高效液相色譜的基礎知識

高效液相色譜的基礎知識

1高效液相色譜法的特點2高效液相色譜法儀器工作原理3高效液相色譜儀的維護4高效液相色譜法儀的注意事項5高效液相色譜的分析應用高效液相色譜法的特點

高效液相色譜法（HPLC）是20世紀60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術，隨著不斷改進與發(fā)展，目前已成為應用極為廣泛的化學分離分析的重要手段。它是在經(jīng)典液相色譜基礎上，引入了氣相色譜的理論，在技術上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。為了更好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面進行比較：高效液相色譜法的特點

1．高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設備，流速最高可達103cm·min-1.例如對氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，需用20多小時才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內(nèi)即可完成。高效液相色譜法的特點2．高效液相色譜法與氣相色譜法（l）氣相色譜法分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物總數(shù)的20％。對于占有機物總數(shù)近80％的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進行分離和分析。

(2)氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運載作用。而高效液相色譜法中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此，流動相對分離起很大作用，相當于增加了一個控制和改進分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。

(3)氣相色譜一般都在較高溫度下進行的，而高效液相色譜法則經(jīng)常可在室溫條件下工作。高效液相色譜法的特點分析速度快——通常分析一個樣品在15~30min，有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。選擇性高——可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，可分析同類型的有機化合物及其同分異構體，還可以分析在性質(zhì)上極為相似的旋光異構體。靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。柱子可反復使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。高效液相色譜法的特點

超高效液相色譜(UPLC)—是區(qū)別于HPLC的液相色譜新領域—基于小顆粒填料和LC原理的一種創(chuàng)新技術—實現(xiàn)超高分離度、靈敏度、分析速度1高效液相色譜法的特點2高效液相色譜法儀器工作原理3高效液相色譜儀的維護4高效液相色譜法儀的注意事項5高效液相色譜的分析應用高效液相色譜儀工作原理

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高壓輸液系統(tǒng)?

進樣系統(tǒng)?

分離系統(tǒng)?

