細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)

第四章細(xì)胞培養(yǎng)的基本(jīběn)技術(shù)

解放軍總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)(jīchǔyīxué)研究所免疫學(xué)研究室黃建華第一頁，共六十四頁。精選ppt

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(jìshù)平臺(tái)基因治療基因診斷試管嬰兒組織工程藥物篩選(shāixuǎn)致病機(jī)理第二頁，共六十四頁。精選ppt主要(zhǔyào)內(nèi)容

基本操作技術(shù)和要求原代培養(yǎng)(péiyǎng)傳代培養(yǎng)和細(xì)胞系的維持細(xì)胞凍存與復(fù)蘇細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測和排除第三頁，共六十四頁。精選ppt細(xì)胞是生命活動(dòng)(huódòng)的基本單位1665年英國學(xué)者RobertHooke，用自制的顯微鏡觀察軟木的薄片，第一次發(fā)現(xiàn)植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并首次(shǒucì)借用拉丁文Cella（小室）詞.1983-39德國植物學(xué)家施萊登和動(dòng)物學(xué)家施旺確立了“細(xì)胞學(xué)說”的基本原則。（１）細(xì)胞是有機(jī)體，動(dòng)植物都是由細(xì)胞發(fā)育來的；（２）每個(gè)細(xì)胞都作為一個(gè)相對(duì)的獨(dú)立單位，有自己的“生命”。（３）新的細(xì)胞可以通過老的細(xì)胞繁殖產(chǎn)生。進(jìn)化論，遺傳學(xué)和細(xì)胞學(xué)說定為現(xiàn)代生物學(xué)的三大基石，而細(xì)胞學(xué)說又是后二者的"基石"。第四頁，共六十四頁。精選ppt組織(zǔzhī)（細(xì)胞）培養(yǎng)

從生物體內(nèi)取出細(xì)胞(xìbāo)（組織），模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存、生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。

細(xì)胞（組織），包括器官培養(yǎng)終歸是離體培養(yǎng)，缺少生物整體的嚴(yán)密聯(lián)系，不能代表整個(gè)機(jī)體。在進(jìn)行醫(yī)學(xué)生物實(shí)驗(yàn)過程及對(duì)結(jié)果的評(píng)估是都必須考慮這些。第五頁，共六十四頁。精選ppt1基本操作技術(shù)(jìshù)和要求由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞沒有抗感染能力，因此防污染是決定培養(yǎng)成功的首要條件。一切操作需要(xūyào)保證無菌和有條不紊。第六頁，共六十四頁。精選ppt1.1培養(yǎng)(péiyǎng)室內(nèi)的無菌技術(shù)培養(yǎng)前的準(zhǔn)備：按實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和程序準(zhǔn)備物品，作到心中有數(shù)培養(yǎng)室和超凈臺(tái)：定期全面徹底消毒培養(yǎng)用品的無菌處理：高壓滅菌、過濾、酒精消毒實(shí)驗(yàn)中無菌培養(yǎng)操作：均在火焰(huǒyàn)近處進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)用品需火焰(huǒyàn)滅菌，冷卻后接觸培養(yǎng)細(xì)胞，以防燒死細(xì)胞。第七頁，共六十四頁。精選ppt1.2培養(yǎng)細(xì)胞(xìbāo)的取材基本要求：取材組織用培養(yǎng)液浸泡，4度運(yùn)送，24h內(nèi)盡快培養(yǎng)。取材無菌操作，避免對(duì)組織的機(jī)械損傷，盡量去除脂肪、神經(jīng)(shénjīng)、結(jié)締、壞死組織，污染組織可用青鏈霉素和制霉菌素漂洗。原代取材同時(shí)保留組織學(xué)和電鏡標(biāo)本，對(duì)供體來源、部位及一般情況做記錄。第八頁，共六十四頁。精選ppt1.2.3皮膚和粘膜(zhānmó)的取材皮膚和粘膜是上皮細(xì)胞培養(yǎng)的重要來源(láiyuán)。取材方法似斷層皮片手術(shù)，面積2-3mm2.盡可能去除皮下和粘膜下組織。因分布在體表，故細(xì)菌、霉菌很多，需嚴(yán)格消毒，可用較高濃度抗菌素漂洗。第九頁，共六十四頁。精選ppt1.2.4內(nèi)臟和實(shí)體(shítǐ)瘤的取材內(nèi)臟除消化道和泌尿管道外基本(jīběn)是無菌的，明確取材部位，去除結(jié)締組織。腫瘤組織取材避免壞死液化和結(jié)締組織，標(biāo)本應(yīng)按污染組織處理。第十頁，共六十四頁。精選ppt1.2.5血細(xì)胞的取材(qǔcái)血細(xì)胞培養(yǎng)可用于造血干細(xì)胞移植(yízhí)、免疫活性細(xì)胞的治療和染色體分析等。取血抗凝劑量過大易導(dǎo)致溶血，肝素常用濃度為20U/ml,針管用較高濃度肝素500U/ml濕潤。第十一頁，共六十四頁。精選ppt1.3組織(zǔzhī)材料的分離欲從組織中獲得大量(dàliàng)生長良好的細(xì)胞，須將組織分散開，使細(xì)胞解離出來。常用方法有機(jī)械法和化學(xué)法。第十二頁，共六十四頁。精選ppt1.3.1細(xì)胞懸液的分離(fēnlí)方法離心法：血液和體液等細(xì)胞懸液500-1000rpm轉(zhuǎn)速5-10分鐘。離心速度過大、時(shí)間過長，會(huì)造成細(xì)胞損傷和死亡。密度梯度離心法：用離心法將細(xì)胞分到不同密度的梯度介質(zhì)(jièzhì)中，再分別吸出各層細(xì)胞。適于分離密度不等的的細(xì)胞。常用介質(zhì)(jièzhì)有Ficoll400,Percoll,

