去乙酰組蛋白

組蛋白去乙?；窱的ShRNA真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建ConstructionofshRNAeucharyoticexpressionplasmidtargetedHDACI姜雪蓮1、李瀟婷1、胡倩倩1、郭志義2（1.河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)院 08生物和09生物河北唐山0630002.指導(dǎo)教師河北聯(lián)合大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心）摘要［目的］構(gòu)建HDACI的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒。［方法］應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法，檢測肺癌A549細(xì)胞系HDACI的表達(dá)情況。設(shè)計(jì)寡聚核苷酸片段，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建HDACI的shRNA表達(dá)質(zhì)粒，測序確認(rèn)。通過轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測其抑制效果。［結(jié)果］A549細(xì)胞HDAC1有表達(dá)。構(gòu)建四個(gè)shRNA質(zhì)粒，測序正確。抑制效率分別為：76%,88%,76%,90%。［結(jié)論］我們構(gòu)建了高效HDACI的ShRNA表達(dá)質(zhì)粒。關(guān)鍵詞：組蛋白去乙?；窱；shRNA;質(zhì)粒Abstract:［Objective］ToconstructshRNAeucharyoticexpressionplasmidtargetedHDACI.［Methods］theabundanceofHDACImRNAlevelwasdetectedbyRT-PCRinA549cells.Theplasmidwasconstructedbymoleculartechniqueswiththedesignedoligonucleotide.TheplasmidwasidentifiedbyendoenzymedigestionandPCR,confirmedbyDNAsequencing.TheinhibitoryefficiencywasvalidatedbyRealTimeRT-PCR.［Results］thereareexpressionofHDACImRNAinA549cellline.EndoenzymedigestionandPCRanalysisshowedthatthepatternsandsizelengthofthefragmentmetthedesignexpectation.ThesequencewasconfirmedbyDNAsequencing.RealTimeRT-PCRanalysisshowedthattheinhibitoryefficiencywere76%,88%,76%,90%.［Conclusion］TheshRNAplasmidstargetedHDACIwereconstructedsuccessfully.Keywords:HDACI;shRNA;plasmid組蛋白乙?；揎検侨旧|(zhì)重塑機(jī)制之一，在真核基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用［1］。組蛋白去乙?；福╤istonedeacetylase,HDAC）是一類蛋白酶，負(fù)責(zé)組蛋白的去乙?；揎?，和組蛋白乙?；福℉AT）一起共同調(diào)控組蛋白的乙?；潭?，對(duì)染色體的結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要的作用。本研究我們分析肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的HDACI的表達(dá)情況，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了HDACI的ShRNA表達(dá)質(zhì)粒，并在A549細(xì)胞系中進(jìn)行了抑制效果的檢測，為HDACI機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料A549細(xì)胞由本室保存°DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)為DL2000為Takara公司產(chǎn)品。內(nèi)切酶BamHI和Hindlll購自NEB公司。寡核苷酸片段由北京博邁德公司合成：HDACI的ShRNA寡聚核苷酸序列：序列1：5'-ATGAAGCCTCACCGAATCCGCATGACTCA-3';序列2：5'-ATTTGCTGCTCAACTATGGTCTCTACCGA-3';序列3：5/-AATAAGCAGCAGACGGACATCGCTGTGAA-3';序列4：5'-GTCCAAAGTAATGGAGATGTTCCAGCCTA-3'。HDACImRNA檢測引物：上游引物：5'-GGTCCAAATGCAGGCGATTCCTG-3';下游引物5'-TCGGAGAACTCTTCCTCACAGG-3'。內(nèi)參照GAPDH引物為：上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3';下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTT-3'。逆轉(zhuǎn)錄酶和擴(kuò)增PCR試劑為invitrogen產(chǎn)品，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑為Qiagen公司產(chǎn)品。普通PCR儀（PTC-100）為MJResearch公司產(chǎn)品。