基因工程制藥

關(guān)于基因工程制藥第1頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三基因工程定義：基因工程是指將一種或多種生物體（供體）的基因在體外進(jìn)行剪切和組合，然后與載體拼接，并通過載體轉(zhuǎn)入到另一種生物體（受體）內(nèi)，使其按照人們的意愿遺傳并表達(dá)出新的性狀?；蚬こ痰娜笠兀汗w，受體和載體第2頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三基因工程是指將一種或多種生物體（供體）的基因在體外進(jìn)行剪切和組合，然后與載體拼接，并通過載體轉(zhuǎn)入到另一種生物體（受體）內(nèi)，使其按照人們的意愿遺傳并表達(dá)出新的性狀?；蚬こ痰娜蠹夹g(shù)：

剪切，連接和轉(zhuǎn)入第3頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

除了少數(shù)RNA病毒外，幾乎所有的基因都存在于DNA結(jié)構(gòu)中，而用于外源基因重組拼接的載體也都是DNA分子，因此基因工程也稱為重組DNA技術(shù)（DNARecombination）。另外，DNA重組分子大都需在受體細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增，故還可將基因工程表征為分子克隆或基因的無性繁殖（Molecularcloning）。第4頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

基因工程技術(shù)是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌(或細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。第5頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三2000年，法國科學(xué)家利用基因技術(shù)“制造”出了一只可以發(fā)出綠色熒光的兔子“Alba”。應(yīng)用了受精卵顯微注射技術(shù)，從水母身上采集了熒光蛋白，基因改良后，使它的發(fā)光率比原先提高了兩倍，再將該基因植入到了兔子的受精卵中，由此培養(yǎng)出了會發(fā)光的兔子Alba。在普遍光線下，它看上去與其它同類沒有區(qū)別，但是在較暗的光線下，它的身體就會放射出奇異的綠光來。

第6頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三基因工程基本過程第7頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

上游技術(shù)指的是外源基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建（即狹義的基因工程）；而下游技術(shù)則涉及到含有重組外源基因的生物細(xì)胞（基因工程菌或細(xì)胞）的大規(guī)模培養(yǎng)以及外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化過程。第8頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

廣義的基因工程定義為DNA重組技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。第9頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三從DNA出發(fā)的基因工程基本流程示意圖供體細(xì)胞DNA抽提供體純DNA剪切或PCR＋載體連接＋受體細(xì)胞DNA重組分子轉(zhuǎn)入重組子復(fù)制表達(dá)產(chǎn)品分離純化第10頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三基因工程的基本過程（1）從供體細(xì)胞中分離出基因組DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶分別將外源DNA（包括外源基因或目的基因）和載體分子切開（簡稱“切”）；第11頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三第12頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三（2）用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片斷接到載體上，形成DNA重組分子（簡稱“接”）；第13頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三（3）借助于細(xì)胞轉(zhuǎn)化手段將DNA重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞中（簡稱“轉(zhuǎn)”）；第14頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三（4）短時間培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以擴(kuò)增DNA重組分子或使其整合到受體細(xì)胞的基因組中（簡稱“增”）第15頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三（5）篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得使外源基因高效表達(dá)的基因工程菌或細(xì)胞（簡稱“檢”）；第16頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

可見，基因工程的上游操作過程可簡化為：“切、接、轉(zhuǎn)、增、檢”五步）；第17頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三Example：TransferoftheInsulin（胰島素）geneintoaplasmidvector第18頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

基因工程的六大步驟：一.目的基因的獲得；二.載體的制備；三.基因和載體的體外重組；四.重組基因的導(dǎo)入和重組子的檢測；五.克隆基因的表達(dá)；六.基因工程產(chǎn)物的檢測或分離第19頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三理論基礎(chǔ)不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)；基因是可切割的；基因是可以轉(zhuǎn)移的；多肽和基因之間存在對應(yīng)關(guān)系；遺傳密碼是通用的；基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳給下一代。第20頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三1.不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)基因是一個具有遺傳功能的特定核苷酸序列的DNA片段。第21頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)。地球上的一切生物，從細(xì)菌到高等動物和植物，直至人類，它們的基因都是一個具有遺傳功能的特定核苷酸序列的DNA片段。而所有生物的DNA的基本結(jié)構(gòu)都是一樣的。因此，不同生物的基因（DNA片段）原則上是可以重組互換的。雖然某些病毒的基因定位在RNA上，但是這些病毒的RNA仍可以通過反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。DNA并不影響不同基因的重組或互換。

A：肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

1944年美國微生物學(xué)家Avery，通過細(xì)菌（肺炎鏈球菌）轉(zhuǎn)化（有毒與無毒）研究確定了基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質(zhì)。

B：噬菌體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

1952年AlfredHershy和MarshaChase用標(biāo)記物的噬菌體（P32和S35）感染大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)只有P32標(biāo)記的DNA注入寄主細(xì)胞才能繁殖下一代進(jìn)一步證明遺傳物質(zhì)是DNA。第22頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三堿基的結(jié)構(gòu)A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鳥嘌呤C胞嘧啶U尿嘧啶第23頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三DNA的結(jié)構(gòu)第24頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三2.基因是可切割的限制性內(nèi)切酶（RestrictionEnzyme），如EcoRI，HindIII等。第25頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

基因直線排列在DNA分子上。除少數(shù)基因重疊排列外，大多數(shù)基因彼此之間存在著間隔序列。因此，作為DNA分子上一個特定核苷酸序列的基因，允許從DNA分子上一個一個完整地切割下來。即使是重疊排列的基因，也可以把指定的基因切割下來，盡管破壞了其他基因。第26頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

限制酶EcoR1識別與切割序列限制酶Pst1識別與切割序列第27頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三限制酶HindⅡ的識別與切割序列第28頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三限制性內(nèi)切酶常用限制性內(nèi)切酶種類及特性W.Arber和H.O.Smith第29頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

幾乎所有種類的原核生物都能產(chǎn)生限制酶。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能特性，可將限制酶分為三大類。其中Ⅰ類和Ⅲ類酶屬復(fù)合功能酶，它們的限制性核酸內(nèi)切活性及甲基化活性都作為亞基的功能單位包含在同一酶分子中，因此，嚴(yán)格地說應(yīng)該稱為限制-修飾酶。

