微生物發(fā)酵培養(yǎng)

關(guān)于微生物發(fā)酵培養(yǎng)第1頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三第六章微生物發(fā)酵培養(yǎng)第一節(jié)發(fā)酵動力學(xué)第二節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)方法的分類第三節(jié)影響發(fā)酵過程的主要因素第四節(jié)雜菌的污染與防治第2頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三第一節(jié)微生物發(fā)酵動力學(xué)化學(xué)動力學(xué)：

Chemicalkineticsisthestudyofthespeedwithwhichachemicalreactionoccursandthefactorsthataffectthisspeed.

Whatismeantbythespeedofareaction?Thespeedofareactionistherateatwhichtheconcentrationsofreactantsandproductschange.

kinetics：Thebranchofchemistrythatisconcernedwiththeratesofchangeintheconcentrationofreactantsinachemicalreaction.第3頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三

XS（底物）X（菌體）＋P（產(chǎn)物）發(fā)酵過程反應(yīng)的描述發(fā)酵過程的反應(yīng)描述及速度概念第4頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三發(fā)酵動力學(xué)（fermentationkinetics):研究發(fā)酵過程的反應(yīng)速率和環(huán)境因素對速率的影響。

菌體生成速率－－－菌體生長動力學(xué)產(chǎn)物生成速率－－－產(chǎn)物生成動力學(xué)基質(zhì)消耗速率－－－基質(zhì)消耗動力學(xué)三者之間的關(guān)系單位時間內(nèi)單位菌體消耗基質(zhì)或形成產(chǎn)物（菌體）的量稱為比速，是生物反應(yīng)中用于描述反應(yīng)速度的常用概念第5頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三

發(fā)酵反應(yīng)動力學(xué)的研究內(nèi)容研究反應(yīng)速度及其影響因素并建立反應(yīng)速度與影響因素的關(guān)聯(lián)反應(yīng)動力學(xué)模型反應(yīng)器特性+反應(yīng)器的操作模型操作條件與反應(yīng)結(jié)果的關(guān)系，定量地控制反應(yīng)過程第6頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三發(fā)酵動力學(xué)研究的目的通過發(fā)酵動力學(xué)的研究，可進(jìn)一步了解微生物的生理特征，菌體生長和產(chǎn)物形成的合適條件，以及各種發(fā)酵參數(shù)之間的關(guān)系，為發(fā)酵過程的工藝控制、發(fā)酵罐的設(shè)計(jì)放大和用計(jì)算機(jī)對發(fā)酵過程的控制創(chuàng)造條件。第7頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三二、微生物生長動力學(xué)

微生物細(xì)胞的生長速率和環(huán)境條件對生長速率的影響。

第8頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（一）生長速率

菌體濃度的增加速率

比生長速率：單位菌體的生長速率h-1比生長速率μ與許多因素有關(guān)，當(dāng)溫度、pH、基質(zhì)濃度等條件改變時，μ隨之改變

第9頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（二）比生長速率與基質(zhì)濃度的關(guān)系1．Monod方程只考慮一種基質(zhì)限制μ＝f(s,I,P,T,pH,……,)μ＝f(s)式中：μmax

—最大比生長速率（1/h）

Ks

—底物飽和常數(shù)（g/L）第10頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三當(dāng)限制性底物濃度非常小時，一級反應(yīng)；當(dāng)限制性底物濃度很大時，零級反應(yīng)；存在高底物濃度抑制時，

與米氏方程比較第11頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三Monod方程的參數(shù)求解(雙倒數(shù)法)：將Monod方程取倒數(shù)可得：或：

測定不同限制性基質(zhì)濃度下，微生物的比生長速率，通過回歸分析計(jì)算出Monod方程的兩個參數(shù)。第12頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三例：在一定條件下培養(yǎng)大腸桿菌，得如下數(shù)據(jù)：S(mg/l)63364153221μ(h-1)0.060.240.430.660.70求在該培養(yǎng)條件下，求大腸桿菌的μmax，Ks和td?解：將數(shù)據(jù)整理：S/μ100137.5192.5231.8311.3S63364153221第13頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三

μmax=1.11(h-1);Ks=97.6mg/Ltd＝ln2/μmax＝0.64h第14頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三三、產(chǎn)物形成動力學(xué)產(chǎn)物生成速率比生產(chǎn)速率第15頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（一）產(chǎn)物形成與菌體生長的關(guān)系1.生長聯(lián)系型

產(chǎn)物的形成和菌體的生長相偶聯(lián)xp如乙醇、丙酮酸等初級代謝產(chǎn)物的發(fā)酵

第16頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三2.非生長聯(lián)系型

產(chǎn)物的形成和菌體的生長非偶聯(lián)xp多數(shù)抗生素發(fā)酵第17頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三