泛影葡胺等。。第十三頁，共六十四頁。精選ppt機(jī)械(jīxiè)分散法

適于較柔軟(róuruǎn)的組織，如腦、肝、脾、淋巴結(jié)、胸腺、胚胎組織和腫瘤組織等。剪切組織為1mm3碎塊

后，置于組織勻漿研磨，或用吸管反復(fù)吹打分散組織細(xì)胞

組織液放在注射器內(nèi)通過針頭壓出。注射器針芯擠壓后，用PBS液洗滌，分別通過不銹鋼篩網(wǎng)80,150,400目孔徑篩網(wǎng)。記數(shù)活細(xì)胞數(shù)，制成細(xì)胞懸液接種。第十四頁，共六十四頁。精選ppt

消化(xiāohuà)分離法消化法是結(jié)合生化和化學(xué)手段把已剪切成較小體積的組織進(jìn)一步分化，獲得細(xì)胞懸液直接(zhíjiē)進(jìn)行培養(yǎng)第十五頁，共六十四頁。精選ppt.1胰蛋白酶(yídànbáiméi)法主要作用是對(duì)細(xì)胞間蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞離散?；钚砸韵业鞍椎哪芰?nénglì)測定，常用1：250消化效果與pH值、溫度、酶濃度和組織塊大小與硬度有關(guān)，對(duì)細(xì)胞分離作用與細(xì)胞的類型與性質(zhì)關(guān)系密切鈣鎂離子和血清抑制活性常用劑量為0.25%（0.1-0.5%），pH值8（8-9）溫度37。4度配制應(yīng)用液。第十六頁，共六十四頁。精選ppt.2膠原酶法只對(duì)細(xì)胞間質(zhì)膠原組織起消化作用，使上皮細(xì)胞與膠原成份分離產(chǎn)品有I-VVII-IX等型，分別適用于分離肝細(xì)胞、胰島、脂肪細(xì)胞腎及纖維組織鈣鎂離子和血清不影響活性,pH.6.5-7常用(chánɡyònɡ)劑量為200單位/ml或0.1μg/ml~0.3μg/ml第十七頁，共六十四頁。精選ppt.3EDTA法EDTA（二乙烯四乙酸二鈉）作用較緩和(huǎnhé)。主要作用：能從組織生長環(huán)境中吸取維持組織完整的鈣鎂離子。單獨(dú)使用不能使細(xì)胞完全分散，常用1:1的EDTA（0.02%）和胰蛋白酶0.25%混合液第十八頁，共六十四頁。精選ppt2原代培養(yǎng)(péiyǎng)也稱初代培養(yǎng),是從供體取得組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)。細(xì)胞保持原有的基本性質(zhì)，仍具二倍體遺傳物性。最接近和反映體內(nèi)生長特性。適合作藥物測試，細(xì)胞分化研究。原代培養(yǎng)細(xì)胞部分(bùfen)生物學(xué)特征尚不穩(wěn)定，供體和細(xì)胞間有很大差異。第十九頁，共六十四頁。精選ppt2.1組織(zǔzhī)塊培養(yǎng)法將組織剪成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶，24小時(shí)貼壁后，細(xì)胞就從組織周圍長出。培養(yǎng)瓶底預(yù)先涂以膠原薄層，以利上皮細(xì)胞的生長(shēngzhǎng)。如需做組織染色或電鏡檢查，可將組織可放入小蓋玻片上后再放進(jìn)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。換液需輕巧，以免組織塊漂起，細(xì)胞死亡第二十頁，共六十四頁。精選ppt2.2消化(xiāohuà)培養(yǎng)法采用前述的組織消化分散法。