Ⅱ類限制性核酸內(nèi)切酶與其所對應(yīng)的甲基化酶是分離的，不屬于同一酶分子，而且由于這類酶的識別切割位點(diǎn)特異，能產(chǎn)生固定的DNA片段，因此基因工程所用的限制酶都是Ⅱ類限制酶。第30頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三其它工具酶連接酶T4DNALigase1967修補(bǔ)工具酶DNA聚合酶I大片斷Klenow1971末端加工酶S1核酸酶，堿性磷酸單脂酶末端轉(zhuǎn)移酶人工加polyA或polyT尾反轉(zhuǎn)錄酶第31頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三幾種聚合酶特性比較第32頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三3.基因是可以轉(zhuǎn)移的

基因不僅是可以切割下來的，而且發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)有的基因可以在染色體DNA上移動，甚至可以在不同染色體間進(jìn)行跳躍，插入到靶DNA分子之中。4.多肽和基因之間存在對應(yīng)關(guān)系

現(xiàn)在普遍認(rèn)為，一種多肽就有一種相對應(yīng)的基因。因此，基因的轉(zhuǎn)移或重組可以根據(jù)其表達(dá)產(chǎn)物多肽的性質(zhì)來檢查。第33頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三5.遺傳密碼是通用的生命的語言第34頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三所謂“中心法則”，是指遺傳信息在細(xì)胞內(nèi)的生物大分子之間轉(zhuǎn)移或傳遞的基本法則。第35頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

遺傳密碼是通用的。一系列三聯(lián)密碼子（除極少數(shù)的幾個以外）同氨基酸之間的對應(yīng)關(guān)系，在所有生物中都是相同的。也就是說遺傳密碼是通用的，重組的DNA分子不管導(dǎo)人什么樣的生物細(xì)胞中，只要具備轉(zhuǎn)錄翻譯的條件，均能轉(zhuǎn)譯出原樣的氨基酸。即使人工合成的DNA分子（基因）同樣可以轉(zhuǎn)錄翻譯出相應(yīng)的氨基酸?，F(xiàn)在，基因是可以人工會成的。第36頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三6.基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳給下一代經(jīng)重組的基因一般來說是能傳代的，可以獲得相對穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因生物。第37頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三分子克隆載體第38頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

基因載體是一類能自我復(fù)制和功能基因表達(dá)的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影響其復(fù)制，可用以置換或插入外源(目的)DNA而將目的DNA帶入宿主細(xì)胞。第39頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三載體的分類：

從構(gòu)建載體的DNA來源分，有質(zhì)粒載體、病毒或噬菌體載體、質(zhì)粒DNA與病毒或噬菌體DNA組成的載體、以及質(zhì)粒DNA與染色體DNA片段組成的載體等。從功能方面它們可分為克隆載體和表達(dá)載體，表達(dá)載體又分胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)載體。從表達(dá)所用的受體細(xì)胞分，可分為原核細(xì)胞和真核細(xì)胞表達(dá)載體。

第40頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三基因載體應(yīng)具備的條件：①載體在細(xì)胞中必須能夠進(jìn)行獨(dú)立自主地復(fù)制，因此載體應(yīng)是一個獨(dú)立的復(fù)制子，具有復(fù)制起始序列，可在細(xì)胞中進(jìn)行有效擴(kuò)增；②載體必須具有若干限制酶的單一切割位點(diǎn)，便于外源DNA的插入。并且由于這些酶切位點(diǎn)位于載體復(fù)制的非必需區(qū)，故插入適當(dāng)大小外源DNA片段后載體仍然能夠進(jìn)行正常的復(fù)制；③載體必須具有可供選擇的遺傳標(biāo)記，例如具有抗生素的抗性基因，便于對陽性克隆的鑒別和篩選。第41頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三多克隆位點(diǎn)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記Amppolylinker基因載體第42頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三抗藥性標(biāo)志的選擇載體AmpTet插入片段Amp平板Tet平板第43頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三常規(guī)質(zhì)粒載體第44頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三質(zhì)粒(plasmid)

獨(dú)立于細(xì)菌染色體以外的具有獨(dú)立自主復(fù)制和調(diào)控能力的共價、閉合、環(huán)狀的雙股DNA分子（既cccDNA)。

Plasmidchromosome

第45頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三質(zhì)粒克隆載體的特性:

(1)具有獨(dú)立復(fù)制起點(diǎn)這是質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增的必要條件。

(2)具有較小的相對分子質(zhì)量相對分子量小有利于DNA的分離和操作，但也限制其克隆外源DNA片段的大小，一般不超過15kb。

(3)具有較高拷貝數(shù)每個細(xì)胞可含有10~200個拷貝的松弛型復(fù)制質(zhì)粒,使外源DNA得以大量擴(kuò)增。第46頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

(4)具有選擇性標(biāo)記如抗生素的抗性基因，便于對克隆基因的檢測和篩選。

(5)易于導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)?？赏ㄟ^轉(zhuǎn)化或電穿孔等方法極易被導(dǎo)入細(xì)胞。

(6)具有安全性作為載體的質(zhì)粒不具有轉(zhuǎn)移功能，防止帶有外源DNA的重組質(zhì)粒擴(kuò)散至實(shí)驗(yàn)室外，以免造成危害。第47頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三質(zhì)粒的構(gòu)建天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：

pSC101

8.8kb拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標(biāo)記基因TcrColE16.5kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因E1RSF2124ColE1衍生質(zhì)粒氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因Apr第48頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質(zhì)粒突變拷貝數(shù)控制基因拷貝數(shù)1000-3000擴(kuò)增基因低拷貝質(zhì)粒來自pSC101拷貝數(shù)小于10表達(dá)某些毒性基因溫敏質(zhì)粒在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測序質(zhì)粒含有測序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker整合質(zhì)粒裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn)便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒裝有針對兩種不同受體的復(fù)制子便于基因克隆表達(dá)質(zhì)粒裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒裝有報告基因便于啟動子等元件的克隆篩選第49頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