3.復(fù)合型（部分生長聯(lián)系型）

產(chǎn)物的形成和菌體的生長部分偶聯(lián)xp檸檬酸

第18頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三產(chǎn)物形成動力學(xué)模型舉例

1.青霉素發(fā)酵2.谷氨酸發(fā)酵3.酒精發(fā)酵

第19頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三四、生長得率和產(chǎn)物得率1.生長得率：消耗單位數(shù)量基質(zhì)所得到的菌體的量，稱為基質(zhì)的生長得率。即：

Yx/s—基質(zhì)生長得率（g菌體/g基質(zhì)）或（g菌體/mol基質(zhì)）2.產(chǎn)物得率：消耗單位數(shù)量基質(zhì)所得到的產(chǎn)物量，稱為基質(zhì)的產(chǎn)物得率，其定義為：

Yp/s

—基質(zhì)產(chǎn)物得率（g產(chǎn)物/g基質(zhì)）或（mol產(chǎn)物/mol基質(zhì)）

轉(zhuǎn)化率：往往是指投入的原料與合成產(chǎn)物數(shù)量之比。第20頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（二）理論得率和表觀得率理論得率：只考慮細(xì)胞合成時細(xì)胞對底物的得率，YG表觀得率：既考慮細(xì)胞合成又考慮細(xì)胞維持時細(xì)胞對底物的得率，YX/S兩者的關(guān)系：

第21頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（三）其他生長得率的表示方法氧生長得率有效電子生長得率ATP生長得率能量生長得率第22頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三SS1

菌體S2

產(chǎn)物S3

維持

XS（底物）─→X（菌體）＋P（產(chǎn)物）+維持維持消耗(m)：指維持細(xì)胞最低活性所需消耗的能量，一般來講，單位重量的細(xì)胞在單位時間內(nèi)用于維持消耗所需的基質(zhì)的量是一個常數(shù)。五、基質(zhì)消耗動力學(xué)第23頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三

XS（底物）─→X（菌體）＋P（產(chǎn)物）+維持m:維持消耗系數(shù)YP/s:產(chǎn)物對基質(zhì)的理論得率系數(shù)YG:細(xì)胞對基質(zhì)的理論得率系數(shù)，Y*x/s物料衡算：第24頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三

第二節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)方法一、概述物料狀態(tài)：固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵深層培養(yǎng)：分批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)第25頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三分批發(fā)酵(batchfermentation)是指在一個密閉系統(tǒng)內(nèi)投入有限數(shù)量的營養(yǎng)物質(zhì)后，接入少量的微生物菌種進(jìn)行培養(yǎng)，使微生物生長繁殖，在特定的條件下只完成一個生長周期的微生物培養(yǎng)方法。第26頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三流加培養(yǎng)

(feedbatchfermentation）流加培養(yǎng)又稱為補(bǔ)料分批培養(yǎng)，是指先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，在適宜的條件下接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長，產(chǎn)物也不斷形成。隨著細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，向反應(yīng)器中不斷補(bǔ)充新的營養(yǎng)成分，使細(xì)胞進(jìn)一步生長代謝，到反應(yīng)終止時取出整個反應(yīng)系。

第27頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三半連續(xù)培養(yǎng)

(semi-continuousfermentation)半連續(xù)培養(yǎng)又稱為反復(fù)分批培養(yǎng)或換液培養(yǎng)，是指在分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上不全部取出反應(yīng)系，剩余部分重新補(bǔ)充新的營養(yǎng)成分，再按分批培養(yǎng)的方式進(jìn)行操作。

第28頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三連續(xù)培養(yǎng)

(continuousfermentation)連續(xù)發(fā)酵是指以一定的速度向培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)添加新鮮的培養(yǎng)基，同時以相同的速度流出培養(yǎng)液，從而使培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)液的量維持恒定，使微生物細(xì)胞能在近似恒定狀態(tài)下生長的微生物發(fā)酵培養(yǎng)方式。

第29頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三二、分批培養(yǎng)密閉系統(tǒng)，除氧氣供給、尾氣排出、消泡劑的添加和控制pH值需加入的酸或堿外，整個培養(yǎng)系統(tǒng)與外界沒有其他物質(zhì)的交換。