將妨礙細(xì)胞生長的細(xì)胞間質(zhì)去除，使細(xì)胞分散，形成懸液，按不同(bùtónɡ)濃度接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。第二十一頁，共六十四頁。精選ppt3傳代培養(yǎng)和細(xì)胞系的維持(wéichí)培養(yǎng)細(xì)胞增殖(zēngzhí)長滿瓶壁時(shí)，既達(dá)到所謂的飽和密度。此時(shí)正常細(xì)胞則不再生長；惡性細(xì)胞重疊生長，易于從瓶壁上成片脫落,，為此傳代勢在必行。第二十二頁，共六十四頁。精選ppt培養(yǎng)(péiyǎng)細(xì)胞的生長過程1）原代（初代）培養(yǎng)期：從機(jī)體取下組織培養(yǎng)到第一次傳代，此代細(xì)胞保持異質(zhì)性，細(xì)胞種類(zhǒnglèi)較多，接近原組織細(xì)胞種類(zhǒnglèi)。維持時(shí)間，因細(xì)胞種類(zhǒnglèi)不同，一般1-4周。2）傳代期培養(yǎng)：初代培養(yǎng)的細(xì)胞生長到一定程度，即可連接傳代，使其連續(xù)生長。一般正常二倍體細(xì)胞，不加附加條件，可傳代30-50代，此時(shí)可發(fā)生染色體丟失、突變、細(xì)胞增殖變慢、停止分裂，進(jìn)入衰退期，我們稱之有限細(xì)胞系。這一轉(zhuǎn)折點(diǎn)有人稱之危象臨界點(diǎn)（crisis）有些細(xì)胞的少數(shù)后代，或通過人工條件轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可通過這一期，獲得持久的增殖傳代能力，我們稱細(xì)胞系，或無限細(xì)胞系，即一般通稱的細(xì)胞系。第二十三頁，共六十四頁。精選ppt（3）衰退期：傳代細(xì)胞到達(dá)一定代數(shù)，即發(fā)生增殖緩慢，逐漸停止，進(jìn)而發(fā)生衰退、死亡，多數(shù)傳代細(xì)胞（或叫有限細(xì)胞系），不能通過所謂的“crisis（危象臨界點(diǎn)），導(dǎo)致最終死亡，這一現(xiàn)象可能說明生物學(xué)衰老的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。人胚胎(pēitāi)成纖維細(xì)胞可以進(jìn)行60代增殖，而80歲老人的肺成纖維細(xì)胞僅傳代了16代后便死亡。表皮細(xì)胞壽命4-10天；紅細(xì)胞3周-3個(gè)月，白細(xì)胞5-7天，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)年或更多。第二十四頁，共六十四頁。精選ppt密度(mìdù)抑制（Densityinhibition）或接觸抑制（Ccontactinhibition）1958年Abercrombie等學(xué)者提出的一種現(xiàn)象，培養(yǎng)細(xì)胞再生長過程中多發(fā)生分裂(fēnliè)增殖，細(xì)胞移動(dòng)而相互靠近，這時(shí)某些細(xì)胞可移向其他方向，保證細(xì)胞不會(huì)重疊，一但接觸，這種活動(dòng)即可停止。所謂接觸抑制實(shí)際使細(xì)胞匯合形成單層時(shí)，細(xì)胞變得擁擠，與培養(yǎng)液接觸的表面區(qū)域也相應(yīng)減少，營養(yǎng)成分消耗，其分裂也將停止。第二十五頁，共六十四頁。精選ppt細(xì)胞生長(shēngzhǎng)曲線細(xì)胞數(shù)量生長(shēngzhǎng)天數(shù)緩慢(huǎnmàn)生長期對(duì)數(shù)生長期平衡期第二十六頁，共六十四頁。精選ppt