檢測系統(tǒng)高效招液相睬色譜紅儀工捉作原奇理其工垃作過線程如紋下：稠首先妨高壓蝴泵將鐮貯液孔器中躲流動持相溶擴劑經(jīng)碌過進信樣器灰送入召色譜岔柱，乒然后傲從控息制器炒的出裹口流晨出。校當注景入欲但分離術的樣茅品時彩，流盛經(jīng)進磁樣器也貯液爐器的尚流動階相將蛾樣品當同時止帶入竊色譜霸柱進諸行分庭離，咱然后懷依先見后順改序進迫入檢警測器總，記魯錄儀痰將檢肚測器梁送出城的信鹽號記淹錄下俱來，裙由此怨得到拿液相麗色譜般圖。高效犯液相竭色譜慕儀工無作原肢理1．高譜壓輸墨液系跳統(tǒng)由于筒高效角液相疾色譜勒所用漏固定袍相顆撫粒極送細，巷因此輔對流淡動相窯阻力樂很大映，為仙使流新動相襖較快但流動蓬，必巡壽須配見備有歪高壓顆輸液僅系統(tǒng)盡。它撤是高拳效液泊相色革譜儀羨最重饅要的素部件肌，一球般由粉儲液怒罐、卸高壓則輸液柜泵、瘡過濾麻器、貫壓力始脈動藍阻力忍器等找組成亡，其辭中高久壓輸蠻液泵蘇是核友心部要件。防對于泛一個味好的叔高壓致輸液倆泵應覆符合開密封喝性好帥，輸倘出流堤量恒問定，橋壓力定平穩(wěn)裝，可派調(diào)范泊圍寬店，便蠟于迅碼速更盼換溶哨劑及日耐腐末蝕等盜要求懶。常旗用的緒輸液盲泵分倍為恒暈流泵粱和恒讓壓泵顛兩種飼。恒災流泵弄特點腹是在浮一定碼操作保條件疑下，昂輸出銳流量儀保持場恒定頌而與桌色譜引柱引趴起阻肅力變渴化無穴關；幼恒壓彩泵是授指能頂保持沃輸出墓壓力蝕恒定認，但伯其流沫量則相隨色飛譜系酬統(tǒng)阻北力而秤變化云，故洋保留其時間獎的重率視性真差，謠它們舉各有呀優(yōu)缺卻點。融目前秤恒流昆泵正臥逐漸晨取代顆恒壓媽泵?？昂懔鞯糜众A稱機郵械泵距，它薪又分釀機械瓦注射尖泵和溝機械來往復總泵兩濾種，雅應用卻最多欠的是衛(wèi)機械都往復施泵。高效艱液相券色譜權儀工桐作原斧理2．進毫樣裝屈置高效罰液相恰色譜巾儀工星作原通理3分離煤系統(tǒng)——色譜攜柱色譜垮柱是閥液相津色譜攔的心邊臟部腰件，裝它包挽括柱訪管與斯固定弄相兩胞部分醒。柱照管材絲式料有映玻璃躬、不馳銹鋼肅、鋁育、銅脅及內(nèi)頂襯光安滑的免聚合悶材料好的其火他金局屬?；糜癫ＡдZ管耐底壓有巾限，塔故金鏈屬管匹用得盒較多充。一史般色披譜柱監(jiān)長5～30鬼cm，內(nèi)督徑為4～5m勵m，凝信膠色輕譜柱末內(nèi)徑3～12資mm，制俊備往團內(nèi)徑蘿較大辣，可垂達25翠mm以上決。一婦般在列分離拴前備掘有一鵲個前顏置柱鋤，前明置柱暴內(nèi)填外充物考和分彎離柱柴完全療一樣煉，這賠樣可慢使淋冰洗溶獻劑由得于經(jīng)岡過前冰置柱比為其歌中的鐘固定懶相飽怒和，赤使它梳在流挨過分言離柱圓時不吊再洗膝脫其秒中固跌定相蜻，保士證分衫離技漏的性脊能不污受影凡響。柱子類裝填貍得好緩壞對小柱效拆影響駛很大蜂。對椅于細厭粒度妙的填內(nèi)料（排＜20響μm）一脈般采變用勻趴漿填矩充法凡裝柱遭，先姥將填匹料調(diào)揮成勻押漿，箭然后養(yǎng)在高敵壓泵撤作用島下，夜快速核將其口壓入傳裝有陡洗脫根液的狡色譜適柱內(nèi)面，經(jīng)俯沖洗駱后，惜即可燭備用向。高效沉液相崖色譜宣儀工牽作原考理4．檢榜測系致統(tǒng)目前冶有兩貿(mào)種基痰本類聾型的閱檢測往器:一類柴是溶封質(zhì)性完檢測裁器，夾它僅陶對被千分離蜘組分怒的物嚷理或墓化學芹特性昨有響以應，哄屬于訴這類訂檢測晨器的焦有紫什外、秤熒光腫、電劍化學滾檢測蝴器等癢。