大腸桿菌質(zhì)粒pBR322是基因工程中最常用和最具代表性的質(zhì)粒，它是由Bolivar和Rogigerus等人于1977年構(gòu)建而成的，是一個典型的人工質(zhì)粒載體。

質(zhì)粒pBR322結(jié)構(gòu)第50頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三松弛型復(fù)制pBR322：氯霉素可擴(kuò)增

用于基因克隆第51頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三①

可插入外源DNA大小為5kb左右，外源DNA若超過10kb，質(zhì)粒在復(fù)制時就會變得不穩(wěn)定。②

它具有一個復(fù)制起點(diǎn)，是松弛型質(zhì)粒，故細(xì)胞中具有較高的拷貝數(shù)，每個細(xì)胞含有20~30個拷貝。當(dāng)加入氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個細(xì)胞可含有1000~3000個拷貝，大大有利于重組質(zhì)粒在細(xì)胞中的擴(kuò)增。第52頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三③

pBR322還具有兩種抗生素的抗性基因，一個是四環(huán)素抗性基因(Tetr)另一個是氨芐青霉素抗性基因(Ampr)。已知有24種主要限制酶在pBR322上都只有一個切點(diǎn)，其中有7種限制酶(E.coRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、XmaIII、NruI)的切點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因之內(nèi)，還有3種限制酶(ScaI、PvuI和PstI)的切點(diǎn)位于氨芐青霉素抗性基因之內(nèi)。第53頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三④

外源DNA的插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象，稱為插入失活(insertionalinactivation)。第54頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三λ噬菌體載體第55頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

噬菌體是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下,上述兩種狀態(tài)還會相互轉(zhuǎn)化。噬菌體的上述特性使得它們的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因?yàn)椋焊咝实母腥拘阅苁雇庠椿蚋咝?dǎo)入受體細(xì)胞自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增。第56頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三噬菌體生物學(xué)特性：噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。整合主要由l-DNA上的cI和int兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。人們可以根據(jù)需要改變l-DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶原狀態(tài)，或處于溶菌狀態(tài).DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)第57頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三噬菌體的CⅡ蛋白，它是噬菌體基因轉(zhuǎn)錄的激活子，抑制裂解功能基因的表達(dá)，催化噬菌體DNA整合到細(xì)菌的染色體中去。高濃度的CⅡ蛋白促進(jìn)溶源化，而低濃度CⅡ蛋白促進(jìn)裂解生長。當(dāng)CⅡ蛋白濃度足夠時，激活基因cⅠ和基因int

的表達(dá)，導(dǎo)致噬菌體DNA整合到宿主的染色體上。

第58頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三λ噬菌體的生活周期：裂解λ侵入細(xì)菌-獨(dú)立復(fù)制-裂解（沖破細(xì)胞膜）-再感染其他細(xì)菌。

第59頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三λ噬菌體從溶原轉(zhuǎn)為裂解是一種可誘導(dǎo)過程。誘導(dǎo)的因素可能很多，實(shí)驗(yàn)室常用的是熱誘導(dǎo):

分離得到某些λ噬菌體，在低溫時（30℃）建立溶原，用高溫（420C）則出現(xiàn)裂解。這些λ噬菌體的cl基因是溫度敏感突變型的，稱為c1ts。

λclts1857，可作為組件插入質(zhì)粒DNA內(nèi)。目的基因插在λclts857下游，重組體的目的基因在42℃表達(dá)，30℃不表達(dá)。這種方法稱為熱誘導(dǎo)表達(dá)，使用的是溫敏開關(guān)。λCIts857第60頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三l噬菌體結(jié)構(gòu)5’TCCAGCGGCGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’

COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l-DNA第61頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是功能相近的基因在基因組中聚集在一起。例如:

所有的編碼外殼蛋白的基因都聚集在左端1/3處；控制基因組整合到寄主基因的基因位于分子中央；右端是負(fù)責(zé)裂解宿主細(xì)胞、DNA自主復(fù)制以及調(diào)控的基因；相關(guān)基因的聚集對λ基因組的表達(dá)是非常重要的，這能夠使他們一起啟動或關(guān)閉，而不是單獨(dú)起作用。第62頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度

野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長度，可以提高裝載量。第63頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

其實(shí)野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體：插入型載體取代型載體第64頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三插入型載體(小于10kb)λgt11第65頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

取代型載體（20kb)第66頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三l-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記

與質(zhì)粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容比如插入型l-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記第67頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三加裝選擇標(biāo)記

imm434（噬菌體434免疫區(qū)段）Imm434基因編碼一種阻止l-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的l-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，l-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑。第68頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三加裝選擇標(biāo)記

lacZlacZ基因編碼b-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體l-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑。第69頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三取代型載體

Spi（sensitivetoP2interference）篩選：野生型λ噬菌體在帶有P2原噬菌體的溶原性E.coil的生長會受到限制的表型，即對P2噬菌體的干擾敏感。（這種生長抑制作用是受λ噬菌體red和gam這兩個基因編碼的產(chǎn)物控制的)。如果λ噬菌體缺少兩個參與重組的基因red和gam，則可以在P2溶原性E.coil中生長良好。