非穩(wěn)態(tài)的培養(yǎng)方法：微生物生長的環(huán)境條件也隨之不斷變化優(yōu)點(diǎn)：1.培養(yǎng)基一次滅菌，一次投料，易實(shí)現(xiàn)無菌狀態(tài)；2.易于操作控制，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定；3.培養(yǎng)濃度較高，易于產(chǎn)品分離；缺點(diǎn)：輔助時間較多，設(shè)備生產(chǎn)能力低。廣泛采用第30頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三除了一次性投料和一次性回收產(chǎn)品的操作外，在分批培養(yǎng)還包括的兩種情況。1.營養(yǎng)成份連續(xù)供應(yīng)氧氮源：控制菌體生長，調(diào)節(jié)pH磷源：控制菌體生長，調(diào)節(jié)pH，不形成沉淀2.重復(fù)批式操作只分出一部分成熟醪，在原反應(yīng)器中，留一部分成熟醪作為種子，接入新鮮培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。酒精廠的酒母車間，省去了前幾級種子培養(yǎng)，但是易變異第31頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三分批發(fā)酵中微生物的生長情況時間菌體濃度延遲期指數(shù)生長期減速期靜止期衰亡期延遲期：指數(shù)生長期:減速期:靜止期：;衰亡期:第32頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三分批發(fā)酵過程的細(xì)胞生長動力學(xué)方程細(xì)胞恒算：若服從monod方程：忽略死亡：第33頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三底物消耗動力學(xué)方程

底物的消耗速率：

第34頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三產(chǎn)物生成動力學(xué)方程產(chǎn)物生成速率：

生長偶聯(lián)型上述三個方程的適用范圍：對數(shù)生長期及減速生長期，對于穩(wěn)定期和衰退期不適用

第35頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三穩(wěn)定期和衰退期的出現(xiàn)的原因

①營養(yǎng)物的不足碳源和其他營養(yǎng)成分②氧的供應(yīng)不足細(xì)胞濃度的增加，需氧速率越來越大，菌體濃度的增加，導(dǎo)致粘度增大，溶氧困難，容易造成供氧不足。③抑制物質(zhì)的積累各種代謝產(chǎn)物的濃度逐漸增高，抑制作用。④生物的空間不足據(jù)經(jīng)驗(yàn)，在培養(yǎng)細(xì)菌及酵母等時，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到109～1010個/毫升時，培養(yǎng)液中還有充分的營養(yǎng)物質(zhì)，但菌體的生長幾乎停止。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)有人認(rèn)為是由生長抑制物質(zhì)所引起，可是也有人認(rèn)為是由于單個細(xì)胞必須占有最小的空間所致。第36頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三三、補(bǔ)料分批培養(yǎng)（一）為什么采用流加培養(yǎng)？存在底物抑制分解代謝物阻遏營養(yǎng)缺陷型菌株的培養(yǎng)前體的補(bǔ)充第37頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三例：酵母生產(chǎn)Crabtree效應(yīng)糖濃度很低時（0.028%），在有氧條件下，酵母不產(chǎn)生乙醇，其生長得率可達(dá)50%當(dāng)糖濃度較高時，酵母菌在生長的同時，產(chǎn)生部分乙醇，酵母得率低于50%糖濃度達(dá)5%時，即是在有足夠氧的條件下，酵母菌的生長也會受到抑制，且產(chǎn)生大量乙醇，酵母得率很低。

解決辦法：流加，糖濃度保持低水平（一般為0.1～0.5%），流加速率等于酵母的耗糖速率。生長快速，得率高（Yx/S=0.4～0.45g/g）第38頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三補(bǔ)料分批間歇流加連續(xù)流加恒速流加指數(shù)流加反復(fù)補(bǔ)料分批（二）不同的補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式第39頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三細(xì)胞：

底物：

產(chǎn)物：

（三）恒速流加對流加培養(yǎng)過程進(jìn)行物料衡算（忽略細(xì)胞死亡）有：第40頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三最終得到：菌體生長速率：底物消耗速率：產(chǎn)物生成速率：式中：V——反應(yīng)器中培養(yǎng)液體積（L）

SF

——流加培養(yǎng)液中底物的濃度（g/L）

F——流加速率（L/h），F(xiàn)=dv/dt第41頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三擬穩(wěn)態(tài)的出現(xiàn)限制性基質(zhì)濃度趨于0,變化很小細(xì)胞濃度接近于定值細(xì)胞比生長速率近似于稀釋速率，逐漸減小。

第42頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（四）指數(shù)流加恒定的比生長速率限制性基質(zhì)濃度恒定第43頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（五）反復(fù)補(bǔ)料分批培養(yǎng)補(bǔ)充養(yǎng)分和前體，稀釋有害代謝物，延續(xù)產(chǎn)物合成培養(yǎng)液不斷排放，放出的培養(yǎng)液的體積可大于反應(yīng)器的體積，提高反應(yīng)器的利用效率和生產(chǎn)效率第44頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三四、連續(xù)培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn):與分批培養(yǎng)比較，連續(xù)培養(yǎng)設(shè)備生產(chǎn)能力高，易于實(shí)現(xiàn)自動控制和勞動生產(chǎn)率高，缺點(diǎn):很難保證長期的無菌操作，培養(yǎng)濃度較低。

