單克隆抗體課件

第四章

單克隆抗體與基因工程抗體的制備第三臨床醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)教研室王飛副主任醫(yī)師,副教授教學(xué)目的：通過學(xué)習(xí)雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的原理和流程，熟悉單克隆抗體與基因工程抗體的制備技術(shù)。教學(xué)要求：1、掌握單克隆抗體及基因工程抗體的概念。雜交瘤技術(shù)的基本原理。2、熟悉單克隆抗體的制備技術(shù)?；蚬こ炭贵w的技術(shù)。3、了解單克隆抗體的應(yīng)用。抗體種類：第一代抗體多克隆抗體（polyclonalantibody)第二代抗體單克隆抗體（monoclonalantibody)第三代抗體基因工程抗體（geneticengineeringantibody)大多數(shù)抗原分子具有多個(gè)抗原決定簇。一個(gè)抗原決定簇刺激一個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生一種特異性抗體，一種抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生多種抗體稱為多克隆抗體。多克隆抗體（polyclonalantibody)由一個(gè)只識(shí)別一種抗原表位的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體稱為單克隆抗體。單克隆抗體理化性狀高度均一，其抗原結(jié)合部位完全相同，生物活性專一，特異性強(qiáng)，純度高，效價(jià)高，易于實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化及大量制備，是研究抗體的一重大突破。應(yīng)用比較廣，如試劑診斷盒，治療腫瘤，器官移植，自身免疫病等。單克隆抗體（monoclonalantibody)McAbandPcAb雜交瘤單克隆抗體在診斷、治療、預(yù)防和蛋白質(zhì)提純應(yīng)用中非常廣泛，但對人是異源性，人抗小鼠抗體，應(yīng)用基因工程技術(shù)減少小鼠源成分，保留原有的抗體特異性?；蚬こ炭贵w（geneticengineeringantibody)第一節(jié)雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)原理：聚乙二醇（PEG）：細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)

胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：反復(fù)的免疫學(xué)檢測篩選克隆化增殖的雜交瘤

細(xì)胞系單克隆抗體生成：接種雜交瘤

細(xì)胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價(jià)的單克隆抗體B淋巴細(xì)胞:壽命短,分泌特異系性抗體骨髓瘤細(xì)胞：壽命長雜交瘤細(xì)胞：壽命長，單克隆抗體流程一、雜交瘤技術(shù)細(xì)胞融合劑：PEG:分子量4000的PEG是最常用的細(xì)胞融合劑作用機(jī)理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開而有助于細(xì)胞融合作用特點(diǎn)：隨機(jī)發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同HAT培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細(xì)胞通過替代途徑合成DNAHAT選擇作用：淋巴細(xì)胞：不能生長，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細(xì)胞：不能生長，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻SP2/O:HGPRT-，TK-;

長命脾細(xì)胞:HGPRT+，TK+;短命(7天)雜交瘤細(xì)胞:HGPRT+，TK+;長命骨髓瘤細(xì)胞、脾細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞：長期生長繁殖利用淋巴細(xì)胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA從淋巴細(xì)胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息從骨髓瘤細(xì)胞獲得不斷繁殖的能力有限稀釋法(limitingdilution)

顯微操作法(micromanipulation)FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）軟瓊脂平板法(softagarmethod)

二、陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)與凍存特點(diǎn)：不需任何特殊設(shè)備克隆出現(xiàn)效率高實(shí)驗(yàn)室常用方法方法：細(xì)胞懸液通過系列稀釋每個(gè)培養(yǎng)孔含0.5～1個(gè)細(xì)胞有限稀釋法配制方案：雜交瘤細(xì)胞（（1～5）x106/ml)+細(xì)胞凍存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO)“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

第二節(jié)單克隆抗體的制備經(jīng)過反復(fù)克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤細(xì)胞株應(yīng)立即擴(kuò)大培養(yǎng)（除及時(shí)凍存的細(xì)胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應(yīng)盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體。一、單克隆抗體的產(chǎn)生動(dòng)物體內(nèi)誘生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只體外培養(yǎng)法：中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)

單抗含量不高，牛血清Ab難以去除腹腔注射法可溶性抗原：ELISA抗體捕獲法細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的抗原：免疫熒光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定細(xì)胞）二、 單克隆抗體的純化ELISAELISA多頭加樣槍Ig類型、亞類測定：雙擴(kuò)法或ELISA法特異性測定：抗原類似物的交叉反應(yīng)效價(jià)測定：用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示

