細(xì)菌簡單染色和革蘭氏染色

關(guān)于細(xì)菌簡單染色和革蘭氏染色第1頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三一、實驗?zāi)康?/p>

1.學(xué)習(xí)微生物涂片，染色原理和染色的基本操作技術(shù)，從而掌握微生物的一般染色法和革蘭氏染色法。

2.鞏固顯微鏡（油鏡）的使用方法和無菌操作技術(shù)。第2頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三二、染色原理由于微生物細(xì)胞含有大量水分，對光線的吸收和反射與水溶液的差別不大,機(jī)體是無色透明的，與周圍背景沒有明顯的反差,在普通光學(xué)顯微鏡下不易識別，必須對它們進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。微生物細(xì)胞是由蛋白質(zhì)、核酸等兩性電解質(zhì)及其他化合物組成。所以，微生物細(xì)胞表現(xiàn)出兩性電解質(zhì)的性質(zhì)。兩性電解質(zhì)兼有堿性基和酸性基，在酸性溶液中離解出堿性基呈堿性帶正電。在堿性溶液中離解出酸性基呈酸性帶負(fù)電。經(jīng)測定，細(xì)菌等電點pH在2-5之間，故在中性、堿性或偏酸性溶液中，細(xì)菌的等電點均低于上述溶液的pH值，所以細(xì)菌帶負(fù)電荷，容易與帶正電荷的堿性染料結(jié)合，故用堿性染料染色的較多。微生物體內(nèi)各結(jié)構(gòu)與染料結(jié)合力不同，故可用各種染料分別染微生物的各結(jié)構(gòu)以便觀察。第3頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三三、染色方法(一)簡單染色法簡單染色法又叫作普通染色法，只用一種染料使細(xì)菌染上顏色，如果僅為了在顯微鏡下看清細(xì)菌的形態(tài)，用簡單染色即可。第4頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三(二)復(fù)染色法用兩種或多種染料染細(xì)菌，目的是為了鑒別不同性質(zhì)的細(xì)菌，所以又叫鑒別染色法。主要的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法。革蘭氏染色法：不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)，而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G-表示。細(xì)菌對革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。第5頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三四、實驗材料1.顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、接種環(huán)、載玻片、酒精燈等。2.石炭酸復(fù)紅染液、草酸銨結(jié)晶紫染液、碘液、95％乙醇、番紅（沙黃）染液3.菌種：表皮球菌、變形桿菌第6頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三五、實驗內(nèi)容與步驟(一)細(xì)菌的簡單染色步驟涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢1．涂片取干凈的載玻片于實驗臺上，在載玻片的中央滴一滴無菌蒸餾水，將接種環(huán)在火焰上燒紅，待冷卻后從斜面挑取少量菌種(表皮球菌或變形桿菌)與玻片上的水滴混勻后，在載玻片上涂布成一均勻的薄層，涂布面不宜過大。2．干燥涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時為了使之干得更快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。

第7頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三3．固定固定常常利用高溫，手持載玻片的一端，標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過2~3次，共約2~3秒鐘，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃）,放置待冷后，進(jìn)行染色。4．染色在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸復(fù)紅、草酸銨結(jié)晶紫或美藍(lán)任選一種)一滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min。5．水洗斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無色為止。6．干燥用吸水紙吸去涂片邊緣的水珠，置于室溫下自然干燥。用吸水紙時切勿將菌體擦掉。

第8頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三7．鏡檢用顯微鏡觀察，并用鉛筆繪出細(xì)菌形態(tài)圖。(二)細(xì)菌的革蘭氏染色步驟

涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脫色→水洗→復(fù)染→水洗→干燥→觀察1．取表皮球菌和變形桿菌(均以無菌操作)分別在同一張載玻片上做涂片、干燥、固定，方法均與簡單染色的相同。2．用草酸銨結(jié)晶紫染色1min后水洗。3．加碘液媒染1min后水洗。4．斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止，大約需時20~30s，隨即水洗。第9頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三5．用沙黃染液復(fù)染1min，水洗。6．用吸水紙吸掉水滴，待標(biāo)本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后用油鏡觀察，注意細(xì)菌細(xì)胞的顏色。繪出細(xì)菌的形態(tài)圖并說明革蘭氏染色的結(jié)果。第10頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三六、注意事項1．革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時間，如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為革蘭氏陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被誤認(rèn)為是革蘭氏陽性菌。因此必須嚴(yán)格把握脫色時間。

2．選用培養(yǎng)18-24小時菌齡的細(xì)菌為宜，若細(xì)菌太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。第11頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三思考題1．作革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃厚？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？2．通過革蘭氏染色，你認(rèn)為它在微生物學(xué)中有何實踐意義？七、實驗結(jié)果簡單染色：表皮球菌和變形桿菌染成（）色。革蘭氏染色（變形桿菌與表皮球菌）；將結(jié)果填于下表中第12頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三第13頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三第14頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三第15頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三第16頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三第17頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三實驗細(xì)菌的芽孢染色法和鞭毛染色法第18頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握芽孢染色方法。初步了解芽孢桿菌的形態(tài)特征。學(xué)習(xí)并初步掌握鞭毛染色法，觀察細(xì)菌鞭毛的形態(tài)特征。第19頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三二、實驗原理1.芽孢染色法原理

芽孢染色法是利用細(xì)菌的芽孢和菌體對染料的親合力不同的原理，用不同染料進(jìn)行著色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難，因此，當(dāng)先用一弱堿性染料，如孔雀綠（malachitegreen）或堿性品紅（basicfuchsin）在加熱條件下進(jìn)行染色時，此染料不僅可以進(jìn)入菌體，而且也可以進(jìn)入芽孢，進(jìn)入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出，若再用復(fù)染液（如番紅液）或襯托溶液（如黑色素溶液）處理，則菌體和芽孢易于區(qū)分。第20頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三2.鞭毛染色法的原理

鞭毛是細(xì)菌的運動“器官”，一般細(xì)菌的鞭毛都非常纖細(xì)，其直徑為0.01-0.02μm，在普通光學(xué)顯微鏡的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。鞭毛染色是借媒染劑和染色劑的沉淀作用，使染料堆積在鞭毛上，以加粗鞭毛的直徑，同時使鞭毛著色，在普通光學(xué)顯微鏡下能夠看到。鞭毛染色方法很多，本實驗主要介紹硝酸銀染色法。（見實驗課本35頁）第21頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三三、實驗器材1.儀器：顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、接種環(huán)、載玻片、酒精燈等。2.染色液：芽孢染色液：孔雀綠水溶液，沙黃水溶液鞭毛染色液：硝酸銀鞭毛染色液A液，B液3.菌種：枯草芽孢桿菌、變形桿菌第22頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三四、實驗內(nèi)容與步驟1、細(xì)菌芽孢染色（1）將培養(yǎng)24小時左右的枯草芽孢桿菌或其他芽孢桿菌，作涂片、干燥、固定。（2）滴加3-5滴孔雀綠染液于已固定的涂片上。（3）用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰，切忌使染液蒸干，必要時可添加少許染液。加熱時間從染液冒蒸汽時開始計算約4-5分鐘。這一步也可不加熱，改用飽和的孔雀綠水溶液（約7.6％）染10分鐘。第23頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三（4）傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止。（5）用沙黃水溶液復(fù)染2-3分鐘，水洗。（6）待干燥后，置油鏡觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色。第24頁，講稿共26頁，2023年5月2日，星期三2、鞭毛染色（1）菌種的準(zhǔn)備

要求用活躍生長期菌種作為鞭毛染色的觀察。（2）載玻片的準(zhǔn)備

將載玻片在含適量洗義粉的水中煮沸約20min,取出用清水充分洗凈，瀝干水后備用