生物學(xué)案（蘇教版）第十單元第6課時基因工程的基本工具和基本操作程序

第6課時基因工程的基本工具和基本操作程序課標(biāo)要求1.闡明DNA重組技術(shù)的實現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物的檢測鑒定等步驟。3.按照實驗操作步驟，進(jìn)行DNA的粗提取與鑒定實驗。4.利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟件進(jìn)行虛擬PCR實驗?？键c一基因工程的基本操作工具1．基本工程的概念(1)供體：提供________________。(2)操作環(huán)境：________。(3)操作水平：________水平。(4)原理：________________________________________________________________________________________________________________________________________。(5)受體：表達(dá)目的基因。(6)本質(zhì)：性狀在__________________________體內(nèi)的表達(dá)。拓展基因工程的理論基礎(chǔ)

2.重組DNA技術(shù)的基本工具(1)限制性內(nèi)切核酸酶(也稱“限制酶”)(2)DNA連接酶(3)載體延伸應(yīng)用圖解限制酶的選擇原則(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標(biāo)記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶?？枷蚧蚬こ痰幕竟ぞ?．下表為常用的限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)及其識別序列和切割位點，由此推斷，下列說法錯誤的是()限制酶名稱識別序列和切割位點限制酶名稱識別序列和切割位點BamHⅠG↓GATCCKpnⅠGGTAC↓CEcoRⅠC↓AATTCSau3AⅠ↓GATCHindⅡGTY↓RACSmaⅠCCC↓GGG注：Y為C或T，R為A或G。A．HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶切割后形成平末端B．Sau3AⅠ限制酶的切割位點在識別序列的外部C．BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制酶切割后形成相同的黏性末端D．一種限制酶一定只能識別一種核苷酸序列2．(多選)第三代疫苗——DNA疫苗是指將編碼保護(hù)性抗原蛋白的基因(如圖甲)插入到適宜的質(zhì)粒(如圖乙)中得到的重組DNA分子，將其導(dǎo)入人體內(nèi)，在人體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的產(chǎn)物可直接誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答，且可持續(xù)一段時間。限制性內(nèi)切核酸酶的切點分別是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析錯誤的是()A．構(gòu)建DNA疫苗時，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒B．圖乙中只用EcoRⅠ切割后的質(zhì)粒，含有1個游離的磷酸基團(tuán)C．用EcoRⅠ切割目的基因和質(zhì)粒，再用DNA連接酶連接，只產(chǎn)生1種連接產(chǎn)物D．抗原基因在體內(nèi)表達(dá)時不需要解旋酶3．下列有關(guān)基因工程中載體的說法，正確的是()A．在進(jìn)行基因工程操作中，被用作載體的質(zhì)粒都是天然質(zhì)粒B．所有的質(zhì)粒都可以作為基因工程中的載體C．質(zhì)粒是一種獨立于細(xì)菌染色體外的鏈狀DNA分子D．作為載體的質(zhì)粒DNA分子上應(yīng)有對重組DNA進(jìn)行鑒定和選擇的標(biāo)記基因考點二基因工程的基本操作程序1．目的基因的獲取(1)化學(xué)合成法直接人工合成目的基因：一般為比較小的目的基因。(2)基因文庫獲取目的基因：來源可分為____________文庫和________文庫。①基因組文庫：指含有某種生物體__________基因片段的____________的克隆群體。從基因組文庫中篩選某種目的基因，一般采用________________。②cDNA文庫：從組織細(xì)胞中提取__________，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)化宿主，包含著細(xì)胞全部________________________克隆集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫。2．基因表達(dá)載體的構(gòu)建(1)目的：使目的基因進(jìn)入________________________________________________。(2)基因表達(dá)載體的組成及作用(3)構(gòu)建過程易錯提醒啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號(編碼氨基酸)翻譯的結(jié)束信號(不編碼氨基酸)3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞生物種類植物哺乳動物微生物常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法處理法受體細(xì)胞原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA中→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上→表達(dá)取卵→將含有目的基因的表達(dá)載體注入→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細(xì)胞→細(xì)胞處于一種容易接受外來DNA的生理狀態(tài)→基因表達(dá)載體導(dǎo)入辨析(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的____________上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細(xì)胞的______________________上；第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入______________，第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA導(dǎo)入__________________。(2)農(nóng)桿菌特點①能在自然條件下感染___________和________________，而對大多數(shù)____________________沒有感染能力。②農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有__________________，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T－DNA轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。