表位測定：幾株單抗是否為不同表位特異的,用競

爭抑制法，相加指數(shù)法及微機(jī)集群分析親和性測定：測定親和常數(shù)K雜交瘤細(xì)胞染色體：秋水仙素裂解法，小鼠B細(xì)胞染色體40條，SP2/0細(xì)胞68條，雜交瘤細(xì)胞一般100多條McAb靶抗原分子量：常用westernblot三、 單克隆抗體的性質(zhì)鑒定四、單克隆抗體的特性高度特異性高度的均一性和可重復(fù)性弱凝集反應(yīng)和不呈現(xiàn)沉淀反應(yīng)對環(huán)境敏感性（一）單克隆抗體的特性優(yōu)點(diǎn)：在體外“永久”地存活并傳代用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。適用于以標(biāo)記抗體為特點(diǎn)的免疫學(xué)分析方法可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療（二）單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)與局限性局限性：固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體制備技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)工、價(jià)格較高

McAb

PcAb

抗原要求可以不純純度高得量高低特異性高低

穩(wěn)定低高沉淀反應(yīng)無有成本高低McAb與PcAb的比較McAbandPcAb第三節(jié)基因工程抗體制備基因工程抗體(Geneticengineeringantibody)

根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體。主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價(jià)抗體和雙特異性抗體。將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基因，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人Ab，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，產(chǎn)生大量完全人源化抗體一、人源化抗體方法：從雜交瘤細(xì)胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人-鼠嵌合抗體特點(diǎn)：減少了鼠源性抗體的免疫原性保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力（一）嵌合抗體嵌合抗體定義：指利用基因工程技術(shù)，將人抗體可變區(qū)（V）中互補(bǔ)決定簇（CDR）序列改換成鼠源單抗CDR序列。重構(gòu)成既具有鼠源性單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體。RAb亦叫“重構(gòu)型抗體”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可稱為“CDR移植抗體意義：多種特異的鼠源單抗有可能應(yīng)用于臨床治療（二）改型抗體Fab：抗原結(jié)合片斷Fv：可變區(qū)片段ScFv：單鏈可變區(qū)片段SdAb：單區(qū)抗體

二、小分子抗體小分子抗體其它生物活性蛋白融合三、抗體融合蛋白許多抗原抗體反應(yīng)要求雙價(jià)的抗原結(jié)合位點(diǎn)，使抗原分子上的兩個(gè)表位交聯(lián)或使兩個(gè)抗原分子連接。將識(shí)別腫瘤抗原的抗體和識(shí)別細(xì)胞毒性免疫效應(yīng)細(xì)胞表面分子的抗體連結(jié)在一起，可使效應(yīng)細(xì)胞更容易與腫瘤細(xì)胞結(jié)合識(shí)別，取得殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。四、雙特異性抗體分別分離純化兩種不同的McAb，使各抗體解離為單價(jià)抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價(jià)抗體通過化學(xué)試劑交聯(lián)起來，然后分離出目的組分。此法缺點(diǎn)是容易導(dǎo)致抗體失去活性，產(chǎn)物均一性不佳?；瘜W(xué)交聯(lián)BsAb將兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行再次融合，產(chǎn)生四源雜交瘤(quadroma)。但二次雜交瘤細(xì)胞株分泌的是兩套重鏈，輕鏈的隨機(jī)組合物。BsAb在其中的比例可為10%～50%不等。多倍雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性差，BsAb的產(chǎn)量少且活性低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，臨床應(yīng)用時(shí)存在人抗鼠抗體免疫反應(yīng)(HAMA)，因此不適用于臨床。細(xì)胞工程BsAb多采用抗體分子片段,如Fab，F(xiàn)v或ScFv,經(jīng)基因操作修飾后,或體外組裝為BsAb,或直接表達(dá)分泌型的BsAb?；蚬こ藼sAb第四節(jié)單克隆抗體的應(yīng)用檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑蛋白質(zhì)的提純小分子抗體的應(yīng)用抗體融合蛋白的應(yīng)用雙特異抗體的應(yīng)用抗體庫技術(shù)的應(yīng)用和前景病原微生物抗原、抗體的檢測腫瘤抗原的檢測免疫細(xì)胞及其亞群的的檢測激素測定細(xì)胞因子的測定一、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑病原體測定：肝炎病毒－HAV,HBV,HCV,HDV,HEVTORCH－弓形蟲,風(fēng)疹病毒,巨細(xì)胞病毒，單純皰疹病毒細(xì)胞表面CD測定：CD4/CD8:Th/Tc白血病的分型激素的測定：