第45頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三活塞流式（PFR）

①物料遵循嚴(yán)格的先進(jìn)先出，像活塞一樣；②細(xì)胞濃度和營養(yǎng)物組分的濃度沿反應(yīng)器軸向逐漸變化，但沿徑向方向無濃度梯度；③反應(yīng)器各處，各組分的濃度不隨時間變化。（一）連續(xù)培養(yǎng)模型第46頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三全混式（COST）

①進(jìn)料液和出料液流量相等，容器中液體的體積V恒定；②反應(yīng)器中底物、產(chǎn)物和細(xì)胞的濃度均勻一致，即反應(yīng)器中無濃度梯度；③流出液中的物料組成等于反應(yīng)器中的物料組成Q，S0x0，P0Q，Sx，PV，S,x，P第47頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三全混式反應(yīng)器分類恒化器(Chemostat)穩(wěn)定態(tài)時，化學(xué)環(huán)境恒定

通過限制某些化學(xué)物質(zhì)的量（如以碳源或氮源作為限制基質(zhì)）來控制微生物生長

恒濁器(Turbidostat)穩(wěn)定態(tài)時，細(xì)胞濃度恒定

供給的營養(yǎng)組份都必須是過剩的，這樣才能保持穩(wěn)定的生長速率。恒化器應(yīng)用廣泛，而恒濁器的應(yīng)用較少見第48頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（二）單級連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞的物料衡算：

積累輸入輸出生長死亡穩(wěn)態(tài)下，反應(yīng)器中的細(xì)胞濃度x不變，即進(jìn)料液細(xì)胞濃度為零，且忽略細(xì)胞死亡，即x0=0，Kd=0,

定義稀釋速率：最后得：D=μ

連續(xù)培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)的條件Q，S0x0，P0Q，Sx，PV，S,x，P第49頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三把Monod方程式代入上式得：

作圖法求得μmax和Ks值

在連續(xù)培養(yǎng)條件下，改變稀釋率D，在達(dá)到另一個穩(wěn)定態(tài)時，即有一個確定的底物濃度S

DD1D2D3D4D5D6…SS1S2S3S4S5S6…斜率＝KS/μmax

1/μmax第50頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三細(xì)胞濃度：產(chǎn)物濃度：比生產(chǎn)速率：基質(zhì)濃度：第51頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三2．稀釋率對生長得率的影響一定稀釋率范圍內(nèi)Yx/s為一常數(shù)。而在稀釋率很低或接近最大比生長速率時，Yx/S值有所下降。在稀釋率很低時，生長得率有所下降是因?yàn)榫S持細(xì)胞生命需要一定底物的緣故。在稀釋率很高而接近最大比生長速率時，發(fā)酵培養(yǎng)液中的底物濃度很高。在這種情況下，微生物通常產(chǎn)生較多的中間代謝產(chǎn)物，如醋酸、丙酮酸、乙醇等。中間代謝產(chǎn)物的大量生成，造成了底物的浪費(fèi)，因而細(xì)胞得率隨之降低。

第52頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三

3．洗出

S，x，P均為稀釋率D的函數(shù)。調(diào)節(jié)的有限性當(dāng)逐漸提高稀釋率，使反應(yīng)器中底物濃度S接近于進(jìn)料液中的底物濃度S0時，細(xì)胞濃度將趨于零，整個連續(xù)培養(yǎng)過程也就完全被破壞了。連續(xù)過程的最大稀釋率臨界稀釋率當(dāng)Ks＜＜S0，Dc=μmax當(dāng)稀釋率D→DC，而使反應(yīng)器的細(xì)胞濃度x→O時，即被稱為洗出。第53頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三4．最適稀釋率(Dm)細(xì)胞或產(chǎn)物的生產(chǎn)能力達(dá)最大時的稀釋率

最適稀釋率下的底物濃度Sm，細(xì)胞濃度Xm和菌體最大生產(chǎn)率（DX)m第54頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三第55頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三細(xì)胞濃度、底物濃度及生產(chǎn)能力與稀釋率的關(guān)系濃度或生長能力Dx或DPSxS0稀釋率DDmDc第56頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（四）多級連續(xù)培養(yǎng)第57頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三在很大的D范圍內(nèi)，第二級反應(yīng)器中的細(xì)胞生長十分有限第二級和第一級在同樣的Dc下被洗光，但在第二級反應(yīng)器中，只在D非常接近Dc時細(xì)胞濃度才迅速下降。限制性基質(zhì)在第二級反應(yīng)器中消耗比較完全第58頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三五、連續(xù)培養(yǎng)的應(yīng)用（一）連續(xù)培養(yǎng)在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用

1、酵母、細(xì)菌等單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品2、酒精、啤酒、醋酸等一次代謝產(chǎn)物3、污水的生化處理第59頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（二）連續(xù)培養(yǎng)在微生物生理特性和動力學(xué)研究中的應(yīng)用1、微生物生理特性的研究2．微生物動力學(xué)參數(shù)的測定（1）μmax與KS的測定