（1）遲緩期（或延遲期）當(dāng)細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶后，細(xì)胞逐漸貼附于瓶底，并恢復(fù)貼壁形狀，代謝開始旺盛，出現(xiàn)細(xì)胞分裂及增殖，但生長緩慢(huǎnmàn)。

（2）對(duì)數(shù)生長期：此期幾乎所有的細(xì)胞都在進(jìn)行分裂，細(xì)胞數(shù)目迅速增長。期細(xì)胞倍增時(shí)間（TD）等于細(xì)胞周期時(shí)間（TC）長度。這一期常用細(xì)胞倍增時(shí)間及細(xì)胞分裂指數(shù)來判定。（3）平衡期（平坦期）這期細(xì)胞數(shù)目雖然在增加，但其增加速度在減慢，直至細(xì)胞數(shù)量不再增加，處于平衡狀態(tài)。

第二十七頁，共六十四頁。精選ppt3.1原代細(xì)胞培養(yǎng)的傳代(chuándài)細(xì)胞由培養(yǎng)(péiyǎng)瓶內(nèi)分離再培養(yǎng)(péiyǎng)稱之為傳代,進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)(péiyǎng)稱之為傳一代。原代培養(yǎng)的首次傳代是建系的關(guān)鍵時(shí)期，細(xì)胞需覆蓋大部分瓶底后再傳代。首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細(xì)胞生存和增殖。第二十八頁，共六十四頁。精選ppt3.2細(xì)胞傳代(chuándài)方法貼壁生長的細(xì)胞用消化法傳代；部分貼壁生長的細(xì)胞用直接吹打(chuīdǎ)即可傳代；懸浮生長的細(xì)胞采用離心分離后傳代，第二十九頁，共六十四頁。精選ppt3.2.1貼壁細(xì)胞傳代(chuándài)步驟吸除瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液；加入1ml消化液；37C或室溫25C消化2~5分鐘顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后；直接(zhíjiē)加少許含血清的培養(yǎng)液，終止消化；細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，分別接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。第三十頁，共六十四頁。精選ppt3.2.2懸浮細(xì)胞(xìbāo)的傳代直接傳代即讓懸浮細(xì)胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清洗掉1/2~1/3，然后用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后，再傳代。離心法：離心800~1000rpm，5min，除上清，加新的培養(yǎng)液，然后傳代接種。部分(bùfen)貼壁生長細(xì)胞直接吹打傳代或需消化后傳代第三十一頁，共六十四頁。精選ppt3.3細(xì)胞系的維持(wéichí)是通過換液、傳代和細(xì)胞凍存實(shí)現(xiàn)的：建立檔案：記錄組織來源，生物學(xué)特性，培養(yǎng)液要求、傳代、換液時(shí)間和規(guī)律，細(xì)胞的遺傳學(xué)標(biāo)志，生長形態(tài)，常規(guī)病理染色(rǎnsè)的標(biāo)本等。第三十二頁，共六十四頁。精選ppt3.3細(xì)胞系的維持(wéichí)防細(xì)胞之間的交叉污染，傳代時(shí)所用器械要編號(hào)或做好標(biāo)記每一種細(xì)胞系都應(yīng)有充足的凍存儲(chǔ)備，以防絕種；另外二倍體細(xì)胞等有限細(xì)胞系如果暫時(shí)不用最好凍存以免(yǐmiǎn)傳代太多，造成細(xì)胞衰老或發(fā)生改變第三十三頁，共六十四頁。