因此，通過λ噬菌體載體DNA上的red和/或gam基因的缺失或替換，可在P2噬菌體溶原性細(xì)菌鑒別重組和非重組λ噬菌體。

第70頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三R.Young和R.Davis設(shè)計(jì)的gt10和gt11是噬菌體克隆載體，可用于構(gòu)建cDNA文庫。一方面它們具有較高的克隆效率，1ngcDNA可產(chǎn)生5000個克隆，另一方面又可容納較大分子量的外源DNA片段。因?yàn)楹Y選噬菌斑在技術(shù)操作上較篩選細(xì)菌菌落更方便，因此gt10和gt11類載體在構(gòu)建文庫時優(yōu)于質(zhì)粒載體pBR322。第71頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三λgt10為43.3kb，在它的阻遏基因cI中有唯一的EcoRI位點(diǎn)，cDNA插入到gt10中可使噬菌體阻礙物基因（cI）失活。外源cDNA片段（<7.6kb）插入此處時，使cI基因失活，形成了重組的cI-噬菌體，噬菌斑為清亮斑，可與非重組的噬菌斑所產(chǎn)生的陰暗噬菌斑相區(qū)別。第72頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三gt11則沒有類似gt10載體的選擇作用，但它是蛋白質(zhì)表達(dá)的cDNA克隆載體。cDNA插入片段可表達(dá)成半乳糖苷酶—cDNA融合蛋白。gt11中cDNA插入片段是克隆在-半乳糖苷酶基因編碼區(qū)（lacZ）的羧基端，在含X-gal（5-溴-4氯-3-吲哚--D-半乳糖苷）的平板上，帶cDNA插入片段的gt11可形成清晰的無色噬菌斑，未帶cDNA插入片段的gt11則形成藍(lán)色噬菌斑。第73頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三λ-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn):1)λ-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效感染大腸桿菌

2)λ-DNA作為載體，其裝載外源DNA的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量

3)重組λ-DNA的篩選較為方便

4)重組λ-DNA分子的提取比質(zhì)粒容易第74頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三1)大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期

2)加入λ-噬菌體或重組λ-噬菌體懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時

3)用新鮮培養(yǎng)稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時

4)高速離心，沉淀噬菌體

5)苯酚抽提，釋放λ-DNA

6)乙醇或異丙醇沉淀DNA第75頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三λ噬菌體從溶原轉(zhuǎn)為裂解是一種可誘導(dǎo)過程。誘導(dǎo)的因素可能很多，實(shí)驗(yàn)室常用的是熱誘導(dǎo):

分離得到某些λ噬菌體，在低溫時（30℃）建立溶原，用高溫（420C）則出現(xiàn)裂解。這些λ噬菌體的cl基因是溫度敏感突變型的，稱為c1ts。

λclts1857，可作為組件插入質(zhì)粒DNA內(nèi)。目的基因插在λclts857下游，重組體的目的基因在42℃表達(dá)，30℃不表達(dá)。這種方法稱為熱誘導(dǎo)表達(dá)，使用的是溫敏開關(guān)。λCIts857第76頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三ori目的基因PL阻遏蛋白30℃下培養(yǎng)：第77頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三目的基因阻遏蛋白42℃下培養(yǎng)：失活第78頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

到目前為止，基因工程中使用的載體基本上均來自微生物，主要包括六大類：質(zhì)粒載體；

λ噬菌體載體；柯斯質(zhì)粒載體；

M13噬菌體載體；真核細(xì)胞的克隆載體；人工染色體等。第79頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三基因工程藥物制藥的主要程序:

⒈目的基因的克隆，⒉構(gòu)建DAN重組體，⒊DAN重組體轉(zhuǎn)入宿主菌，⒋構(gòu)建工程菌，⒌工程菌發(fā)酵，⒍表達(dá)產(chǎn)物的分離純化，⒎產(chǎn)品的檢驗(yàn)等。第80頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三目的基因的獲得

⒈mRNA的純化⒉cDNA第一鏈的合成⒊cDNA第二鏈的合成⒋cDNA的克?、祵⒅亟M體導(dǎo)入宿主細(xì)胞⒍cDNA文庫的鑒定⒎目的cDNA克隆的分離和鑒定第81頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

克隆真核基因常用方法：逆轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。

一、逆轉(zhuǎn)錄法逆轉(zhuǎn)錄法就是先分離純化目的基因的mRNA，在反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行cDNA的克隆表達(dá)。第82頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三第83頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三純化mRNA的原理和方法第84頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三合成cDNA雙鏈的第一步第85頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三合成cDNA雙鏈的第二步第86頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三BluntbyT4DNApolymerasecDNA雙鏈的接頭處理第87頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三第88頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三抗藥性標(biāo)記基因插入失活法Amps：氨芐青霉素抗性基因失活A(yù)mpr：氨芐青霉素抗性基因Tets：四環(huán)素抗性基因失活Tetr：四環(huán)素抗性基因第89頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三第90頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三cDNA雙鏈與插入型噬菌體載體及體外包裝第91頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三cDNA文庫的構(gòu)建過程第92頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三cDNA文庫是一個生物體在特定生長狀態(tài)下某個器官或組織中所有表達(dá)基因的集合，以cDNA重組子的克隆群表現(xiàn)。

cDNA插入片段小于10kb，可選質(zhì)粒載體，如大于10kb則應(yīng)選用噬菌體DNA為載體。第93頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三cDNA文庫的鑒定：根據(jù)重組體的表型進(jìn)行篩選，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑顏色改變法。第94頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三從cDNA文庫中分離特異的cDNA克隆，主要采用：（1）核酸探針雜交法。用層析和高分辨電泳等技術(shù)純化微克量的目的蛋白質(zhì)，根據(jù)目的蛋白質(zhì)純品的氨基酸序列分析結(jié)果，人工合成相應(yīng)的單鏈寡核苷酸作為探針，從cDNA文庫中分離特異cDNA克隆。（2）免疫反應(yīng)鑒定法。在既無可供選擇的基因表型特征，又無合適探針的情況下，本法是重要途徑。用表達(dá)型載體構(gòu)建的cDNA文庫，可用免疫學(xué)方法分組逐一鑒定各cDNA的表達(dá)產(chǎn)物，即以某種蛋白質(zhì)的抗體尋找相應(yīng)的特異cDNA克隆。第95頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

分離得到含有目的基因的陽性克隆后，必須對其作進(jìn)一步的驗(yàn)證和鑒定，主要是進(jìn)行限制酶圖譜的繪制、雜交分析、基因測序等。

1985，PCR發(fā)明以后，RT-PCR得到了廣泛的應(yīng)用。第96頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

二、化學(xué)合成法較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以用化學(xué)合成法合成。必須知道目的基因的核苷酸順序或目的蛋白質(zhì)的氨基酸順序。第97頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

用化學(xué)法合成目的基因DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進(jìn)行退火使連接成較長的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。第98頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