第60頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（2）YG與m的測定改變稀釋率D，在達(dá)另一穩(wěn)態(tài)時，再測定其值Yx/S

第61頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（三）連續(xù)培養(yǎng)在菌種分離與改良中的應(yīng)用連續(xù)培養(yǎng)中，最終在此培養(yǎng)體系中生存下來的微生物都是此時刻對該種底物表現(xiàn)出最大生長的微生物（或一個微生物生態(tài)）。當(dāng)只有B時,建立穩(wěn)態(tài)：μB=D,對應(yīng)S0如果引入微生物A：μ=μA(S0)μA>DXA增加s下降；μA，μB下降μB<D,XB下降，至被洗出s0μDS0StSμ當(dāng)S＝St,μA＝D時，建立新穩(wěn)態(tài)第62頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三六、關(guān)于連續(xù)培養(yǎng)的一些問題嚴(yán)格控制培養(yǎng)基和空氣的滅菌

選擇獨(dú)特的培養(yǎng)環(huán)境，使雜菌不宜生長或生長緩慢

①使用過高溫度或極端pH培養(yǎng)，可使培養(yǎng)過程不受常溫菌或中性菌的污染。②采用獨(dú)特的底物或培養(yǎng)基，使一般雜菌不能利用或者生長非常緩慢。③選育抗性菌株，在培養(yǎng)基中添加某種化學(xué)物質(zhì)或抗菌素，從而抑制其他雜菌的生長。④選育具有嗜殺性能的菌株，使之在培養(yǎng)過程中抑制雜菌的生長。⑤選育高比生長速率的菌株，在培養(yǎng)過程中采用較高的稀釋率，從而可使比生長速率較低的雜菌在培養(yǎng)過程中自然洗出。雜菌的比生長速率是否大于或等于培養(yǎng)菌的比生長速率

（一）無菌狀態(tài)的保持（污染問題）第63頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（二）菌種變異與退化連續(xù)培養(yǎng)時，微生物一直處于對數(shù)生長，因而其變異的可能性更大。當(dāng)變異菌株較之原生產(chǎn)菌株更適應(yīng)于培養(yǎng)環(huán)境，而具有更快的生長速率時，變異株就會在發(fā)酵液中越積越多，最終占據(jù)優(yōu)勢而左右發(fā)酵。

第64頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（三）均勻性與穩(wěn)定性均勻性低稀釋率培養(yǎng)時，均勻性很重要。因營養(yǎng)物濃度往往較低，若反應(yīng)器的均勻性較差，則可能會在某些區(qū)域出現(xiàn)營養(yǎng)物嚴(yán)重不足的現(xiàn)象，而影響微生物的正常生長。提高通風(fēng)和攪拌，增加功耗選擇混合效果較好的反應(yīng)器

穩(wěn)定性在高稀釋率下，穩(wěn)定性成為連續(xù)培養(yǎng)另一問題

最適稀釋率Dm與洗出時的臨界稀釋率Dc非常接近由于加料設(shè)備的不穩(wěn)定性和培養(yǎng)基中營養(yǎng)物濃度的變化等因素，有可能使培養(yǎng)過程發(fā)生洗出現(xiàn)象。

第65頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三第三節(jié)影響發(fā)酵過程的主要因素