精選ppt4.3.4培養(yǎng)(péiyǎng)細(xì)胞的純化自然(zìrán)純化自然純化即利用某一種類細(xì)胞的增殖優(yōu)勢，而排除其它細(xì)胞生長，靠自然的增殖潛力最后留下生長優(yōu)勢細(xì)胞，去除其它細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。第三十四頁，共六十四頁。精選ppt人工(réngōng)純化利用人為手段造成對(duì)某一細(xì)胞生長有利的環(huán)境條件，抑制其它細(xì)胞的生長，從而達(dá)到純化(chúnhuà)細(xì)胞的目的。第三十五頁，共六十四頁。精選ppt酶消化(xiāohuà)法酶消化法：由于上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同,，成纖維細(xì)胞先脫壁，而上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長的時(shí)間才脫壁，利用這種差異采用多次差別(chābié)消化方法將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開。第三十六頁，共六十四頁。精選ppt3.4.2.2機(jī)械(jīxiè)劃除法機(jī)械劃除法：上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞多數(shù)都同時(shí)出現(xiàn)，混雜生長常常分區(qū)呈片，采用機(jī)械的方法去除不需要的細(xì)胞區(qū)域(qūyù)，而保留需要的細(xì)胞。第三十七頁，共六十四頁。精選ppt3.4.2.3反復(fù)(fǎnfù)貼壁法成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞相比，其貼壁過程快，大部分細(xì)胞常能在短時(shí)間內(nèi)大約10~30min完成附著過程（但不一定(yīdìng)完全伸展）；而上皮細(xì)胞大部分細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，這樣可以利用此差別來純化細(xì)胞第三十八頁，共六十四頁。精選ppt3.4.2.4克隆(kèlónɡ)法將細(xì)胞分成單個(gè)細(xì)胞，使之分別生長成克隆，然后(ránhòu)對(duì)每一克隆進(jìn)行測試，選擇出所需要的克隆。第三十九頁，共六十四頁。精選ppt3.4.2.5培養(yǎng)基限定(xiàndìng)方法某些細(xì)胞在生長過程中必須存在或必須去除某種物質(zhì)，否則將無法生長。而其它細(xì)胞與之相反，可以利用這種技術(shù)來純化細(xì)胞。如雜交瘤技術(shù)常用的HAT培養(yǎng)液，就用來篩選(shāixuǎn)雜交瘤細(xì)胞而抑制其它細(xì)胞。第四十頁，共六十四頁。精選ppt4.1細(xì)胞(xìbāo)的凍存凍存細(xì)胞要緩慢冷凍。減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成是減少細(xì)胞損傷的關(guān)鍵(guānjiàn)。冷凍保護(hù)劑的使用，可使細(xì)胞免受冰晶形成和滲透壓改變而致的損傷。常用二甲基亞砜和甘油。凍存細(xì)胞最好每三個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測細(xì)胞原特性是否改變。第四十一頁，共六十四頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)凍存步驟

