動植物總RNA提取

動植物總RNA提取-Trizol法Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點分析，斑點雜交，Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。1、 將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1mlTrizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。2、 研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。3、 取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。4、 棄去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4°C下7500g離心5分鐘。5、 小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時可55C-60C水溶10分鐘。RNA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70C。［注意］1、整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。2、加氯仿前的勻漿液可在-70C保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4C保存一周，-20C保存一年。Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。TRIzol的主要成分是酚。主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。酚雖可有效的變性蛋白質(zhì)，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8-羥基喹琳、異硫氰酸胍、8-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase。x0.1%的8—羥基喹琳的，與氯仿聯(lián)合使用可增強對RNase的抑制x異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)，并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。x8-巰基乙醇主要破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。在收獲組織及細(xì)胞死亡之后，應(yīng)立即滅活內(nèi)源的RNA酶，以防止RNA降解。以下3個方法均可有效使內(nèi)源RNA酶失活：1） 用含離液（如胍鹽）的細(xì)胞裂解液收獲樣品，并立即勻漿。2） 用液氮瞬間凍結(jié)樣品。值得特別注意的是：組織塊必須保證足夠小，在浸入液氮的瞬間就能凍結(jié)，以確保瞬間令RNA酶失活3） 立即將樣品置于RNAlaterTissueCollection:RNAStabilizationSolutS它是一種水相、無毒的收集試劑，能立即穩(wěn)定并保護(hù)完整、未凍結(jié)的組織和細(xì)胞樣品中的RNA。關(guān)鍵要點是組織樣品切片一定要夠薄（＜0.5cm），這樣RNAlater才能在RNase破壞RNA之前迅速滲入組織塊中。使用正確的細(xì)胞或組織儲存條件在樣品用液氮瞬間凍結(jié)之后，應(yīng)該儲存在-80°C，千萬不能解凍。即使是置于含有胍鹽的裂解液中作勻漿前的短暫解凍，也會導(dǎo)致RNA的降解和損失。瞬間凍結(jié)的組織應(yīng)該首先在超低溫條件下先研磨成粉，然后置于裂解液中進(jìn)行勻漿。RNAlater使樣品儲存更為便利。儲存在RNAlater中的細(xì)胞或組織可在室溫下穩(wěn)定保存長達(dá)1個星期，在4°C可穩(wěn)定保存長達(dá)1個月，或永久保存在-20°C。有關(guān)RNAlater的更多信息請參考/techlib/resources/RNAlater.徹底勻漿樣品細(xì)胞或組織的徹底勻漿對RNA提取來說，是一個很關(guān)鍵的步驟，它能夠防止RNA的損失和降解。勻漿的方法應(yīng)根據(jù)細(xì)胞或組織的類型來選擇。大部分培養(yǎng)的細(xì)胞可以置于細(xì)胞裂解液中，通過簡單的渦旋震蕩來勻漿；而動物組織、植物組織、酵母和細(xì)菌則常常需要更加劇烈的方法。比如說細(xì)菌的細(xì)胞壁，就需要酶消化來實現(xiàn)徹底的細(xì)胞裂解和RNA的最大回收。有關(guān)各種不同的樣本類型，哪些方法是最適合的勻漿方法，請參考/techlib/tb/tb183.html.