù)支撐，為養(yǎng)殖企業(yè)提供疫病診斷、病原基因測(cè)序、免疫抗體水平評(píng)價(jià)及細(xì)菌耐藥性和消毒效果評(píng)價(jià)等服務(wù)，為畜禽診療機(jī)構(gòu)提供臨床檢驗(yàn)服務(wù)，為大學(xué)及科研機(jī)構(gòu)提供科研外包服務(wù)，為各級(jí)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供免疫密度及免疫效果評(píng)價(jià)服務(wù)，為疫苗、獸藥、飼料等生產(chǎn)企業(yè)提供臨床試驗(yàn)及售后服務(wù)外包。公司搭建執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師注冊(cè)平臺(tái)，為執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師提供注冊(cè)與繼續(xù)教育培訓(xùn)服務(wù)，組織高水平執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師為養(yǎng)殖企業(yè)提供線上線下技術(shù)服務(wù)。同時(shí)搭建疫病診斷實(shí)驗(yàn)室聯(lián)盟，為各成員實(shí)驗(yàn)室提供相關(guān)培訓(xùn)、疫病及技術(shù)資訊、實(shí)驗(yàn)室管理、耗材及標(biāo)準(zhǔn)化運(yùn)營(yíng)服務(wù)。公司一直奉行“獨(dú)立公正、專業(yè)高效”的服務(wù)理念，努力提升中國(guó)獸醫(yī)診斷及疫病防控水平，為動(dòng)物健康管理及安全畜產(chǎn)品生產(chǎn)保駕護(hù)航。一、豬口腔液的介紹豬口腔液指豬口腔中的唾液和血清滲出液組成的混合液體。唾液是由大小唾液腺（大唾液腺包括腮腺、頜下腺和舌下腺；圖1）分泌的混合液體，無(wú)色無(wú)味近于中性（pH6.6～7.1），其中水分約占99%，其余成分主要是黏液素、淀粉酶、溶菌酶、脂肪酶、富脯氨酸糖蛋白等。血清滲出液是通過(guò)口腔黏膜和口腔黏膜上的齒齦溝和毛細(xì)血管進(jìn)入口腔的液體。口腔液具有廣泛的生物學(xué)功能，口腔液樣品可以用于抗體檢測(cè)和PCR檢測(cè)抗原，一定程度上可替代血清樣品，為監(jiān)測(cè)豬群傳染病提供一種新的技術(shù)手段。二、豬口腔液和豬血樣作為檢測(cè)樣品的比較使用口腔液的優(yōu)勢(shì)：1.采集方便、成本低廉、效率高、可大量采樣；二是采樣方法簡(jiǎn)單，采樣人員經(jīng)簡(jiǎn)單培訓(xùn)即可，易學(xué)易用，可快速獲取結(jié)果，適合國(guó)家性或區(qū)域性動(dòng)物疫病根除或凈化計(jì)劃；三是臨床采樣簡(jiǎn)單，可行性強(qiáng)，既不會(huì)擾亂豬場(chǎng)日常生產(chǎn)性安排和引發(fā)動(dòng)物不良應(yīng)激，且可連續(xù)采樣，尤其適用于富含脂肪組織和生性兇猛的生產(chǎn)公豬群。第四，更符合動(dòng)物福利原則。三、豬口腔液可作為評(píng)估豬應(yīng)激情況和健康狀況的的生物標(biāo)記物口腔液是研究豬應(yīng)激的最佳液體樣品，其中的皮質(zhì)醇可以作為評(píng)估豬應(yīng)激的標(biāo)記物。豬群運(yùn)輸、不同環(huán)境、不同飼養(yǎng)條件（如不同飼養(yǎng)密度、不同日糧組成、打耳標(biāo)、采血等）下，豬口腔液中皮質(zhì)醇不同。另外，口腔液中IgA、α-淀粉酶活性、IL-18、嗜鉻粒蛋白A和急性期蛋白（APP，包括C-反應(yīng)蛋白、血清淀粉樣蛋白A等）含量增減變化，可以用于豬群應(yīng)激壓力的評(píng)估。Gutierrez等通過(guò)檢測(cè)APP、結(jié)合珠蛋白、C反應(yīng)蛋白和血清淀粉樣蛋白A的含量，確定了豬繁殖和呼吸綜合征（PRRS）健康豬群和患病豬群的的臨界值。Gutierrez等通過(guò)對(duì)健康豬群和發(fā)病豬群口腔液蛋白質(zhì)組學(xué)的比較分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)病豬群口腔液中的脂蛋白、脂蛋白Ⅰ、雙頭胃蛋白酶抑制劑、腺甙脫氨酶、結(jié)合珠蛋白、S100-A12、S100-A8、S100-A9和α-淀粉酶的含量顯著高于健康豬群。四、豬口腔液的采集因?yàn)樨i舍環(huán)境條件和檢測(cè)目標(biāo)等的不同，豬口腔液的采集方法會(huì)有一定差異，同時(shí)采集方法、器械、地點(diǎn)和時(shí)間等會(huì)影響口腔液的組成成分。