取生長對(duì)數(shù)期的細(xì)胞消化成細(xì)胞懸離心(líxīn)細(xì)胞記數(shù)2.5x106/ml凍存液加含10%DMSO凍存液熔封置4度數(shù)小時(shí)，負(fù)20度過夜或-70°C放置2-3h移入液氮罐中記錄第四十二頁，共六十四頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)復(fù)蘇步驟取出安瓶立即放入37°C水中消毒安瓶開封后將細(xì)胞移入離心(líxīn)管中加培養(yǎng)液離心(líxīn)記數(shù)接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng)第四十三頁，共六十四頁。精選ppt4.3培養(yǎng)(péiyǎng)細(xì)胞的運(yùn)輸冷凍儲(chǔ)存運(yùn)輸，即利用特殊容器內(nèi)盛液氮或干冰凍存充液法：（1）選擇生長(shēngzhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞。一般以生長(shēngzhǎng)1/3~1/2瓶底壁為宜，換新液，保留微量空氣，擰緊瓶蓋（2）用棉花等做防震防壓處理第四十四頁，共六十四頁。精選ppt5細(xì)胞培養(yǎng)污染(wūrǎn)的檢測和排除培養(yǎng)細(xì)胞的污染(wūrǎn)概念包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生存生存有害的成份和造成細(xì)胞不純的異物（真菌、細(xì)菌、病毒和支原體）、化學(xué)物質(zhì)及細(xì)胞第四十五頁，共六十四頁。精選ppt微生物污染(wūrǎn)的途徑空氣：一般培養(yǎng)室環(huán)境(huánjìng)中每立方米含菌數(shù)不應(yīng)超過1~5個(gè)器材：CO2溫箱操作血清組織樣本第四十六頁，共六十四頁。精選ppt微生物污染(wūrǎn)的檢測真菌污染細(xì)菌污染支原體污染：可做如下(rúxià)檢測（1）相差顯微鏡檢測（2）熒光染色法（3）電鏡檢查（4）DNA分子雜交或支原體培養(yǎng)等方法第四十七頁，共六十四頁。精選ppt微生物污染(wūrǎn)的防治防止的關(guān)鍵在于嚴(yán)格無菌操作，把好每一個(gè)關(guān)口，盡可能禁止其它污染的物品(wùpǐn)進(jìn)入培養(yǎng)操作環(huán)節(jié)：第四十八頁，共六十四頁。精選ppt微生物污染(wūrǎn)的防治抗生素：一般用常用量的5~10倍作沖擊療法。用藥24~48h后，再換常規(guī)培養(yǎng)液。加溫處理：根據(jù)支原體對(duì)熱敏感的特點(diǎn)，將受支原體污染的細(xì)胞放置在41°C作用5~10h，最長不超過18h，以殺滅支原體。動(dòng)物體內(nèi)接種：將支原體污染的細(xì)胞接種在同種動(dòng)物的皮下或腹腔(fùqiāng)，借動(dòng)物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)消滅支原體。待一定時(shí)間后取出細(xì)胞，做原代培養(yǎng)再進(jìn)行繁殖。第四十九頁，共六十四頁。精選ppt細(xì)胞交叉(jiāochā)污染有效防止細(xì)胞交叉污染：所有(suǒyǒu)器具要嚴(yán)格區(qū)分不要觸及培養(yǎng)液瓶瓶口細(xì)胞系都要在早期留有充足的凍存儲(chǔ)備，可以復(fù)蘇早期凍存細(xì)胞使用。第五十頁，共六十四頁。精選ppt流式細(xì)胞儀分離法流式細(xì)胞儀可根據(jù)細(xì)胞核酸含量、某些物質(zhì)含量或細(xì)胞結(jié)構(gòu)大小等參數(shù)(cānshù)來將細(xì)胞分離成不同的群體。第五十一頁，共六十四頁。精選ppt培養(yǎng)(péiyǎng)細(xì)胞生長狀態(tài)的觀察貼附生長型為能附著(fùzhuó)于底物表面生長的細(xì)胞，懸浮生長型懸浮狀態(tài)即可生長，如血、骨髓脾細(xì)胞。第五十二頁，共六十四頁。精選ppt培養(yǎng)(péiyǎng)細(xì)胞的生長特性貼附：附著于底物如其它細(xì)胞(xìbāo)、膠元、玻璃或塑料，促細(xì)胞(xìbāo)附著物質(zhì)如基膜素、纖維連接素、膠元、血清擴(kuò)展因子可能參加細(xì)胞(xìbāo)的粘附過程。接觸抑制：當(dāng)兩個(gè)細(xì)胞相互接觸時(shí)，細(xì)胞不再移動(dòng)，細(xì)胞膜皺褶樣活動(dòng)停止。密度依賴性：細(xì)胞稀少時(shí)生長迅速，融合成片后，分裂停止。第五十三頁，共六十四頁。精選ppt常規(guī)(chángguī)觀察需每天觀察細(xì)胞生長過程(guòchéng)中出現(xiàn)的變化：1.培養(yǎng)液的顏色與透明度2.細(xì)胞形態(tài)變化3.細(xì)胞生長狀態(tài)4.微生物污染第五十四頁，共六十四頁。精選ppt細(xì)胞形態(tài)(xíngtài)變化的觀察相差顯微鏡：利用光通過不同物質(zhì)時(shí)的折射和物體厚度差別，產(chǎn)生衍射而引起光程改變(gǎibiàn)，產(chǎn)生相位差的特性，用于觀察培養(yǎng)細(xì)胞的附著、貼壁、伸展、移動(dòng)、有絲分裂等形態(tài)活動(dòng)。