一、溫度二、pH三、溶解氧四、基質(zhì)濃度五、二氧化碳和呼吸商六、泡沫第66頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三一、溫度（一）溫度對微生物生長的影響1.不同微生物，最適生長溫度和耐受溫度范圍不同。第67頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三2.微生物生長速率和死亡速率與溫度的關(guān)系微生物典型活化能50~70KJ/mol微生物死亡活化能300~380KJ/mol隨著溫度的升高，死亡速率的增加遠(yuǎn)大于生長速率的增加第68頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三溫度高于最適溫度，死亡速率增加第69頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三3.溫度對YX/S的影響A.隨著維持代謝需能的增加，細(xì)胞得率隨溫度升高而降低。B.最大細(xì)胞得率所處的溫度一般低于最適生長溫度。第70頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三4.溫度對細(xì)胞組分的影響比生長速率隨溫度上升而增加，蛋白質(zhì)和RNA量也同步增加。重組蛋白的生產(chǎn)可提高溫度誘導(dǎo)產(chǎn)物形成。低溫下生長，脂肪酸不飽和度增加。膜脂質(zhì)的流動性，脂肪酸的含量，不飽和程度。第71頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（二）溫度對發(fā)酵的影響一般發(fā)酵溫度升高，酶反應(yīng)速度增大，生長代謝加快，產(chǎn)物生成提前。但酶容易因過熱而失去活性，表現(xiàn)在菌體容易衰老，發(fā)酵周期縮短，影響最終產(chǎn)量。溫度還對發(fā)酵液的物理性質(zhì)產(chǎn)生影響，如發(fā)酵液的黏度、發(fā)酵基質(zhì)和氧在發(fā)酵液中的溶解度和傳遞速度、某些基質(zhì)的分解和吸收速率等。影響產(chǎn)物合成的比例和方向。溫度對代謝的調(diào)節(jié)作用。第72頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（三）影響發(fā)酵溫度的因素第73頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（四）最適溫度的選擇適合菌體生長的溫度不一定適合產(chǎn)物的合成，整個發(fā)酵周期內(nèi)僅選用一個最適溫度不一定好?？紤]供氧條件。低溫有利于溶氧。考慮培養(yǎng)基成分和濃度。濃度較低或組分較易被菌體利用時，提高發(fā)酵溫度則養(yǎng)分容易過早耗盡，導(dǎo)致菌體過早出現(xiàn)自溶，產(chǎn)量降低。菌體生長和產(chǎn)物合成兩個溫度（變溫發(fā)酵）黃原膠：發(fā)酵前期27℃，20～25h；中后期32℃?？杉铀偾捌诰w生長和提高膠產(chǎn)量20％。四環(huán)素：中前期0～30h,稍高溫度促進(jìn)生長，縮短非生產(chǎn)周期；30～150h稍低溫度維持較長的生產(chǎn)期，150h后升溫，促進(jìn)抗生素分泌。青霉素：0～5h,30℃;5～40h,25℃;40～125h,20℃;125～165h,25℃。較25℃恒溫培養(yǎng)產(chǎn)量提高15％。第74頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三二、pH值（一）pH值對發(fā)酵的影響（微生物生長和產(chǎn)物合成)不同微生物生長最適pH不同影響酶的活性，影響代謝過程；影響細(xì)胞膜所帶電荷的狀態(tài)和跨膜pH梯度，影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌；影響培養(yǎng)基組分的解離，進(jìn)而影響吸收；第75頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，是引起pH值變化的主要原因，發(fā)酵液pH值的變化是微生物代謝的綜合效果。（從開始生長到代謝結(jié)束過程）生理酸性物質(zhì)和生理堿性物質(zhì)：硫酸銨，硝酸鈉有機(jī)酸的生成：乳酸，乙酸，丙酮酸

微生物生長和產(chǎn)物合成最適pH通常不一樣，這不僅與菌種特性也與產(chǎn)物化學(xué)性質(zhì)有關(guān)。鏈霉素和紅霉素：pH6.8～7.3金霉素、四環(huán)素：pH5.9～6.3青霉素：pH6.5～6.8檸檬酸：pH3.5～4.第76頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三引起發(fā)酵過程pH下降的因素：碳氮比過高，碳源（葡萄糖）過多，中間補(bǔ)糖加之溶解氧不足，致使有機(jī)酸大量積累；消泡劑加的過多；生理酸性物質(zhì)的存在，氨被利用。引起發(fā)酵過程pH上升的因素：碳氮比不當(dāng)，氮源過多，氨基氮釋放；生理堿性物質(zhì)的存在；中間補(bǔ)料中氨水或尿素等的堿性物質(zhì)的加入過多。第77頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（二）發(fā)酵的最適pH值的選擇不同的微生物不同同一菌種，生長最適pH值可能與產(chǎn)物合成的最適pH值不同。

利福霉素B生產(chǎn)中生長期和生產(chǎn)期pH維持6.5和7.0，較整個過程維持7.0產(chǎn)率提高14％利福霉素B生產(chǎn)醋酸桿菌生產(chǎn)纖維素，將pH從4.0調(diào)整到5.5，比維持恒定4.0纖維素提高1.5第78頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（三）pH值的控制基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方

代謝產(chǎn)酸(如葡萄糖產(chǎn)生酮酸、（NH4）2SO4)和產(chǎn)堿（如NaNO3、尿素）的物質(zhì)、氨水及緩沖劑（如CaCO3）等成分的使用。發(fā)酵過程中直接加酸、堿和連續(xù)補(bǔ)料控制pH。特別是連續(xù)補(bǔ)料的方法，既可以達(dá)到穩(wěn)定pH值的目的，又可以不斷補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)。效果比較明顯。pH反映菌體的生理狀況，pH上升，表明菌體處于饑餓狀態(tài)，可加糖調(diào)節(jié)。第79頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三青霉素發(fā)酵，調(diào)節(jié)加糖速率調(diào)節(jié)pH,比恒速加糖，酸堿控制pH可提高產(chǎn)量25％。第80頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三三、溶解氧