在此推薦一種豬口腔液的采集方法：將直徑1.3cm的全棉繩用于保育豬、直徑1.6cm的繩子用于生長(zhǎng)育肥豬和生產(chǎn)公母豬口腔液采集，用于采集育成豬口腔液的工具如圖2所示，懸掛處應(yīng)遠(yuǎn)離飼槽和豬排便區(qū)。棉繩上端固定，下垂高度與豬只的肩關(guān)節(jié)齊平（圖3），任豬咀嚼，30min后收取棉繩（圖4），刮取和擠壓口腔液至自封袋（圖5），然后裝入EP管或容器。一般認(rèn)為≥1mL為有效采集量。五、豬口腔液采集注意事項(xiàng)(1)口腔液檢測(cè)并非疫病診斷或檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)程序，僅用于豬群中循環(huán)抗體或病原的檢測(cè)和評(píng)估。(2)單獨(dú)處理樣品，一旦發(fā)現(xiàn)抗體或病原，方便回溯研究。(3)棉繩相較于材質(zhì)繩吸收性最好。(4)培養(yǎng)豬群啃咬繩子的習(xí)慣，方便后續(xù)采集。(5)宜在豬群較為活躍的上午采集樣品。(6)繩子的懸掛高度應(yīng)與豬肩胛部齊平。(7)豬有喜新厭舊的心理，已經(jīng)使用的繩子不宜再用。六、豬口腔液在豬疾病診斷方面的應(yīng)用在獸醫(yī)領(lǐng)域，1905年，前蘇聯(lián)最早將馬的口腔液用于疾病檢測(cè)（BlakeandTobin,1986）。在豬，1976年Corthier首先將豬口腔液用于豬瘟的檢測(cè)。近十幾年來(lái)，國(guó)內(nèi)外動(dòng)物醫(yī)學(xué)界對(duì)豬口腔液的研究報(bào)道日漸增多和深化，將為豬口腔液在分析、檢測(cè)等方面的推廣應(yīng)用提供良好的前景。病毒：豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬德?tīng)査跔畈《?、豬呼吸道冠狀病毒、豬繁殖和呼吸綜合征病毒、口蹄疫病毒、豬偽狂犬病病毒、A型流感病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、非洲豬瘟病毒、細(xì)環(huán)病毒1型和2型等的抗體或抗原。細(xì)菌或支原體：豬大腸桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、豬空腸彎曲菌、鏈球菌、螺旋菌、丹毒絲菌屬、胞內(nèi)勞森氏菌、豬鼻支原體、豬滑液支原體、豬肺炎支原體等的抗體或抗原。豬口腔液可以用于早期診斷，某些豬傳染病的病毒血癥在感染豬出現(xiàn)臨床癥狀前已經(jīng)存在于豬口腔液中，因此可以比血清樣品更早得到結(jié)果?？谇灰翰杉瘶悠犯奖?，如螺旋菌引起的胃潰瘍，通常要尸檢后方能觀察到病變，但可以直接從口腔液中檢測(cè)到病原?？梢酝ㄟ^(guò)口腔液檢測(cè)一些疫苗的有效性，并可用于對(duì)口腔液中病原的分子進(jìn)化特征進(jìn)行分析。豬口腔液(以下簡(jiǎn)稱口液),是指豬口腔中的唾液和血清滲出液的混合液體,具有廣泛的生物學(xué)功能,既可用作抗體檢測(cè),又可用于檢測(cè)多種病原體,如口蹄疫病毒、非洲豬瘟病毒、豬瘟病毒、流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒2型等。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外動(dòng)物醫(yī)學(xué)界對(duì)豬口液的研究日漸增多和深化,口液樣本的潛在診斷價(jià)值正在被逐步開(kāi)發(fā)利用。1口液采集方法在樣品采集前應(yīng)禁食禁水6h,可在早上飼喂前把棉質(zhì)繩子直接固定在圍欄或支架上,繩子的兩端與豬的肩胛骨同高,遠(yuǎn)離水或飼料吸引豬來(lái)咀嚼。懸掛時(shí)間20min左右,待繩子經(jīng)過(guò)欄舍內(nèi)所有豬咀嚼后,把繩子放到封口袋內(nèi),通過(guò)在袋子里拉或擠壓繩子,讓液體在袋子底部聚集,隨后將封口袋一角剪破,將口液收集到15mL離心管內(nèi)。收集2～3mL口液即可滿足檢測(cè)要求,樣品收集后應(yīng)立即冷藏運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室開(kāi)展檢測(cè)。不建議對(duì)口液進(jìn)行過(guò)濾除菌、添加抗生素等前處理,可1000～8000r/min離心或不進(jìn)行任何處理即可開(kāi)展檢測(cè)?？