實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)與應(yīng)用課件

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)與應(yīng)用提綱PCR簡(jiǎn)介

熒光定量PCR技術(shù)原理熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介定量方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡(jiǎn)介：PCR概念什么是PCR？PolymeraseChainReaction(PCR)聚合酶鏈反應(yīng)是在體外選擇性的擴(kuò)增特定DNA片段的方法。ClassicPCRClassicPCRPCR循環(huán)第一步加熱變性、雙鏈打開第二步退火、引物與單鏈結(jié)合第三步-引物延伸變?yōu)閮蓚€(gè)雙鏈DNA常規(guī)PCR常規(guī)PCR技術(shù)：PCR后借助電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析S1S2MPowercycler提綱PCR簡(jiǎn)介

熒光定量PCR技術(shù)原理熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介定量方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡(jiǎn)介：定量PCR定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量分析Qtower2.2PCR反應(yīng)混合物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA多聚酶引物模板DNA或緩沖液熒光物質(zhì)提綱PCR簡(jiǎn)介熒光定量PCR技術(shù)原理

熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介定量方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡(jiǎn)介：

SYBRGreen1

TaqMan熒光化學(xué)SYBRGreenISYBRGreen1SYBRGreenI工作原理

SYBRGreen1

結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位

SYBRGreen1染料結(jié)合狀態(tài)時(shí)熒光強(qiáng)度是非結(jié)合狀態(tài)的800-1000倍GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAASYBRGreenISYBRGreenISYBRGreenI與傳統(tǒng)PCR的比較實(shí)現(xiàn)了初始模板的絕對(duì)定量檢測(cè)靈敏度高可以檢測(cè)到低拷貝的目的基因可以區(qū)分微小的拷貝數(shù)差異可以對(duì)初始模板含量差異較大的樣品同時(shí)定量省時(shí)省力檢測(cè)設(shè)計(jì)靈活MeltCurveAnalysisMeltCurveAnalysisSYBRGreenI優(yōu)點(diǎn)

使用方便 ---不必設(shè)計(jì)復(fù)雜的熒光探針

沒有序列特異性---可以用于不同的模板

便宜

靈敏SYBRGreenI缺點(diǎn)

與非特異性產(chǎn)物結(jié)合TaqMan探針熒光素淬滅劑TaqMan水解型雜交探針TaqMan

目標(biāo)特異性探針

5’為熒光素，3’為淬滅劑5’熒光素3’淬滅劑與目標(biāo)序列互補(bǔ)TAQMANProbesTAQMANProbesTAQMANProbesTAQMANProbesTaqMan優(yōu)點(diǎn)對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性

---特別適合于SNP檢測(cè)TaqMan缺點(diǎn)

價(jià)格較高

只適合于一個(gè)特定的目標(biāo)

不能進(jìn)行融解曲線分析背景高兼容化學(xué)試劑總結(jié)結(jié)合于雙鏈DNA的小溝中發(fā)夾型雜交探針?biāo)庑碗s交探針（5‘-3’外切）延伸復(fù)性任何步驟定量和檢測(cè)目標(biāo)基因融解曲線分析SNP分析定量和檢測(cè)目標(biāo)基因SNP分析定量和檢測(cè)目標(biāo)基因信號(hào)檢測(cè)工作原理有否淬滅劑化學(xué)試劑否有有主要應(yīng)用范圍熒光曲線

隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度不斷增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光強(qiáng)度信號(hào)，得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖定量原理

如何對(duì)起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量分析引入兩個(gè)概念：熒光閾值、Ct值定量原理熒光閾值在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期設(shè)定一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn))閾值線定量原理Ct值的概念Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物(熒光信號(hào)）到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t)值C(t)值18.12+/0.04-閾值線提綱PCR簡(jiǎn)介熒光定量PCR技術(shù)原理熒光化學(xué)物質(zhì)簡(jiǎn)介定量方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡(jiǎn)介：

絕對(duì)定量確定初始模板的準(zhǔn)確含量需要標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量確定樣品間初始模板的含量倍數(shù)差異相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線不使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用Ct值計(jì)算

ΔCt方法

ΔΔCt方法（看家基因）

Pfaffl方法（考慮擴(kuò)增效率）

Vandesompele方法（多看家基因）14500copies定量方法

借助標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值反推出其初始量得到未知樣品初始量絕對(duì)值unknown104103Unknowncontains3108copies絕對(duì)定量

ΔCT法相對(duì)定量無均一化處理均一化依賴于加樣的一致性相對(duì)定量——ΔCT

Sample1Ct1(25)Sample2Ct2(22)ΔCT=Ct1-Ct2=25-22=3基因表達(dá)量Sample1/Sample2=2

–ΔCT=2-3=1/8相對(duì)定量——ΔΔCTΔΔCT法相對(duì)定量考慮到了加樣誤差通常使用看家基因來完成均一化處理Sample1Ct1(25)Sample2Ct2(22)內(nèi)參基因actinCt0120Ct0221ΔCT1=Ct1-Ct01=25-20=5ΔCT2=Ct2-Ct02=22-21=1ΔΔCT=ΔCT1-ΔCT2=5-1=4基因表達(dá)量Sample1/sample2=2-

ΔΔCT=2-4=1/16SimpleComplex2CT

假定目的基因與看家基因的擴(kuò)增效率都是100%

只有一個(gè)看家基因

PfafflModification

考慮到擴(kuò)增效率的影響只有一個(gè)看家基因

VandesompeleMethod

考慮到擴(kuò)增效率的影響有多個(gè)看家基因相對(duì)定量

利用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，定量結(jié)果相除得到倍數(shù)差別同時(shí)建立兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線一條目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線至少再做一條看家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線借助標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)擴(kuò)增效率的影響使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行相對(duì)定量分析相對(duì)定量——標(biāo)準(zhǔn)曲線法

進(jìn)行可靠的定量實(shí)驗(yàn)需要對(duì)引物對(duì)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)用于優(yōu)化擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量和特異性的參數(shù)

引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段選擇試劑的濃度循環(huán)條件變性溫度和退火溫度PCR體系優(yōu)化利用動(dòng)態(tài)溫度梯度功能一次實(shí)現(xiàn)退火溫度的優(yōu)化退火溫度的優(yōu)化45oC55oC65oC溶解曲線擴(kuò)增曲線1.95oCfor15min2.94oCfor10sec3.Gradientfrom45oCto65oCfor15sec4.72oCfor30sec5.83oCfor1sec6.PlateRead7.Gotoline239moretimes8.Meltingcurvefrom65oCto95oC,read

every0.2oC,hold1sec.退火溫度的優(yōu)化實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用定量：

DNA定量

RNA定量定性：

SNP分析基因型分析

RNA變異分析融解曲線分析定量PCR應(yīng)用I-實(shí)時(shí)定量

病原體定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)DNA定量——拷貝數(shù)研究（替代SouthernBlot）RNA定量——基因表達(dá)差異（替代NorthernBlot)

單個(gè)或多個(gè)基因地表達(dá)譜分析不同組織、器官不同時(shí)期不同處理定量PCR應(yīng)用II：