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為Qiagen公司Rotergene3000型。1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按Lipofectamine2000使用說明進(jìn)行.轉(zhuǎn)染前一天A549細(xì)胞以1x105個(gè)/孔的密度接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后細(xì)胞生長至70%?80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前將培養(yǎng)基換成不含血清的新鮮培養(yǎng)基。每孔加入質(zhì)粒2口g。轉(zhuǎn)染5h后，置換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。1.2.2總RNA提取六孔板每孔加入1mlTRIzol,加入200口l氯仿，靜置3min，離心15min,取上清，加入等體積異丙醇，室溫靜置0min，離心、，用75%乙醇清洗沉淀，室溫靜置2min，溶于20口lDEPC處理過的水中。1.2.3RT-PCR分析逆轉(zhuǎn)錄：頃ldNTP(各10mMol/L),1口L50口mol/LOligo(dT)18,2口g細(xì)胞總RNA,加DEPC水至12口l,65°C加熱5min,置冰上5min后，加4口l5倍的第一鏈合成緩沖液，2口l的0.1Mol/LDTT,40URNasin,200UM-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，37°C反應(yīng)1h,70°C加熱15min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。PCR反應(yīng)條件：94°C5min;94°C變性30s,58C退火30s,72C延伸30s,循環(huán)30次，PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳DNA用)膠濃度為5%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR為98C15s,58C20s，循環(huán)40次。1.2.1質(zhì)粒構(gòu)建pRSShRNA載體BamHI和Hindlll酶切回收。將BamHI和Hindlll酶切載體DNA片段頃l與退火的寡聚核苷酸反應(yīng)物片段以2口l混合，加入1.5口l10x連接反應(yīng)緩沖液(0.5MTris-HCl,pH7.80.1MMgCl,0.2MDTT,10mMAT)1UT4DNA連接酶，加雙蒸水至15口l,25C水浴連接3h。2寡聚核苷酸退火條件如下：95C3min,72C3min,25C3min。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，具體方法如下：10口l5xKCM(0.5MKCl,0.15MCaCl,0.5MMgCl)與連接產(chǎn)物混合，加水至50口l,與50口l感受態(tài)大腸桿菌混合，在冰浴中反應(yīng)220min，室溫10min,加500口l無抗性LB于37C培養(yǎng)30min。取100口l轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂于含有適當(dāng)抗性的LB瓊脂培養(yǎng)板，37C培養(yǎng)過夜。2結(jié)果A549細(xì)胞的HDACI表達(dá)。提取A549細(xì)胞RNA,RT-PCR擴(kuò)增。PAGE跑膠EB染色觀察，可以看出A549細(xì)胞表達(dá)HDACI,HDACII和HDACIII(圖1)。圖lHDACI、II、IIImRNA在A549細(xì)胞中的表達(dá)水平shRNA質(zhì)粒鑒定小量提取待鑒定質(zhì)粒DNA,經(jīng)BamHI和Hindlll酶切，選擇正確質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序來最終確定。由于在構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)候BamHI位點(diǎn)被破壞，因此不能被切開，而Hind111可以切開，說明質(zhì)粒構(gòu)建正確(圖2)。

HDAC1.1.1HDACI.1.2HDAC1.2.1HDAC1.2.2HDAC1.3.1HDAi；1.3.2HDAC1A1HDAC1.-L2

1231231~~2~^123123123123123圖2：人HDACI的ShRNA酶切鑒定（1代表未酶切；2代表BamHI酶切；3代表HindIII酶切）選擇陽性克隆測序鑒定，結(jié)果正確（圖3）TargetSequence躊nia用nt?uence圖TargetSequence躊nia用nt?uence圖3shRNA質(zhì)粒抑制效率的檢測。取lug四種HDACI的shRNA和陰性對(duì)照質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。24h后取樣，RT-PCR顯示抑制效率分別為：76%,88%,76%,90%;溶解曲線表現(xiàn)為單峰。（圖4）內(nèi)參GAPDH內(nèi)參GAPDHHDAC1HDAC1 內(nèi)參GAPDH圖4HDACI以及內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增曲線以及溶解曲線(A為擴(kuò)增曲線，B為溶解曲線)3討論進(jìn)入后基因組時(shí)代，生命科學(xué)研究的主要任務(wù)是闡明人類基因組所包含基因的生物功能以及功能表現(xiàn)的分子調(diào)控機(jī)制。與原核生物不同，在真核生物細(xì)胞中，基因組DNA組裝于以核小體為基本單位的染色質(zhì)纖維中。