谝簶悠?℃可以冷藏至少12d,也可在-20℃或更低溫度凍存,凍存對(duì)抗體檢測(cè)影響較小。在規(guī)模為1000～2000頭豬或40～50個(gè)圍欄的棚舍里,放置10根繩子即可;30頭及以下的豬圈1根繩子即可。在較大的豬圈(100頭以上)內(nèi),應(yīng)在不同的區(qū)域內(nèi)懸掛多根繩子,以吸引不同的豬群。因口液取樣引發(fā)豬應(yīng)激很小,采集的最佳頻次為每周1次,頻次可根據(jù)場(chǎng)內(nèi)疫病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和疫病監(jiān)測(cè)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。2口液樣品優(yōu)勢(shì)目前豬場(chǎng)多通過(guò)血液檢測(cè)疫病的抗體和病原的方法開(kāi)展豬群免疫監(jiān)測(cè)和疫病診斷,但采血引發(fā)豬的應(yīng)激較大,采樣耗時(shí)費(fèi)力,并存在一定人員危險(xiǎn)(特別是進(jìn)行種公豬采樣時(shí))。采血監(jiān)測(cè)不能滿足疫病凈化監(jiān)測(cè)的大樣本量和頻繁采樣,且由于許多病原菌(毒)血癥時(shí)間較短,也不適用于病原檢測(cè)。當(dāng)前,豬群疫病根除和凈化已經(jīng)全面展開(kāi),需要監(jiān)測(cè)大量樣品的同時(shí),不同的監(jiān)測(cè)階段和監(jiān)測(cè)項(xiàng)目對(duì)檢測(cè)樣品的要求也不一樣。新型的無(wú)創(chuàng)樣本采集方法具備廣闊的市場(chǎng)前景和巨大的實(shí)用價(jià)值?？谝簶悠凡杉捅O(jiān)測(cè)技術(shù)具備樣本采集方便,對(duì)機(jī)體造成的應(yīng)激小,可檢測(cè)內(nèi)容豐富,樣本內(nèi)的成分相對(duì)穩(wěn)定、蛋白和脂類含量低等特點(diǎn)。豬對(duì)周圍的環(huán)境充滿好奇和興趣,喜歡咀嚼,利于口液樣品的采集。部分豬場(chǎng)對(duì)于口液采集會(huì)不會(huì)造成疫病傳播存在疑慮,因?yàn)榧w飼養(yǎng)的豬一直在共用喂食器、飲水器、生活區(qū)等,所以口液采集并不會(huì)額外造成疫病散播。采集的口液樣品還有一個(gè)保存優(yōu)勢(shì),就是可以直接冷凍保存,口液中的各種酶類和抗菌物質(zhì)可以使樣品保存更長(zhǎng)時(shí)間?？梢允箻悠繁４娓L(zhǎng)時(shí)間?？偠灾?豬口液的采樣和檢測(cè)為監(jiān)測(cè)豬群傳染病提供了一種新型的有效技術(shù)手段,適于大樣本量頻繁采樣和病原篩查的活體采樣及監(jiān)測(cè)。3注意事項(xiàng)3.1繩子的大小和類型純棉質(zhì)的三股繩最適合用于檢測(cè)。繩子直徑至少達(dá)到1.2cm,以確保收集到足夠的樣本量。另外,繩子的材質(zhì)和大小要統(tǒng)一,不能用不同繩索收集口液或者使用尼龍繩、麻繩,否則會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。3.2放置繩子的部位繩子的最佳懸掛方式是掛在支架上并伸到欄舍生活區(qū)中間,水平高度在豬的肩部即可,這樣可以讓盡量多的豬都接觸到繩子。也可以直接將繩子牢固地系在豬可接觸的欄桿上,但注意不要系在水槽或龍頭附近,這樣會(huì)稀釋口液樣品。3.3放置區(qū)域和數(shù)量選定的樣品應(yīng)該具有充分的代表性,合理分布在棚舍的不同區(qū)域,一旦劃定了采樣區(qū)域,就需要對(duì)區(qū)域進(jìn)行標(biāo)識(shí),盡量不要變動(dòng),以減少對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。一般每棟小型豬舍用5根繩子,大型豬舍用10根繩子,即可提供足夠的相關(guān)健康信息,可以觀察和識(shí)別病原體和抗體的變化。3.4不同生產(chǎn)階段豬口液的收集保育豬和育肥豬要注意繩子懸掛20min后立即收集口液,因?yàn)楫a(chǎn)房和保育舍環(huán)境溫暖,繩子會(huì)干燥。單獨(dú)飼養(yǎng)的母豬需要在早上喂食前取樣,將稀糖水噴在繩子上,可以提高成功率,注意不能把繩子直接泡在糖水里,因?yàn)檫@樣會(huì)大大稀釋采集的口液樣品,對(duì)后續(xù)試驗(yàn)的靈敏度造成影響。斷奶仔豬需要提前對(duì)棉繩進(jìn)行適應(yīng),否則采樣成功率不高。3.5廢棄的樣品