溶氧(DO)是需氧微生物生長所必需。在發(fā)酵過程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成為控制因素。在28℃氧在發(fā)酵液中的100％空氣飽和濃度只有0.25mmol.L-1（7mgL-1)左右，比糖的溶解度小7000倍。在對數(shù)生長期即使發(fā)酵液中的溶氧能達(dá)到100％空氣飽和度，若此時中止供氧，發(fā)酵液中溶氧可在幾分鐘之內(nèi)便耗竭，使溶氧成為限制因素。第81頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三

微生物對氧的需求一、描述微生物需氧的物理量比耗氧速率或呼吸強(qiáng)度（QO2）：單位時間內(nèi)單位干重的細(xì)胞所消耗的氧氣，mmolO2·g菌-1·h-1

耗氧速率或攝氧率(rO2)：單位時間內(nèi)單位體積發(fā)酵液的吸氧量。mmolO2·L-1·h-1

。第82頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三二、溶解氧濃度對菌體生長和產(chǎn)物形成的影響CCrQO2CLCCr:

臨界溶氧濃度,指不影響呼吸所允許的最低溶氧濃度。

0.003~0.05mmol/L

需氧量（耗氧速率，攝氧率）一般為25～100mmol/(L·h);

飽和含氧量：0.25mmol.L-1（

7mg/L左右）

第83頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三一般對于微生物：CCr:

＝1～15%飽和濃度例：酵母4.6*10-3mmol.L-1,1.8%

產(chǎn)黃青霉2.2*10-2mmol.L-1,8.8%定義：氧飽和度＝發(fā)酵液中氧的濃度/臨界溶氧溶度所以對于微生物生長，只要控制發(fā)酵過程中氧飽和度>1.第84頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三問題：一般微生物的臨界溶氧濃度很小，是不是發(fā)酵過程中氧很容易滿足。例：以微生物的攝氧率0.052mmolO2·L-1·S-1

計(jì)，

0.25/0.052=4.8秒注意：產(chǎn)物形成臨界氧濃度和菌體呼吸臨界溶氧濃度常常不一樣；生物合成臨界溶氧濃度也不等于最適氧濃度。

頭孢菌素卷須霉素生長5%(相對于飽和濃度）13%產(chǎn)物>13%>8%第85頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三三、影響需氧的因素

菌體濃度QO2

遺傳因素

菌齡

營養(yǎng)的成分與濃度

有害物質(zhì)的積累

培養(yǎng)條件第86頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三

反應(yīng)器中氧的傳遞一、發(fā)酵液中氧的傳遞方程CCiPPi氣膜液膜N：傳氧速率kmol/m2.hkg:氣膜傳質(zhì)系數(shù)kmol/m2.h.atmKl:液膜傳質(zhì)系數(shù)m/h第87頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三C*＝P/H,與氣相中氧分壓相平衡的液體中氧的濃度Kl:以氧濃度為推動力的總傳遞系數(shù)(m/h)再令：單位體積的液體中所具有的氧的傳遞面積為a(m2/m3)Nv：體積傳氧速率kmol/m3.hKla:以(C*-C)為推動力的體積溶氧系數(shù)h-1第88頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三二、發(fā)酵液中氧的平衡發(fā)酵液中供氧和需氧始終處于一個動態(tài)的平衡中傳遞：消耗：氧的平衡最終反映在發(fā)酵液中氧的濃度上面第89頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三三、供氧的調(diào)節(jié)C有一定的工藝要求，所以可以通過Kla和C*來調(diào)節(jié)，其中C*＝P/HNvHPKla第90頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三影響供氧因素－氧推動力增加氧分壓：通入純富氧空氣，增加溶氧濃度，不經(jīng)濟(jì)。提高罐壓：增加CO2濃度，對設(shè)備要求高改變通氣速率：兩倍，有時達(dá)5－10倍。降低發(fā)酵溫度第91頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三調(diào)節(jié)Kla是最常用的方法，kla反映了設(shè)備的供氧能力，一般來講大罐比小罐要好。

45升1噸10噸攪拌速度250rpm120120供氧速率7.610.720.1第92頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三

影響Kla的因素Kla反映了設(shè)備的供氧能力，發(fā)酵常用的設(shè)備為搖瓶與發(fā)酵罐。一、影響搖瓶kla的因素為裝液量和搖瓶機(jī)的種類搖瓶機(jī)往復(fù)，頻率80-120分/次，振幅8cm旋轉(zhuǎn)，偏心距25、12,轉(zhuǎn)述250rpm第93頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三裝液量，一般取1/10左右：