人工化學(xué)合成基因的限制有：⒈不能合成太長的基因。DNA合成儀所合成的寡核苷酸片段僅為50～60bp，因此只適用于克隆小分子肽的基因。第99頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三⒉遺傳密碼的簡并使選擇密碼子困難，用氨基酸順序推測核苷酸序列，得到的結(jié)果可能與天然基因不完全一致，易造成突變。⒊費(fèi)用高。第100頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞

基因的重組與轉(zhuǎn)移

第101頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三第102頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

DNA連接酶把相互靠近的5’端磷酸與3’-OH連到一起。第一節(jié)DNA片段的體外連接第103頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三1.兩段DNA的連接依靠粘性末端第104頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三2.DNA片斷與載體的連接依靠粘性末端第105頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三ligasenick第106頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)插入片斷與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。第107頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都產(chǎn)生GATC4個堿基的粘性末端。第108頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三2.DNA插入的方向正確用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI第109頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三3.插入基因的開放閱讀框（ORF）正確（1）DNA定向插入（2）起始密碼尤其當(dāng)載體上有ATG起始密碼的時候，更要注意。ATGGAATTC載體ATGCGGAATTCT插入片斷EcoRIEcoRIATGGAATTCT重組但移碼突變！第110頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三4.防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片斷的用量連接反應(yīng)體系中，插入片斷比載體多10倍以上。（2）用堿性磷酸酶處理載體載體切口的5’磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片斷以單鏈連接。5’3’載體插入片斷第111頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果第112頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三1.載體自身環(huán)化連接（能存活）2.載體之間互相連接（能存活）3.插入片段互相連接（不能存活）4.一個載體與幾個插入片段重組（能存活）5.幾個載體與一個插入片段重組（能存活）第113頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三1.目的第二節(jié)重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備第114頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三2.菌種使用喪失了限制體系的大腸桿菌。第115頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三①使用次黃嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，減少宿主菌的蛋白酶合成。②大腸桿菌的htpR基因突變減少蛋白酶的降解作用。③T4噬菌體的pin基因產(chǎn)物能抑制細(xì)菌的蛋白酶,可把pin增加到載體上。使用突變菌株，減少宿主菌本身的蛋白酶的表達(dá)。保護(hù)外源蛋白不被降解第116頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。3.制備原理第117頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三4.制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃離心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的60mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重懸第118頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（1）轉(zhuǎn)化（transformation)大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過程。（3）轉(zhuǎn)染（transfection)真核細(xì)胞捕獲DNA的過程。外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的幾種方法（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。第119頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三轉(zhuǎn)化率：每gDNA轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌克隆數(shù)。轉(zhuǎn)化方法簡單，但轉(zhuǎn)化效率不高（106-108/gDNA）。（1）熱休克法（heatshock）轉(zhuǎn)化效率高（高于109/gDNA）。（2）電轉(zhuǎn)化法第120頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三10ng載體DNA100L感受態(tài)菌Onice混合，靜置10分鐘42oC1分鐘加入1mLLB培養(yǎng)基37℃搖1小時10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱休克法第121頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2°C離心集菌冰冷的水重懸菌體2°C離心集菌冰冷的水重懸菌體2°C離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成50-300L電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25F脈沖控制器200-4000.5g質(zhì)粒DNAOnice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37°C中速震蕩60分鐘10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化（2）電轉(zhuǎn)化法第122頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌10-100L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37℃過夜第123頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三環(huán)形重組質(zhì)粒質(zhì)粒自我連接線性載體或DNA片斷進(jìn)入細(xì)菌會被降解。①環(huán)形質(zhì)粒數(shù)（1）重組質(zhì)粒影響轉(zhuǎn)化率的因素第124頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三①生長狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對數(shù)生長期的菌。②必須在冰冷的條件下制備。要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜失去一些蛋白。④儲存感受態(tài)菌要在-70℃以下③CaCl2處理⑤使用感受態(tài)菌時必須迅速融化融化后一般不能再次凍存使用。（2）感受態(tài)細(xì)胞（competentcells)第125頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三cDNA雙鏈與插入型噬菌體載體及體外包裝體外包裝的噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)第126頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三把重組的噬菌體DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。（1）體外包裝（invitropackaging）（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）通過受體菌細(xì)胞表面的DNA接受器位點(diǎn)（receptorsite)，使帶有外源基因的重組體DNA注入受體大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增。第127頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三cI857基因是個溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細(xì)菌后，在32℃下培養(yǎng)細(xì)菌時能夠保持溶源性。

（3）cI857基因突變的噬菌體

但當(dāng)溫度升高到44℃-45℃時，就會導(dǎo)致cI基因編碼的阻遏蛋白失活，DNA復(fù)制、外殼蛋白合成。便于提取外殼蛋白。第128頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三(4)體外包裝過程第129頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，使受體菌發(fā)生溶菌，形成噬菌斑。（每gDNA能形成106噬菌斑）。（5）轉(zhuǎn)導(dǎo)第130頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三基因表達(dá)

基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。第131頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

基因工程中基因高效表達(dá)研究是指外源基因在某種細(xì)胞中的表達(dá)活動，即剪切下外源基因片段，拼接到另一個基因表達(dá)體系中，使其能獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物。第132頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

適合目的基因表達(dá)的宿主細(xì)胞應(yīng)滿足以下要求:

容易獲得較高濃度的細(xì)胞；能利用易得廉價原料；不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；第133頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

發(fā)熱量低、需氧低；容易進(jìn)行代謝調(diào)控；容易進(jìn)行DNA重組技術(shù)操作；產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，產(chǎn)物容易提取純化。第134頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

宿主細(xì)胞分為兩大類：第一類為原核細(xì)胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等；第二類為真核細(xì)胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細(xì)胞等。第135頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三基因在原核細(xì)胞的表達(dá)⒈原核細(xì)胞⑴大腸桿菌

因?yàn)榇竽c桿菌的分子遺傳學(xué)研究深入，生長迅速，所以目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達(dá)體系。