狀態(tài)好的細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓清楚，分裂期細(xì)胞多見。

狀態(tài)差的細(xì)胞，失去原來的特點(diǎn)，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡、顆粒，細(xì)胞變形，出現(xiàn)死亡。第五十五頁，共六十四頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)計(jì)數(shù)它是了解細(xì)胞生長(shēngzhǎng)狀態(tài)的量化指標(biāo)。制備細(xì)胞懸液，密度不低于10000細(xì)胞/ml，用10x物鏡觀察計(jì)數(shù)板四角大方格的細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)：細(xì)胞數(shù)/ml原液＝（4大格細(xì)胞數(shù)之合/4）X10000注意：細(xì)胞分散均勻制成單個(gè)細(xì)胞懸液。第五十六頁，共六十四頁。精選ppt活細(xì)胞(xìbāo)的染料排除檢測法細(xì)胞(xìbāo)損傷或死亡時(shí)，細(xì)胞(xìbāo)膜通透性發(fā)生變化，某些染料可穿透變性的細(xì)胞(xìbāo)膜，與解體的DNA結(jié)合，使其著色，而活細(xì)胞能排出進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的染料，或阻止這類染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因而不易著色。借此可以鑒別死活細(xì)胞。第五十七頁，共六十四頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)活力測定的MTT比色法原理：活細(xì)胞的線粒體脫氫酶能將染料MTT（二甲基噻唑二笨基四唑溴鹽）轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙滋骖w粒，后者被酸性異丙醇溶解后所呈現(xiàn)的色度(sèdù)（用OD值表示）反映出生活細(xì)胞的代謝水平。死亡細(xì)胞則無此酶活性。第五十八頁，共六十四頁。精選ppt細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的商業(yè)化：對(duì)于生物技術(shù)所使用的各種細(xì)胞株的價(jià)值，很難作出評(píng)價(jià)。1998年，美國市場就達(dá)3.5-4億美元，而且還以6-8%的速度(sùdù)在增長。下邊介紹幾家美國細(xì)胞株供應(yīng)公司和機(jī)構(gòu)。第五十九頁，共六十四頁。精選ppt美國(měiɡuó)細(xì)胞株供應(yīng)公司和機(jī)構(gòu)名稱網(wǎng)址

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