250ml15-25ml500ml30ml750ml80ml例：

500ml搖瓶中生產(chǎn)蛋白酶，考察裝液量對酶活的影響裝液量30ml60ml90ml120ml

酶活力71373425392第94頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三影響發(fā)酵罐中Kla的因素?cái)嚢杵髟O(shè)計(jì)，類型、葉片、直徑、位置空氣分布器的類型與位置增加攪拌強(qiáng)度增加擋板液體的粘度第95頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三例黑曲霉生產(chǎn)糖化酶

n230230270

通氣比1:0.81:1.21:0.8

產(chǎn)量181224162846提高N,比提高Q有效第96頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三2、實(shí)際上：對于轉(zhuǎn)速的調(diào)節(jié)有時是有限度的通風(fēng)的增加也是有限的蒸發(fā)量大中間揮發(fā)性代謝產(chǎn)物帶走第97頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三3、小型發(fā)酵罐和大型發(fā)酵罐調(diào)節(jié)kla的特點(diǎn)

小型發(fā)酵罐，轉(zhuǎn)速可調(diào)

大型發(fā)酵罐，轉(zhuǎn)速往往不可調(diào)

大型反應(yīng)器的合理設(shè)計(jì)

對現(xiàn)有設(shè)備一定要注意工藝配套第98頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三第四節(jié)溶氧濃度的變化及其控制一、典型的分批發(fā)酵中氧濃度的變化規(guī)律（一定Kla下）：rXQCL一般有一個低谷，在對數(shù)生長的末期第99頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三發(fā)酵過程的控制一般策略：前期有利于菌體生長，中后期有利用產(chǎn)物的合成溶氧控制的一般策略：前期大于臨溶氧濃度，中后期滿足產(chǎn)物的形成。第100頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三2、溶氧控制的實(shí)例GAXDO谷氨酸發(fā)酵：要求：氧飽和度>1控制：0-12小時小通風(fēng)

12小時后增加通風(fēng)原因：0-12小時菌體量較小，采用小通風(fēng)12第101頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三培養(yǎng)液中的溶氧濃度的變化可以反應(yīng)出菌體的生長生理狀況：開始明顯下降的時間的不同，反映種子活力、接種量以及培養(yǎng)基成分的不同對數(shù)期溶氧明顯下降，下降速率的不同反應(yīng)生長狀況溶氧低谷到來的早晚與低谷時溶氧的水平二次生長生長衰退或自溶第102頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三溶氧作為發(fā)酵異常的指示攪拌，氣液混合，油的添加量等操作過程故障中間補(bǔ)料污染雜菌作為質(zhì)量控制指標(biāo)第103頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三四、基質(zhì)濃度比生長速率與基質(zhì)濃度呈線性關(guān)系由于代謝產(chǎn)物及其基質(zhì)過濃，而導(dǎo)致抑制作用，出現(xiàn)比生長速率下降的趨勢。當(dāng)葡萄糖濃度低于100～150g/L時，不出現(xiàn)抑制；當(dāng)葡萄糖濃度高于350～500g/L時，多數(shù)微生物由于細(xì)胞脫水而不能生長。在發(fā)酵生產(chǎn)中，如果培養(yǎng)基中基質(zhì)濃度過高，即營養(yǎng)過于豐富，會使菌體生長過盛，發(fā)酵液非常粘稠，傳質(zhì)狀況很差。第104頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（一）碳源對發(fā)酵的影響酵母的克雷布特（crabtree）效應(yīng)快速利用碳源；有利于菌體生長但分解代謝產(chǎn)物對產(chǎn)物的合成可能產(chǎn)生阻遏作用緩慢利用碳源：被菌體緩慢利用，有利于延長代謝產(chǎn)物的合成，特別有利于延長抗生素的分泌期，也常為許多微生物藥物的發(fā)酵所采用。碳源濃度的控制方法第105頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（二）氮源對發(fā)酵的影響快速利用氮源容易被菌體利用，促進(jìn)菌體生長，但對某些代謝產(chǎn)物的合成，特別是某些抗生素的合成產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，影響產(chǎn)量。緩慢利用的氮源對延長次級代謝產(chǎn)物的分泌期、提高產(chǎn)物的產(chǎn)量有好處。發(fā)酵培養(yǎng)基中一般選用含有快速和慢速利用的混合氮源補(bǔ)充有機(jī)氮源：如酵母粉、玉米漿、尿素等補(bǔ)充無機(jī)氮源：補(bǔ)加氨水或硫酸銨是工業(yè)上常見的方法第106頁，講稿共119頁，2023年5月2日，星期三（三）磷酸鹽的影響菌體生長所允許的濃度比次級代謝產(chǎn)物合成所允許的濃度大得多，控制磷酸鹽濃度對微生物次級代謝產(chǎn)物發(fā)酵來說非常重要。磷酸鹽濃度調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物合成機(jī)制，對于初級代謝產(chǎn)物合成的影響，往往是通過促進(jìn)生長而間接產(chǎn)生的，對于次級代謝產(chǎn)物來說，機(jī)制就比較復(fù)雜。磷酸鹽濃度的控制，一般是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中采用適當(dāng)?shù)臐?/p>