在RNA提取之前預(yù)處理樣品裂解液對于某些樣品來說，在勻漿之后，RNA提取之前，還需要一些額外的處理步驟。對于脂肪含量高的組織，像腦組織和脂肪組織得到的裂解液，就需要通過氯仿抽提來去除脂類，從而提高RNA產(chǎn)量。許多植物組織中富含多酚和多糖，會降低RNA的質(zhì)量和產(chǎn)量，用PlantRNAIsolationAid預(yù)處理裂解液可去除這些難以處理的成分。選擇最好的RNA分離方法現(xiàn)有眾多的RNA分離方法也許令人難以取舍。目前最簡單也是最安全的方法是柱式分離，如RNAqueousTM或RNAqueous-4PCRKit。因為操作簡單，所以這些步驟特別適用于同時處理多個樣品。如果是處理復(fù)雜的組織，如富含核酸酶（胰腺）或脂肪（腦和脂肪組織）的樣品，就推薦使用更加嚴(yán)格的、基于酚處理的RNA分離方法，如totallyrnatm。更多的信息請參考/techlib/tn/83/8311.html。更多方法選擇，請參考/techlib/trees/RNA/index.htmlDNase處理如果提取的RNA將用于RT-PCR，我們推薦用DNase處理純化的RNA樣品以去除殘留的DNA污染。當(dāng)樣品來源于富含DNA的組織，如脾臟時，DNase處理也是一個好辦法。Ambion的RNAqueous-4PCRKit的實驗流程中包含了DNase處理的步驟，并提供了必需的試劑（DNA酶I）。DNA-free?DNasetreatment&RemovalReagents則可用于去除用各種方法制備的RNA樣品中的DNA污染。這兩個產(chǎn)品都提供了高質(zhì)量的DNaseI，優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，和DNA酶消化處理后簡單快速去除DNase的方法，無需使用有機溶劑和熱處理。減少環(huán)境RNase的暴露為了得到完整的、高品質(zhì)RNA，在整個RNA制備過程中，當(dāng)RNA離開強蛋白變性劑（如離液裂解液或酚）的保護(hù)時，避免引入新的RNase污染就非常關(guān)鍵。由于RNase幾乎是無所不在，所以必須確保與純化的RNA接觸的每一樣?xùn)|西都是無RNase污染的。所有的表面，包括移液器、工作臺、玻璃器皿和制膠設(shè)備，都必須用表面去污凈化溶液如RNaseZapTM或RNaseZapWipes來處理過。必須保證一直使用無RNase的槍頭、試管和溶液，手套也應(yīng)經(jīng)常更換。正確的沉淀純化得到的RNA可能需要通過沉淀來濃縮，以滿足一些下游應(yīng)用的需要。醋酸銨（NH4OAc）沉淀（加0.1體積的5M醋酸銨、2-2.5體積的無水乙醇，-20°C放置25分鐘以上）可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低濃度的RNA（ng/ml），可以采用共沉淀（如糖原glycogen,、酵母yeastRNA或linearacrylamide）的方法。當(dāng)RNA用于RT-PCR分析時，線性的丙烯酰胺和DNase處理的糖原都可以作為理想的共沉淀劑，因為它們都不含DNA污染。酵母RNA和未處理的糖原會給樣品帶來核酸污染，有可能影響RT-PCR的結(jié)果。沉淀后，注意避免RNA沉淀過分干燥，因為這可能導(dǎo)致很難重新溶解。重懸許多RNA提取步驟的最后一步是溶解純化的RNA沉淀。理想的重懸溶液應(yīng)該滿足3點要求：無RNase污染、較低的pH值（pH6-7）、含有螯合劑，以保護(hù)RNA不受帶入的RNase的降解.（THERNAStorageSolution能滿足以上所有標(biāo)準(zhǔn)。）為了幫助溶解，RNA沉淀可置于重懸溶液中在65°C孵育5分鐘，并不時輕搖以幫助溶解。儲存如果只是短期儲存，重懸的RNA應(yīng)放置于-20°C；如果是長期儲存的話，就應(yīng)該放置于-80°C。盡管重懸于水或緩沖液中的RNA也可以儲存在-80°C，但保存于醋酸銨/乙醇溶液中的RNA沉淀則更加穩(wěn)定。我們推薦將RNA溶液分裝在幾支管中。這會避免反復(fù)凍融損傷RNA，并預(yù)防偶然的RNase污染。ABI供稿，生物通翻譯

蛋白酶K的妙用轉(zhuǎn)載請注明來自丁香園發(fā)布日期：2009-05-2104:09文章來源：丁香通點擊次數(shù)：密度］1440編者按：當(dāng)我們屏著呼吸使用致癌的DEPC時，是否想過用一種既安全又省錢方法替代DEPC？看過本文，你一定會感慨作者的探索精神。其實，在丁香園，這樣的探索還有很多。如果你嫌找得麻煩，那就先看看''牛人強文〃吧！蛋白酶K的妙用，我曾經(jīng)在別的論壇發(fā)表。坦率地說，蛋白酶K的這個用途，是我的得意之作之最。不是因為該發(fā)現(xiàn)有什么創(chuàng)新，而是因為它的實用性。當(dāng)別人還在討論DEPC有什么毒性，討論那一家公司的DEPC好時，我早就在使用蛋白酶K替代DEPC實現(xiàn)滅活RNaseA的目的了。