第136頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三優(yōu)點(diǎn)：全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善，具有各種載體和適用于表達(dá)生產(chǎn)蛋白的各種方法繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物第137頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三缺點(diǎn)：1大腸桿菌中的表達(dá)不存在信號肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難。信號肽：能帶領(lǐng)蛋白穿過膜到達(dá)周質(zhì)。但以后需要正確切割掉。一般位于N端。細(xì)胞周質(zhì)（格蘭氏陰性大腸桿菌位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分）。第138頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三信號肽(signalpeptide):(1)在真核生物未成熟分泌性蛋白質(zhì)中,可被細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)識別的特征性氨基酸序列,

約15-30AA(含疏水AA較多)。(2)作用：把合成的蛋白質(zhì)移向粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜

(3)信號肽對靶向輸送有決定作用。

第139頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

信號肽的一級結(jié)構(gòu)第140頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三2因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包涵體。

包涵體：是存在于細(xì)胞質(zhì)中（某些條件下也在細(xì)胞周質(zhì)中形成）的一種不溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。尤其當(dāng)表達(dá)目的蛋白量超過細(xì)菌體總蛋白量10%時，就很容易形成包涵體。第141頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

使重組蛋白易于分離、免受蛋白酶降解、不損害寄主細(xì)胞?；厥盏牡鞍咨锘钚圆睿臻g構(gòu)象的錯誤）。表達(dá)產(chǎn)物需經(jīng)變性復(fù)性才恢復(fù)活性。②缺點(diǎn)①優(yōu)點(diǎn)第142頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三外源蛋白在大腸桿菌中的積累第143頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三高表達(dá)產(chǎn)生的積聚物在細(xì)胞內(nèi)部形成不溶物原因？①蛋白過量積聚，超過溶解度，導(dǎo)致沉淀；②蛋白生成太快，分子間疏水基團(tuán)相互作用而聚集沉淀；③蛋白生成太快，分子內(nèi)部二硫鍵的錯誤連接導(dǎo)致沉淀；④表達(dá)蛋白過多，與其結(jié)合/誘導(dǎo)組分不足，不能形成溶解狀態(tài)⑤蛋白質(zhì)自身不穩(wěn)定。第144頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三基因工程包涵體的純化方法收集菌體細(xì)胞細(xì)胞破碎包涵體的洗滌目標(biāo)蛋白的變性溶解目標(biāo)蛋白的復(fù)性包含體的出現(xiàn)不僅增加了生物分離設(shè)計(jì)的難度，也為蛋白質(zhì)折疊機(jī)理研究提出了新的課題。欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。第145頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三1）包涵體的洗滌細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密。洗滌的重要性：收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質(zhì)，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復(fù)性時會與目標(biāo)蛋白一起復(fù)性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來困難。洗滌劑：溫和的表面活性劑、蔗糖、低濃度的弱變性劑（如尿素）或脫氧膽酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂質(zhì)類雜質(zhì)。洗滌劑濃度以溶解雜質(zhì)，不溶解包涵體中表達(dá)產(chǎn)物為原則。第146頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三2）目標(biāo)蛋白的變性溶解

包涵體中不溶性的目標(biāo)蛋白必須溶解到液相中，才能進(jìn)一步純化。一般水溶液很難將其溶解，只有采用蛋白質(zhì)變性才能使其形成可溶性的形式。常用變性劑：▲

5-8mol/L鹽酸胍和6-8mol/L尿素,作用：破壞離子間相互作用；▲

表面活性劑如1-2％SDS（十二烷基硫酸鈉），作用：破壞蛋白質(zhì)肽鏈間的疏水相互作用?！?/p>

PH>9.0的堿溶液和有機(jī)溶劑，使用較少。影響變性因素：時間、pH、離子強(qiáng)度、變性劑種類和濃度。第147頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三原理：在變性劑溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)被破壞，但一級結(jié)構(gòu)和共價鍵沒有破壞。當(dāng)部分變性劑被除去后，蛋白質(zhì)會重新折疊成具有活性的正確構(gòu)型，該過程稱復(fù)性。復(fù)性方法：稀釋法除變性劑－加入大量水或緩沖液。膜分離法除變性劑－透析、超濾、電滲析。層析法：凝膠層析，高效疏水層析P64----------3）目標(biāo)蛋白的復(fù)性第148頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三149包含體產(chǎn)物分離工藝（牛生長激素分離提?。┑?49頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

來自發(fā)酵罐的菌體經(jīng)過離心除去培養(yǎng)液后加入緩沖液懸浮，通入高壓勻漿器反復(fù)破碎三次。勻漿經(jīng)過離心和水洗除去細(xì)胞碎片，再添加溶菌酶、EDTA和促進(jìn)劑以除去脂蛋白和未破碎的細(xì)胞。包含體經(jīng)離心沉淀和水洗后進(jìn)行變性溶解，溶解劑為6mol/L鹽酸胍。溶解的同時通入空氣氧化以打斷錯誤連接的雙硫鍵。離心除去沉淀，含變性蛋白質(zhì)的上清液經(jīng)超濾濃縮后過凝膠柱除去雜蛋白，再加入復(fù)性緩沖液進(jìn)行透析復(fù)性。復(fù)性過程中產(chǎn)生的絮凝沉淀用離心除去。包含體產(chǎn)物分離工藝

（牛生長激素分離提?。┑?50頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三（1）O-糖基化（Ser,Thr）蛋白質(zhì)糖基化增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和某些特殊性質(zhì)。糖基3蛋白質(zhì)不能糖基化第151頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三（2）N-糖基化（Asn）Dol：長醇Mannose：甘露糖Glucose：葡萄糖N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖第152頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

因沒有真核翻譯后加工的功能，表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，不能進(jìn)行糖基化、磷酸化等修飾，難以形成正確的二硫鍵配對和空間構(gòu)像折疊，因而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)常沒有足夠的生物學(xué)活性。第153頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三核糖體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體細(xì)胞膜合成肽鏈折疊、組裝糖基化運(yùn)輸濃縮加工運(yùn)輸外排線粒體供能第154頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三翻譯后加工一級結(jié)構(gòu)的修飾:N-端Met(fMet)去除二硫鍵的形成個別氨基酸的修飾蛋白質(zhì)前體中不必要肽段的切除多蛋白的加工羥化作用:羥脯氨酸羥賴氨酸酶活性中心的磷酸化分泌性蛋白一條合成后的多肽鏈經(jīng)加工產(chǎn)生多種不同活性的蛋白質(zhì)/多肽第155頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三信號肽顆粒識別、結(jié)合胞漿