內(nèi)分泌疾病的診斷藥物測定(TDM)：抗排斥藥物抗腫瘤藥物地高辛研究工作中的探針：越來越多未知功能cDNA的克隆對復(fù)雜的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加二、蛋白質(zhì)的提純單克隆抗體是親和層析中重要的配體。將單克隆抗體吸附在一個(gè)惰性的固相基質(zhì)（如Speharose2B、4B、6B等）上，并制備成層析柱。當(dāng)樣品流經(jīng)層析柱時(shí)，待分離的抗原可與固相的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，其余成分不能與之結(jié)合。將層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強(qiáng)度或pH，欲分離的抗原與抗體解離，收集洗脫液便可得到欲純化的抗原。定義：

分子量較小但具有抗原結(jié)合功能的分子片段優(yōu)點(diǎn)：分子量小,穿透性強(qiáng),抗原性低不含F(xiàn)c段，不會(huì)與帶有Fc段受體的細(xì)胞結(jié)合，不良反應(yīng)少可在原核系統(tǒng)表達(dá)及易于基因工程操作半衰期短，有利于及時(shí)中和及清除毒素三、小分子抗體的應(yīng)用應(yīng)用：用于腫瘤的導(dǎo)向治療腫瘤的影像分布基因治療細(xì)胞內(nèi)抗體：在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)特異性識(shí)別某一基因產(chǎn)物可干擾該基因產(chǎn)物的生物活性研究基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系腫瘤的體內(nèi)顯像診斷單鏈抗體排除速度快，穿透力強(qiáng)，在腫瘤組織中的分布指數(shù)較完整抗體分子高放射顯像時(shí)，放射性核素排除較快，對身體危害程度小，顯像的本底較低理想的顯像定位診斷載體病毒的診斷和抗病毒感染血液性疾病的診斷白血病的免疫診斷及分型四、抗體融合蛋白的應(yīng)用在體外免疫檢測中的應(yīng)用自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)快速檢測HBV和HIV病原體等避免化學(xué)交聯(lián)減低兩者的活性，從而提高酶免疫檢測的敏感度用雙特異抗體作為二抗，檢測限達(dá)1ng/ml五、雙特異抗體的應(yīng)用在體內(nèi)腫瘤放射免疫顯像診斷中的應(yīng)用方法：雙特異抗體的一只臂結(jié)合靶抗原，一只臂結(jié)合半抗原螯合劑，后者可選擇性地與放射性核素結(jié)合，利用二次導(dǎo)向系統(tǒng)顯示特點(diǎn)：更高的的靈敏度和清晰度在體內(nèi)免疫治療中的應(yīng)用抗體分子可與放射性核素、細(xì)胞毒藥物、毒素、等多種分子相融合，這些分子在抗體結(jié)合靶分子后可提供重要輔助功能雙功能抗體可有效針對低水平的腫瘤相關(guān)抗原，并將細(xì)胞毒物質(zhì)輸送到腫瘤細(xì)胞抗體還可與攜帶藥物的脂質(zhì)體、各種PEG偶聯(lián)，從而增強(qiáng)體內(nèi)運(yùn)輸和藥代動(dòng)力學(xué)1．雜交瘤技術(shù)是如何問世的？其基本原理是什么？2．什么是單克隆抗體？其特性和局限性如何？與多克隆抗體有何異同？3．雜交瘤細(xì)胞的克隆方法有哪些？4．細(xì)胞株凍融的原則是什么？5．大量制備單克隆抗體的方法有哪些，各有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？6．單克隆抗體的性質(zhì)鑒定的方法有哪些？7．?dāng)⑹鰡慰寺】贵w的制備流程和應(yīng)用。8．?dāng)⑹龌蚬こ炭贵w的概念和優(yōu)點(diǎn)。9．基因工程抗體的種類和應(yīng)用。10．抗體庫技術(shù)的原理和特性有哪些？思考題小結(jié)

雜交瘤單克隆抗體制備技術(shù)的原理是利用聚乙二醇作為細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)

胞與具有在體外不斷繁殖能力的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融為一

體，在HAT選擇性培養(yǎng)基的作用下，只讓融合成功的雜交瘤細(xì)胞生長，經(jīng)過反復(fù)的免疫學(xué)檢測篩選和單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)（克隆化）,最終獲得既能產(chǎn)生所需單克隆抗體,又能不斷繁殖