另一憲類是缺總體聞檢測長器，渴它對惜試樣任和洗吉脫液揀總的申物理購或化享學性欠質(zhì)有酷響應晚，屬辱于這夏類檢牢測器趴的有窄示差閥折光狹，蒸芳發(fā)光界散射呀，電缸導檢朋測器跑等。高效拜液相鐘色譜德儀工棗作原澤理（1）紫侍外檢娃測器工作偽原理頸：基于La陽mb志er招t-厘Be真er定律肢，即惕被測戰(zhàn)組分扯對紫另外光報或可州見光弱具有直吸收連，且惕吸收餃強度思與組見分濃滿度成搶正比顫。通用把型檢普測器恐約有80％的投分析砌樣品泳具有迅紫外偵吸收,可以歡使用賴這種波檢測叮器檢腿測。高效尚液相瓜色譜違儀工留作原盤理（1）紫外場檢測每器優(yōu)點:a:靈敏殲度高b:線性辟范圍賠廣C:對溫哀度和純流速谷不敏咳感，悄適于懷進行逐梯度齡洗脫限制:a:沒有飽紫外懸吸收析的物宴質(zhì)不靠能檢漫測b:應盡鞠可能叨選擇吐在檢蘇測波米長下轟沒有航背景普吸收時的流膠動相(限制射了一家些截偏止波棚長在20將0~統(tǒng)30哄0n耽m之間鎖的良撓好溶掌劑的櫻使用)高效洞液相紹色譜征儀工糞作原些理（1）紫翻外檢階測器（2）熒巾光檢貿(mào)測器原理:物質(zhì)鉗的分蠅子或女原子傘經(jīng)光么照射欄后，途有些宿電子但被激答發(fā)至增較高促的能闖級狀，這晨些電劣子從酒高能碼級哀躍至蘭低能常級時隱，物宣質(zhì)會釀發(fā)出總比入司射光灣波庭長較孝長氧的光楊，這陪種光黃稱為鉗熒光組。熒頌光檢疼測器五就是厘在樣灑品的纖激發(fā)晝波長復處檢娛測發(fā)喝射光脖的強雙弱.熒光坐檢測夾器是桂一種瘡選擇磨性檢竄測器不到20罪%的物籠質(zhì)使作用這決種檢露測手欲段,許多滴藥物碧采用面這種躁檢測偽方法.高效名液相悅色譜襪儀工寨作原饑理（1）紫芒外檢聲測器（2）熒蒙光檢棟測器優(yōu)點:a:靈敏符度非蛙常高(靈敏槍度在躍目前拾常用灶的HP壓LC檢測蒼器中啞最高)，比息紫外料檢測蛋器高2—3個數(shù)撞量級帥，適森合于螞痕量酸分析b:可以班用于嬸梯度武洗脫c:對儀驚器的到穩(wěn)定猾性（蜂如溫創(chuàng)度和樣壓力攔的穩(wěn)持定性株）依旨賴較拋小d:選擇裂性好頁，優(yōu)病于紫脂外缺點:a:適用標范圍布有一筆定的燃局限厲性–只適億用于遼有熒捕光基惡團＆盛衍生忍化之攪后有爪熒光凝基團賄的化用合物b:定量陣分析吃時線教性范透圍較咳窄它適宏合于男稠思環(huán)芳疼烴、倡氨基汽酸、餃胺類遣、維僑生素棚、蛋墓白丙質(zhì)等騰熒光膝物質(zhì)爺?shù)臏y外定高效辰液相譜色譜繳儀工墳作原詠理（1）紫所外檢愉測器（2）熒刷光檢盛測器（3）二摩極管芝陣列百檢測紋器原理:光電愿二極萌管陣狡列（口或CC假D陣列充，硅驢靶攝捎像管音等）抓作為切檢測似元件持的UV替-V怎IS檢測牙器。閱它可礙構成哨多通黎道并氧行工吉作，糟同時雁檢測羅由光鐵柵分蘭光，屬再入頓射到扭陣列慣式接柿受器奮上的巖全部叼波長論的信丙號，漿然后襯，對猛二極寶管陣循列快挎速掃須描采爹集數(shù)暖據(jù)，斥得到怕的是始時間聾、光絞強度喬和波歷長的艇三維慘譜圖度。高效汁液相僑色譜虎儀工尋作原叛理（1）紫算外檢這測器（2）熒裁光檢陜測器（3）二夫極管憲陣列介檢測荒器高效管液相辰色譜末儀工冰作原振理（1）紫碑外檢冠測器（2）熒燒光檢闊測器（3）二短極管覽陣列功檢測語器與普雕通UV包-V母IS檢測戚器不頭同之紗處:a:普通UV猛-V推IS檢測艷器是辱先用功單色碰器分你光，羊只讓員特定歐波長梯的光摧進入宰流動險池。而二煎極管虛陣列UV該-V扮IS檢測血器是糞先讓洽所有理波長坐的光共都通右過流永動池喜，然萍后通裝過一潔系列畫分光碑技術邊，使骨所有艙波長泉的光避在接葉受器犬上被唱檢測.b:普通UV鞠-V店IS檢測不器只貓能得燒到二踐維的煤譜圖,而DA購D可以鄙得到什三維宮圖譜.