帶有信號肽的分泌蛋白粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通道識別信號肽酶切除信號肽肽鏈合并高爾基體進(jìn)一步加工分泌出胞外帶有信號肽的分泌性蛋白的加工、分泌的過程第156頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三第157頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三胰島素的加工過程第158頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三●多蛋白的加工

一條合成后的多肽鏈經(jīng)加工產(chǎn)生多種不同活性的蛋白質(zhì)/多肽第159頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三4產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多余一個甲硫氨酸殘基，易引起免疫反應(yīng)。5細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素，其內(nèi)毒素很難除去。6沒有真核轉(zhuǎn)錄后加工的功能，不能進(jìn)行mRNA的剪接，所以只能表達(dá)cDNA而不能表達(dá)真核的基因組基因。第160頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三⑵枯草芽胞桿菌分泌能力強(qiáng)，蛋白質(zhì)不形成包含體。產(chǎn)物蛋白質(zhì)不能糖基化。有很強(qiáng)的胞外蛋白酶對產(chǎn)物降解。第161頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三⑶鏈霉菌作為外源性基因表達(dá)受到重視。不致病、使用安全、分泌能力強(qiáng)、表達(dá)產(chǎn)物可糖基化。第162頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三大腸桿菌中的基因表達(dá)第163頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)載體必須具備條件：⑴載體能夠獨(dú)立復(fù)制。⑵應(yīng)具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記，以利于外源基因的克隆鑒定和篩選。第164頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三松弛型復(fù)制pBR322：氯霉素可擴(kuò)增拷貝數(shù)50-100/cell

用于基因克隆第165頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三pUC18/19：拷貝數(shù)2000-3000/cell用于基因克隆和測序裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’第166頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三⑶應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動子，能為大腸桿菌RNA聚合酶所識別。⑷應(yīng)具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。第167頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三⑸應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，只轉(zhuǎn)錄克隆的基因，所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。⑹所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號AUG和SD序列，以便轉(zhuǎn)錄后順利翻譯。第168頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三核糖體結(jié)合位點(diǎn)大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個特征結(jié)構(gòu)要素：位于翻譯起始密碼子上游的6-8個核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯；翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點(diǎn)，但有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子；

SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成；基因編碼區(qū)5’

端若干密碼子的堿基序列

第169頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

pBV220是我國科學(xué)工用者自己構(gòu)建的表達(dá)載體，使用了很強(qiáng)的PRPL雙啟動子，含有編碼溫度敏感性阻遏蛋白的cI857基因(在30-32℃時產(chǎn)生的阻遏蛋白能阻止PRPL的轉(zhuǎn)錄起始，細(xì)菌可以正常生長繁殖，42℃時該阻遏蛋白發(fā)生構(gòu)像變化而失活，基因開始轉(zhuǎn)錄而表達(dá)。)常用表達(dá)載體

⑴pBV220系統(tǒng)質(zhì)粒pBV220的結(jié)構(gòu)第170頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三pBV220系統(tǒng)國內(nèi)使用最多的載體,其組成:①來源于pUC8多克隆位點(diǎn)②核糖體rrnB基因終止信號③pBR322第4225～3735位④pUC18第2066～680位⑤λ噬菌體cIts857抑制子基因及PR啟動子⑥pRC23的PL啟動子及SD序列第171頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三pBV220系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：1PR和PL啟動子串聯(lián)，可以增強(qiáng)啟動作用；2強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止信號可防止出現(xiàn)“通讀”現(xiàn)象，有利于質(zhì)粒-宿主系統(tǒng)的穩(wěn)定；第172頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三3.SD序列緊跟多克隆位點(diǎn)，便于插入帶起始ATG的外源基因，可表達(dá)非融合蛋白；4整個質(zhì)粒僅為3.66kb，有利于增加其拷貝數(shù)及容量，可以插入大片段外源基因；第173頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三5cIts857抑制子基因與PL啟動子同在一個載體上，可以轉(zhuǎn)化任何菌株，以便選用蛋白酶活性較低的宿主細(xì)胞，使表達(dá)產(chǎn)物不易降解。本系統(tǒng)為溫度誘導(dǎo)，外源基因表達(dá)量可達(dá)細(xì)胞總蛋白的20%～30%；本系統(tǒng)宿主菌可以是大腸桿菌HB101、JM103、C600，質(zhì)粒拷貝數(shù)較多，因此小量簡便快速提取即可滿足需要。產(chǎn)物以包含體形式存在。第174頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

pBG-2是由pBV220系統(tǒng)衍生的便于產(chǎn)物純化的融合表達(dá)載體。該質(zhì)粒在PRPL啟動子下游插入proteinG的IgGFc結(jié)合區(qū)基因片段180個堿基對，下游是多克隆位點(diǎn)，引入剪切融合蛋白的切點(diǎn)，具有與IgG結(jié)合的活性，可方便的在分離中用固定化的IgG進(jìn)行親和層析，簡化下游處理工藝。融合表達(dá)質(zhì)粒pBG-2的結(jié)構(gòu)第175頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式（1）以非融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因

非融合蛋白指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。優(yōu)點(diǎn)：保持原有蛋白活性；缺點(diǎn)：易被蛋白酶破壞。第176頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三（2）以融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因

除了直接表達(dá)異源蛋白外，還可將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，并作為一個開放型閱讀框架進(jìn)行表達(dá)。由這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。在這種融合蛋白結(jié)構(gòu)中，通常受體細(xì)菌的蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端。

第177頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn):目的蛋白穩(wěn)定性高

尤其對分子量較小的多肽效果更佳目的蛋白易于分離

利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進(jìn)行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白目的蛋白表達(dá)率高