（不過有一點還是要聲明，我沒有使用該方法制備的水用于溶解RNA。原因不是在于我對該方法的擔(dān)心，而是我沒有制備高純水（Millipore水）的設(shè)備。與保存及酶反應(yīng)有關(guān)的水，除了酶的殘留是一個考慮因素外，水的純度也是我考慮的；這種用途的水，我使用的是Sigma進(jìn)口的無酶的Millipore水（也不是DEPC處理的水）。我的用途很特殊，首先要求最高純度的水，所以我只能付出更大的代價。）看這篇東西，我不知道大家的最大擔(dān)心是什么；最早我的最大擔(dān)心是蛋白酶K的''尸體〃是否會對后續(xù)實驗產(chǎn)生影響。做過的實驗證明我的擔(dān)心是多余的。蛋白酶K，威力巨大的廣譜蛋白酶，95C加熱10分鐘，則完全失活。數(shù)年前首次使用它替代DEPC處理RNA抽提用的離心管和槍頭，效果不錯；后來又用于處理RNase-Free的水，效果也是一級棒。從此就再也不用DEPC了。現(xiàn)在將它的細(xì)節(jié)公開，與大家分享。配制RNA裂解試劑時，直接用滅菌的雙蒸水配制，最后，加入蛋白酶K至終濃度1ug/ml。輕輕混勻，室溫放置15分鐘后即可。槍頭及離心管去除RNase：先將槍頭及離心管清洗干凈后，移入預(yù)先混好的含1ug/ml蛋白酶K的雙蒸水，徹底浸入。室溫放置30分鐘后，連水一起高壓滅菌。棄水后，烘干即可。RNase-Free水的獲得：直接在滅菌的雙蒸餾水中加入蛋白酶K至終濃度1ug/ml。輕輕混勻，室溫放置15分鐘后，滅菌處理即可。該蛋白質(zhì)的殘留對后續(xù)實驗沒有可見的影響。無蛋白質(zhì)殘留的RNase-Free水的獲得：這比較麻煩。直接在滅菌的雙蒸餾水中加入蛋白酶K至終濃度1ug/ml。輕輕混勻后，倒入專用的蒸餾器中。放置15分鐘后，加熱蒸餾，流出的就是無蛋白質(zhì)殘留的RNase-Free水。要提醒的是，該專用蒸餾器頭幾次流出來的水，只能當(dāng)普通蒸餾水用，因為通道中難確保RNase-Free的環(huán)境；另外，一定要主要密閉性，否則，流出的水又被污染了。

RNA提取實驗方法流程1、 實驗?zāi)康奶崛∪梭w細(xì)胞的總RNA和mRNA。2、 本實驗所需試劑1） 、CNE-2細(xì)胞及培養(yǎng)細(xì)胞的一系列條件，2） 、PBS緩沖液，TRIZOL試劑，3） 、DEPC處理過的水、大、中、小Tip及1.5mlEP管，4） 、新的氯仿、異丙醇和乙醇，5） 、mRNA分離試劑盒：OligotexmRNAMiniKit,Cat.no,:70022,QIAGEN。6） 、新配的電泳緩沖液，專跑RNA的瓊脂糖（Agarose）。3、 實驗流程3.1細(xì)胞總RNA的提取1） 、6孔板細(xì)胞（CNE-2）匯合度為90-100%時，取出無菌室，去其上清，用PBS洗兩次后，每孔加TRIZOL試劑（Gibco公司）1ml，搖勻，無菌罩內(nèi)消化3-5分鐘（觀察：液體變粘稠，細(xì)胞脫壁）。2） 、將各孔內(nèi)消化好的細(xì)胞裂解液吸到一DEPC處理過的1.5mlEP管中，加新開的氯仿0.2ml，輕搖15秒。3） 、室溫靜置2-3分鐘后，12000rpm，15min，4°C，離心。然后取上清無色水相（約0.6ml）到EP管（DEPC處理過），加0.5ml新開的異丙醇，室溫下靜置10分鐘。4） 、12000rpm，10分鐘，4°。，離心。觀察總RNA在管底的白色沉淀，棄去上清（小心別丟了沉淀），75%乙醇1.0ml洗滌（用DEPC水新配制）后，7500rpm，5min，4°。離心。5） 、去上清，點離，用小Tip吸干液體。氣干沉淀5-10分鐘，DEPC處理水20-30ul加入，中槍打勻，55-60C水浴10分鐘溶解總RNA，測OD值。6） 、電泳。3.2從總RNA中分離mRNA（OligotexmRNAMiniKit,Cat.no.:70022,QIAGEN）1）、取上述提取的總RNA若干（少于0.25mg）到一個新的無RNase的EP管中，用無RNase的水定容到250ul。2） 、加入BufferOBB250ul,OligotexSuspension15ul。用Tip打勻或用手彈勻。3） 、70C水浴，3分鐘（裂解RNA的二級結(jié)構(gòu)）。4） 、20-30C條件下，靜置10分鐘（讓Oligotex與mRNA結(jié)合）。5） 、高速離心2分鐘，小心吸走上清（該上清要保留），留下約50ul的上清在原管里。6） 、用BufferOW2400ul重懸含Oligotex/mRNA復(fù)合物的沉淀，然后將這些加到套有1.5mlEP管的SPIN柱子上，高速離心1分鐘。7） 、將SPIN柱子移到一個新的EP管上，加BufferOW2400ul到柱子，高速離心1分鐘，丟掉濾過液。8） 、將SPIN柱子移到一個新的EP管上，加20-100ul熱的（70C）BufferOEB到柱子上，用Tip來回吸打3-4次，高速離心1分鐘。9） 、為保證最大的mRNA產(chǎn)量，可再次重復(fù)第8步。4、mRNA的應(yīng)用：RT-PCR,