高效杏液相篩色譜呆儀工昏作原特理（1）紫墊外檢字測器（2）熒攏光檢瓣測器（3）二碼極管歐陣列伸檢測突器應用a:色譜偷峰純偉度檢旬查b:色譜參峰鑒英定三維臟色譜坡能提仍供更汁多全咸面的奇信息溜。高效天液相逮色譜根儀工嗎作原癢理（1）紫剖外檢額測器（2）熒晌光檢獅測器（3）二參極管能陣列芝檢測夢器（4）示珠差折胖光率模檢測聾器是一紹種通翅用型榴檢測哄器，正只要趁被測握組分篩與洗嘴脫液凳的折喜光指角數(shù)有按差別坦就可汁使用副。生蛋命科福學中提常遇殲到各檢類糖痛類化紋合物勇，沒肝有紫扒外吸錫收，鏟一般纖常用置示差墻折光震檢測就器。強它的依通用下性比UV左D廣，絹但靈兵敏度灣要低族，對傷溫度插變化盒敏感弱，并炒與梯皇度洗鼓脫不電相容島，因頓而限形制了紋它的栽使用秘。高效液液相淋色譜燦儀工雞作原度理（1）紫津外檢硬測器（2）熒止光檢苗測器（3）二確極管此陣列應檢測渴器（4）示萌差折鍬光率從檢測穴器（5）電殿導檢桑測器電化主學檢競測器視（EC爆D）EC壓D是根黑據(jù)物杯質(zhì)的繳電還蹦原性躍和電明氧化霜性來字進行框檢測件的，壩應用戚于對渴紫外濃光沒愿有吸枕收或間不能頑發(fā)出婆熒光希，但脹具有晚電活廳性的噸物質(zhì)若測定抱。若股結合沒衍生窗技術孔，也臉可應黎用于指非電肥活性勵物質(zhì)置的檢么測。蘇安培炮檢測惜器和柔電導攏檢測愧器在化生化崗、醫(yī)堆學、慢食品償和環(huán)壇境分束析中戴獲得報廣泛阿的應夢用。1高效搶液相像色譜員法的縫特點2高效墊液相證色譜四法儀死器工架作原驗理3高效并液相糠色譜壞儀的屬維護4高效室液相壟色譜養(yǎng)法儀據(jù)的注鞭意事兵項5高效擦液相痕色譜彎的分設析應峽用高效扔液相柴色譜激儀的除維護泵的夕使用匪和維棵護防止才任何羊固體算微粒愚進入課泵體解，因袖為塵淘埃或僑其它爐任何溪雜質(zhì)登微粒承都會冶磨損估柱塞苦、密洽封環(huán)周、缸成體和認單向車閥，防因此調(diào)應預臨先除版去流講動相龍中的依任何肯固體接微粒胞。流螞動相斬最好義在玻舊璃容格器內(nèi)情蒸餾突，而駝常用伏的方歐法是懲濾過沸，可品采用Mi霉ll構ip憶or孟e濾膜棉（0.芬2μm或0.尋45μm）等旦濾器枯。泵獸的入巷口都斑應連恰接砂洞濾棒覽（或票片）椒。輸貼液泵射的濾疲器應橫經(jīng)常偷清洗惜或更扁換。流動階相不屠應含柄有任拐何腐妙蝕性太物質(zhì)柜，含肚有緩向沖液衫的流烏動相障不應猴保留驅(qū)在泵膏內(nèi)，受尤其梅是在蒙停泵桑過夜近或更驕長時足間的謎情況尾下。醬如果僵將含起緩沖貝液的紐奉流動輸相留議在泵爬內(nèi)，頃由于柔蒸發(fā)蔬或泄勾漏，乘甚至悼只是版由于痛溶液輸?shù)撵o零置，佩就可紐奉能析條出鹽滋的微華細晶窩體，朝這些緞晶體湊將和首上述蘆固體音微?？湟粯硬蹞p壞工密封乓環(huán)和陜柱塞雨等。棟因此遲，必踏須泵證入純縱水將劇泵充絡分清肝洗后易，再鑼換成揪適合騾于色看譜柱隙保存京和有黃利于輸泵維指護的犬溶劑引（對喂于反臉相鍵我合硅厘膠固邁定相獲，可則以是猾甲醇弦或甲霸醇-水）槐。泵工臭作時季要留槐心防任止溶港劑瓶妨內(nèi)的地流動生相被苦用完須，否產(chǎn)則空著泵運腳轉(zhuǎn)也喜會磨敘損柱秘塞、龍缸體山或密妙封環(huán)艱，最撐終產(chǎn)明生漏軟液。輸液希泵的天工作饑壓力硬決不組要超筒過規(guī)律定的禁最高挖壓力蒸，否拿則會跟使高綠壓密單封環(huán)找變形急，產(chǎn)單生漏突液。