與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件目的蛋白溶解性好

由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性目的蛋白需要回收

融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲目的蛋白。在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段第178頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原則：1.能高效表達(dá)，且其表達(dá)產(chǎn)物可以通過親和層析進(jìn)行特異性簡單純化。2.外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下，并不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因，目的是盡可能避免融合蛋白分子中兩種組份的分子量過于接近，為目的蛋白分離回收創(chuàng)造條件。第179頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三3.兩個蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架4.兩個結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)十分重要，它直接決定著融合蛋白的裂解工藝第180頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

通過在DNA水平上人工設(shè)計(jì)引入的蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn)，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白。第181頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三目的蛋白的回收

融合蛋白中受體蛋白部分的存在可能會影響目的蛋白的空間構(gòu)象和生物活性，如果將之注入人體還會導(dǎo)致免疫反應(yīng)，因此在制備和生產(chǎn)藥用目的蛋白時，將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位點(diǎn)專一性斷裂方法有兩種：

化學(xué)斷裂法酶促裂解法

第182頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

用于蛋白位點(diǎn)專一性化學(xué)斷裂的最佳試劑為溴化氰（CNBr）它與多肽鏈中的甲硫氨酸殘基側(cè)鏈的硫醚基反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作用下肽鍵斷裂，形成兩個多肽降解片段，其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基，而下游肽段N端的第一位氨基酸殘基保持不變。化學(xué)斷裂法：第183頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

這一方法的優(yōu)點(diǎn)是回收率高（可達(dá)到85%以上），專一性強(qiáng)，而且所產(chǎn)生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，與真核生物細(xì)胞中的成熟表達(dá)產(chǎn)物較為接近。然而，如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法。第184頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三啟動子受體基因接頭目的基因MetArgStopLysGluIle-Glu-gly-ArgArgLysGluIle-Glu-gly-Arg表達(dá)親和層析酶解回收酶促裂解法凝血酶，腸激酶等第185頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三人胰島素分子第186頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三人胰島素在大腸桿菌中的表達(dá)溴化氰Cyanogenbromide：第187頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三⑶分泌型表達(dá)蛋白藥物基因關(guān)鍵的編碼分泌信號肽基因取自于大腸桿菌中分泌蛋白的基因ompa(外膜蛋白基因）。優(yōu)點(diǎn)：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不含甲硫氨酸殘基；缺點(diǎn)：產(chǎn)量不高。第188頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

如若將外源基因與大腸桿菌的信號肽(ompa)編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達(dá)，其N端的甲硫氨酸殘基便可在信號肽的剪切過程中被有效除去。第189頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制原核細(xì)菌周質(zhì)中含有多種分子伴侶可阻止分泌蛋白的隨機(jī)折疊，分泌在細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中的重組蛋白很少形成分子間的二硫鍵交聯(lián)，因此與包涵體相比，分泌型重組蛋白具有較高比例的正確構(gòu)象，生物活性的回收率增加，且對蛋白酶不敏感

第190頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三重組大腸桿菌--目的蛋白完全分泌分泌型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建有些G-能將細(xì)菌的抗菌蛋白（細(xì)菌素）分泌到培養(yǎng)基中,這一過程嚴(yán)格依賴于細(xì)菌素釋放蛋白

,它激活定位于內(nèi)膜上的磷酸酯酶,導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)外膜的通透性增大。將細(xì)菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個合適的質(zhì)粒上攜帶大腸桿菌信號肽編碼序列和目的基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞完全分泌型受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化bacteriocin第191頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

相對其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)，少數(shù)外源基因既便能分泌表達(dá)，但其表達(dá)率通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍。第192頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三

在大腸桿菌中表達(dá)的異源蛋白按其在細(xì)胞中的定位可分為兩種形式：即以可溶性或不溶性（包涵體）狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中；或者通過運(yùn)輸或分泌方式定位于細(xì)胞周質(zhì)，甚至穿過外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。

第193頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素

外源基因表達(dá)產(chǎn)量與細(xì)胞濃度和細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)量呈正相關(guān)。單個細(xì)胞產(chǎn)量取決于：

⑴外源基因的拷貝數(shù)增加載體的拷貝數(shù)會增加轉(zhuǎn)錄出的mRNA數(shù)目，增加表達(dá)效率。但過度的外源基因的表達(dá)會影響宿主的正常生長。第194頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三⑵

外源基因的表達(dá)效率①啟動子的強(qiáng)弱②轉(zhuǎn)譯起始序列對表達(dá)效率的影響③SD序列和起始密碼ATG的間距④密碼子組成⑤核糖體接合位點(diǎn)的有效性：消除核糖體及其附近的潛在二級結(jié)構(gòu)第195頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三5’-TTGACA-3’5’-TATAAT-3’①-35box②-10box（PribnowBox）1.啟動子的結(jié)構(gòu)對表達(dá)效率的影響RNA聚合酶σ亞基的識別位點(diǎn)（1）一致順序第196頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三（3）-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離間隔為17bp時，啟動子最強(qiáng)。（2）-35區(qū)和-10區(qū)的堿基順序越接近一致順序，啟動子越強(qiáng)。5’-TTGACATATAAT一致順序lactrpPLrecAtacItacII5’-TTTACATATGTT5’-TTGACATTAACT5’-TTGACAGATACT5’-TTGATATATAAT5’-TTGACATATAAT5’-TTGACATTTAAT-35box-10box第197頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三RNA聚合酶同啟動子結(jié)合的區(qū)域稱為啟動子區(qū)。將各種原核基因同RNA聚合酶全酶結(jié)合后，用DNase水解DNA，最后得到與RNA聚合酶結(jié)合而未被水解的DNA片段，這些片段有一個由5個核苷酸(TATAA)組成的共同序列，以其發(fā)現(xiàn)者的名字命名為Pribnow框(Pribnowbox)，這個框的中央位于起點(diǎn)上游10bp處，所以又稱-10序列(-10sequence)，后來在-35bp處又找到另一個共同序列(TTGACA)。

離開共同順序較遠(yuǎn)的啟動子的活性亦較弱第198頁，講稿共232頁，2023年5月2日，星期三Hogness等在真核基因中又發(fā)現(xiàn)了類似Pribnow框的共同序列，即位于-25～-30bp處的TATAAAAG，也稱TATA框(TATAbox