DNA的序列信息(sequenceinformation)被染色質(zhì)纖維形成的組裝環(huán)境所掩蓋，只有當(dāng)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境影響下發(fā)生染色質(zhì)重塑(chromatinremodeling)，使特定基因啟動(dòng)子區(qū)高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其DNA序列調(diào)控功能才得以實(shí)現(xiàn)［1］。組蛋白乙?；揎検侨旧|(zhì)重塑之一。組蛋白去乙?；?histonedeacetylase,HDAC)是一類蛋白酶［2］,對(duì)染色體的結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要的作用。一般情況下，組蛋白的乙?；欣贒NA與組蛋白八聚體的解離，核小體結(jié)構(gòu)松弛，從而使各種轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子能與DNA結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，激活基因的轉(zhuǎn)錄。在癌細(xì)胞中，一般HDACs的過度表達(dá)導(dǎo)致去乙?；饔玫脑鰪?qiáng)，通過恢復(fù)組蛋白正電荷，從而增加DNA與組蛋白之間的引力，使松弛的核小體變得十分緊密，抑制包括一些抑癌基因在內(nèi)的基因表達(dá)。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是指一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，在基因功能研究，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究等領(lǐng)域被廣泛研究。RNA干擾現(xiàn)象是1990年由約根森(Jorgensen)研究小組在研究查爾酮合成酶對(duì)花青素合成速度的影響時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)［3］。在1998年，AndrewZ.Fire等在C.elegans中進(jìn)行反義RNA抑制實(shí)驗(yàn)時(shí)意外地發(fā)現(xiàn)，作為對(duì)照加入的雙鏈RNA相比正義或反義RNA反而顯示出了更強(qiáng)的抑制效果，AndrewZ.Fire將這種現(xiàn)象第一次命名為RNA干擾[4]，并于2006年獲得諾貝爾生理及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。目前應(yīng)用的RNAi有合成的寡聚核糖核苷酸以及構(gòu)建載體。前者是使用快捷，但由于RNA容易降解，所以操作復(fù)雜，而且實(shí)驗(yàn)不易重復(fù)；而后者由于制備成質(zhì)粒，因此實(shí)驗(yàn)更簡潔，重復(fù)性好，同時(shí)某些載體還可以通過篩選插入細(xì)胞基因組DNA形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，使實(shí)驗(yàn)更加方便。本研究我們選擇后者。小發(fā)卡或短發(fā)卡RNA(asmallhairpinRNAorshorthairpinRNA,shRNA)是一段具有緊密發(fā)卡環(huán)的RNA序列，常被用于RNA干擾沉默靶基因的表達(dá)[5,6]。研究表明與常用的22mer不同，29mer長度的shRNA的抑制效率更高[7]。本研究我們即采用的29mer長度的shRNA設(shè)計(jì)。目前，商品化的RNAi質(zhì)粒價(jià)格很高，因此自行構(gòu)建質(zhì)粒是一個(gè)非常經(jīng)濟(jì)的選擇,同時(shí)掌握此技術(shù)也會(huì)使于科研工作者更加主動(dòng)掌握工作進(jìn)展。本研究中的序列范圍位于第二、第四和第七外顯子，這可以方便地應(yīng)用于可能遇到的變位剪接相關(guān)研究。四個(gè)質(zhì)粒的抑制率都很高，說明序列是合適的，同時(shí)也表明在A549細(xì)胞系HDACI不存在過多的變位剪接方式。本研究構(gòu)建的HDACIshRNA質(zhì)粒，經(jīng)酶切和PCR鑒定顯示質(zhì)粒構(gòu)建正確(圖2),進(jìn)一步的測序確認(rèn)了序列信息(圖3)。由于，認(rèn)為地加入發(fā)夾結(jié)構(gòu)，因此，酶切后質(zhì)粒的電泳形態(tài)和普通質(zhì)粒有些差別(圖2);同時(shí)發(fā)夾結(jié)構(gòu)造成測序困難，需要特殊酶處理，并和設(shè)計(jì)序列有一定的差別(圖3C),這屬于測序誤差；抑制效率也證明了序列的可用性。鑒于組蛋白修飾在表觀遺傳調(diào)控中的重要作用[1]，我們希望構(gòu)建其他更多的相關(guān)質(zhì)粒做進(jìn)一步的研究。參考文獻(xiàn)張業(yè)和沈珝琲.真核基因表達(dá)調(diào)控新興領(lǐng)域:表觀遺傳調(diào)控研究現(xiàn)狀與展望《2008科學(xué)發(fā)展報(bào)告》(2008) 55-57.Z.Wang,J.Song,T.A.Milne,G.G.Wang,H.Li,C.D.Allis,D.J.Patel,ProisomerizationinMLL1PHD3-bromocassetteconnectsH3K4mereadouttoCyP33andHDAC-mediatedrepression,Cell(2010)1411183-1194.C.Napoli,C.Lemieux,R.Jorgensen,IntroductionofaChimericChalconeSynthaseGeneintoPetuniaResultsinReversibleCo-SuppressionofHomologousGenesintrans,PlantCell2(1990)279-289.A.Fire,S.Xu,M.K.Montgomery,S.A.Kostas,S.E.Driver,C.C.Mello,Potentandspecificgeneticinterference