流動說相應喇該先巷脫氣鴉，以灣免在飼泵內(nèi)謙產(chǎn)生績氣泡胖，影艷響流籮量的泡穩(wěn)定馬性，裕如果栗有大慶量氣駱泡，蹈泵就典無法錢正常央工作高效李液相貢色譜坐儀的蹄注意閑事項柱的瞧使用失和維播護1、使虹用前仁仔細撞閱讀甜色譜番柱附石帶的車說明六書，勾注意尸適用孫范圍螺，如pH值范去圍、撐不得邁注射更強酸慌強堿耳的樣狂品，記特別壇是堿尼性樣罩品。2、使某用符鳳合要移求的凳流動炎相；3、使苦用保文護柱撥；4、如裳所用捧流動言相為啦含鹽朵流動敞相，擾反相殃色譜鮮柱使漆用后導，先鎖用水減或低勁濃度笑甲醇腎水（培如5％甲憲醇水漏溶液妻），籃再用裙甲醇倘沖洗識。5、長演時間改不用王儀器斜，應防該將炕柱子袖取下朋用堵櫻頭封虎好保鈔存，戴注意丑不能交用純踩水保眨存柱緒子，茫而應蛋該用略有機時相(如甲運醇等)，因盡為純?nèi)彼茁L霉蠻。6、調(diào)不要亦高壓淺沖洗采柱子腳；7、俯不要差在高游溫下作長時俗間使黑用硅控膠鍵者合相笛色譜法柱；使用殲過程午中注館意輕倚拿輕就放。高效供液相出色譜緒儀的舅維護流動拼相的尼脫氣HP銀LC所用瓶流動缺相必頂須預悔先脫公氣，因否則席容易犬在系娘統(tǒng)內(nèi)手逸出鍬氣泡虧，影仰響泵角的工烤作。太氣泡奴還會桿影響扮柱的面分離您效率辯，影拴響檢獎測器毫的靈才敏度坊、基便線穩(wěn)常定性神，甚減至使昆無法污檢測此。（慰噪聲續(xù)增大裝，基川線不籌穩(wěn)，滲突然權跳動乓）。聰此外要，溶昨解在商流動現(xiàn)相中跨的氧撲還可襯能與熔樣品委、流暖動相歪甚至著固定扇相（全如烷黑基胺鍛）反父應。穩(wěn)溶解師氣體抱還會再引起妙溶劑pH的變述化，滅對分眠離或卻分析剝結果怕帶來但誤差網(wǎng)。高效孤液相味色譜爹儀的攤維護紫外嘉燈的秘保養(yǎng)拉：在分貍析前評、柱閥平衡孟得差筋不多童時，屋打開犧檢測量器；或在分迎析完亂成后夕，馬掃上關翠閉檢敘測器具。1高效刪液相痕色譜押法的取特點2高效確液相菜色譜液法儀貝器工攪作原咽理3高效桃液相框色譜姨儀的膛維護4高效豪液相索色譜膛法儀芝的注充意事遷項5高效友液相抄色譜鋼的分侮析應負用高效釋液相魄色譜圈儀的亂注意圖事項一、殿流動并相1、流鎮(zhèn)動相圾應選澡用色會譜純希試劑孕、高靜純水響或雙掙蒸水母，酸烏堿液非及緩錫沖液灶需經(jīng)令過濾榆后使媽用，華過濾腎時注朵意區(qū)切分水販系膜拜和油照系膜回的使隸用范辦圍；2、水火相流插動相翁需經(jīng)咸常更圍換（攀一般抵不超焰過2天）阿，防員止長邀菌變藥質(zhì).高效游液相哀色譜餓儀的囑注意啄事項二、務樣品1、采磚用過懲濾或魚離心隆方法唯處理牲樣品箱，確萄保樣駕品中滿不含憤固體脾顆粒竊；2、用燦流動詞相或虜比流循動相喚弱（業(yè)若為獎反相里柱，淘則極伴性比綱流動窗相大營；若菜為正耕相柱悉，則嫁極性鑒比流槽動相躍?。H的溶盾劑制夜備樣堅品溶狹液，信盡量千用流罪動相買制備捕樣品洪液高效堡液相蹤蝶色譜抖儀的護注意的事項三、煩操作條過程1、先杠以所酸用流翼動相竊沖洗慣系統(tǒng)肯一定串時間守（如填所用盆流動奇相為拆含鹽濃流動哭相，鍛必須難先用敗水沖世洗20分鐘器以上甚再換盈上含潤鹽流得動相伶），路正式尸進樣茂分析蓄前30何mi誦n左右睬開啟D燈或W燈，狹以延撒長燈它的使牽用壽圈命；2、溶疾劑瓶饅中的倍沙芯新過濾吹頭容洪易破寸碎，君在更行換流種動相震時注督意保硬護，胞當發(fā)更現(xiàn)過煮濾頭鑄變臟刮或長玩菌時煉，不甜可用遠超聲橋洗滌