4．目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物的檢測鑒定考向基因工程的基本操作程序4．戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，ORF2基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白(pORF2)位于病毒表面，構(gòu)成病毒的衣売。我國科研人員利用基因工程技術(shù)，在大腸桿菌中表達(dá)pORF2，制備戊型肝炎疫苗，過程如圖。下列關(guān)于該疫苗的敘述，正確的是()A．過程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、CB．重組基因表達(dá)載體上的啟動子需來源于戊型肝炎病毒C．過程⑤需要用聚乙二醇處理大腸桿菌使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)D．過程⑥大量制備pORF2蛋白前應(yīng)做相應(yīng)的檢測與鑒定5．下列有關(guān)基因表達(dá)載體的敘述，不正確的是()A．具有復(fù)制原點，使目的基因能在受體細(xì)胞內(nèi)擴增B．具有啟動子，作為多肽鏈合成的起始信號C．具有標(biāo)記基因，有利于目的基因的初步檢測D．具有目的基因，以獲得特定的基因表達(dá)產(chǎn)物6．(2021·全國乙，38)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中要使用多種工具酶，其中4種限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點如圖所示?；卮鹣铝袉栴}：(1)常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶，上圖中____________酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接，上圖中______________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是____________。(3)DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能______________；質(zhì)粒DNA分子上有_____________________，________________________便于外源DNA的插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是___________________________________________________________________________________。(4)表達(dá)載體含有啟動子，啟動子是指________________________________________________________________________________________________________________。

考點三PCR技術(shù)、電泳鑒定及DNA的粗提取和鑒定1．PCR技術(shù)(1)過程變性：94℃條件下受熱________后解鏈為單鏈↓退火：55℃條件下，________與單鏈相應(yīng)互補序列↓結(jié)合延伸：72℃條件下在________作用下合成子鏈思考分析①在PCR過程中實際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作為合成________________的原料，又可為DNA的合成提供________。②引物既可以是DNA單鏈，也可以為________。細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行復(fù)制時，也需要________，一般為RNA片段。③真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要________激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加______________________。④PCR擴增過程中的循環(huán)圖示與規(guī)律循環(huán)次數(shù)123nDNA分子數(shù)2含引物A(或B)的DNA分子數(shù)1同時含引物A、B的DNA分子數(shù)0＝21－2共消耗的引物數(shù)量2＝21＋1－26＝22＋1－214＝23＋1－22n＋1－2(2)PCR技術(shù)和DNA復(fù)制的比較(3)DNA的電泳鑒定2．DNA的粗提取和鑒定(1)基本原理①原理：利用DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。②DNA的性質(zhì)：DNA不溶于________，但某些蛋白質(zhì)溶于_______；DNA能溶于2mol·L－1的________。③DNA的鑒定：在一定溫度下，DNA遇____________試劑會呈現(xiàn)藍(lán)色。(2)過程考向一PCR技術(shù)及電泳鑒定7．(多選)(2023·江蘇南京高三模擬)大引物PCR定點突變常用來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的功能變化。單核苷酸的定點誘變僅需進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)即可獲得，第一輪加誘變引物和側(cè)翼引物，第一輪產(chǎn)物作第二輪PCR擴增的大引物，過程如圖所示。下列有關(guān)敘述錯誤的是()A．PCR擴增的定點誘變產(chǎn)物通常需要連接到載體分子上才能表達(dá)出相應(yīng)的性狀，需具備啟動子、終止子等結(jié)構(gòu)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯B．單核苷酸的定點誘變所屬變異類型為基因重組C．第二輪PCR所用的引物都是第一輪PCR產(chǎn)物DNA的兩條鏈D．利用該技術(shù)將某功能蛋白的結(jié)構(gòu)改變屬于蛋白質(zhì)工程8．利用PCR可以在體外進(jìn)行DNA片段的擴增，下列有關(guān)“利用PCR技術(shù)擴增DNA片段并完成電泳鑒定”實驗的相關(guān)敘述，錯誤的是()A．PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理B．PCR利用了DNA的熱變性原理C．PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化D．在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換考向二DNA的粗提取和鑒定9．下列有關(guān)“DNA粗提取和鑒定”實驗的敘述，正確的是()A．新鮮豬血、菜花等動植物材料均可用于DNA的粗提取B．選用洋蔥作為實驗材料時可以使用吸水漲破法破壞細(xì)胞C．DNA可溶于蒸餾水，也可溶于2mol/L的NaCl溶液D．溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺試劑后，顏色呈紫色1．(2019·江蘇，10)下列關(guān)于DNA粗提取和鑒定的敘述，錯誤的是()A．用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近B．DNA析出過程中，攪拌操作要輕柔以防DNA斷裂C．預(yù)冷的酒精可用來進(jìn)一步純化粗提的DNAD．用二苯胺試劑鑒定DNA需要進(jìn)行水浴加熱2．(2020·北京，12)為了對重金屬污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動子連接，導(dǎo)入楊樹基因組中(如圖)。為檢測獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因，同時避免內(nèi)源HMA3基因的干擾，在進(jìn)行PCR擴增時，應(yīng)選擇的引物組合是()A．①＋③ B．①＋②C．③＋② D．③＋④3．(2020·浙江7月選考，24)下列關(guān)于基因工程的敘述，正確的是()A．若受體大腸桿菌含有構(gòu)建重組質(zhì)粒時用到的限制性內(nèi)切核酸酶，則一定有利于該重組質(zhì)粒進(jìn)入受體并保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定B．抗除草劑基因轉(zhuǎn)入某抗鹽植物獲得2個穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)基因品系，抗性鑒定為抗除草劑抗鹽和抗除草劑不抗鹽。表明一定是抗鹽性的改變與抗除草劑基因的轉(zhuǎn)入無關(guān)C．抗除草劑基因轉(zhuǎn)入某植物獲得轉(zhuǎn)基因植株，其DNA檢測均含目的基因，抗性鑒定為抗除草劑和不抗除草劑。表明一定是前者表達(dá)了抗性蛋白而后者只表達(dá)抗性基因RNAD．已知不同分子量DNA可分開成不同條帶，相同分子量的為一條帶，用某種限制性內(nèi)切核酸酶完全酶切環(huán)狀質(zhì)粒后，出現(xiàn)3條帶。表明該質(zhì)粒上一定至少有3個被該酶切開的位置4．(2020·江蘇，33)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如下圖(以EcoRⅠ酶切為例)：請據(jù)圖回答問題：(1)步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種______________酶，它通過識別特定的______________切割特定位點。(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′－羥基與5′－磷酸間形成________________；PCR循環(huán)中，升溫到94℃是為了獲得________________；Taq酶的作用是催化________________。(3)若下表所列為已知的DNA序列和設(shè)計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是________(從引物①②③④中選擇，填編號)。DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′(4)對PCR產(chǎn)物測序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結(jié)果正確的是________。A．5′－AACTATGCG……AGCCCTT－3′B．5′－AATTCCATG……CTGAATT－3′C．5′－GCAATGCGT……TCGGGAA－3′D．5′－TTGATACGC……CGAGTAC－3′5.(2022·江蘇，24)纖毛是廣泛存在的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，功能異?？梢鸲喾N疾病。因此，研究纖毛形成的作用機制具有重要意義。請回答下列問題：(1)纖毛結(jié)構(gòu)如圖Ⅰ所示，由細(xì)胞質(zhì)膜延伸形成的纖毛膜主要由________________組成?；w由中心體轉(zhuǎn)變而來，中心體在有絲分裂中的功能是____________________________________________________________________________________________________。(2)某病人腎小管上皮細(xì)胞纖毛異常，為了分析纖毛相關(guān)基因X是否發(fā)生了變異，對基因X進(jìn)行了PCR擴增與產(chǎn)物測序。從細(xì)胞樣品中分離DNA時，可通過交替調(diào)節(jié)鹽濃度將與核蛋白結(jié)合的DNA分離出來，溶液中添加NaCl至mol/L的目的是___________________。PCR擴增時，需在______________催化下，在引物__________端進(jìn)行DNA鏈的延伸，獲得擴增產(chǎn)物用于測序。(3)為研究蛋白質(zhì)X在細(xì)胞中的定位，構(gòu)建綠色熒光蛋白GFP與X的融合蛋白，融合蛋白具有綠色熒光，可示其在細(xì)胞內(nèi)位置。將X－GFP基因融合片段M導(dǎo)入如圖Ⅱ所示載體質(zhì)粒Y，構(gòu)建Y－M重組質(zhì)粒(在EcoRV位點插入片段)。請完成下表。分步實驗?zāi)繕?biāo)簡易操作、結(jié)果、分析PCR鑒定正向重組質(zhì)粒Y－M(圖Ⅱ中融合片段M中有白色的箭頭，代表方向)①選擇圖Ⅱ引物__________；②PCR目的產(chǎn)物約為__________bp確保M及連接處序列正確，Y－M的連接處上游含有HindⅢ＋EcoRV的識別序列，下游含有EcoRV＋BamHⅠ的識別序列③質(zhì)粒測序，圖Ⅲ中正確的是__________(選填序列編號)檢測融合蛋白定位④對照質(zhì)粒Y－GFP(僅表達(dá)GFP)與實驗質(zhì)粒Y－M分別導(dǎo)入細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對照組整個細(xì)胞均有綠色熒光，而實驗組熒光集中在纖毛基部，說明______________________________________________________________(4)為研究另一纖毛病相關(guān)基因Z表達(dá)的變化，采用熒光定量PCR法檢測健康人與病人基因Z的轉(zhuǎn)錄水平。采集樣本、提取總RNA，經(jīng)____________形成cDNA作為模板，PCR擴增結(jié)果顯示，在總cDNA模板量相等的條件下，健康人Ct值為15，而病人Ct值為20(Ct值是產(chǎn)物熒光強度達(dá)到設(shè)定閾值時的PCR循環(huán)數(shù))。從理論上估算，在PCR擴增20個循環(huán)的產(chǎn)物中，健康人樣品的目的產(chǎn)物大約是病人的__________倍。一、易錯辨析1．限制酶也可以識別和切割RNA()2．DNA連接酶能將兩堿基通過氫鍵連接起來()3．E.coliDNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端()4．用PCR方法擴增目的基因時需要設(shè)計兩種引物()5．DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精()6．在凝膠中DNA分子的遷移速率只與DNA分子的大小相關(guān)()二、填空默寫1．(選擇性必修3P