整合子系統(tǒng)與細(xì)菌多重耐藥研究進(jìn)展

整合子系統(tǒng)與細(xì)菌多重耐藥研究進(jìn)展【摘要】細(xì)菌的多重耐藥已成為臨床治療的難題，整合子是攜帶編碼抗生素耐藥基因盒的DNA片斷，在細(xì)菌獲得和傳播耐藥基因方面起著重要作用。本文就整合子及其基因盒的分類、分布、結(jié)構(gòu)、來源、整合子對(duì)基因盒的捕獲表達(dá)、整合子與細(xì)菌的多重耐藥性關(guān)系及多重耐藥菌感染的治療等作一闡述。

【關(guān)鍵詞】整合子；基因盒；多重耐藥

ABSTRACTMultidrugresistantbacterialpathogenshavebecometoughprobleminclinicaltheraphy.IntegronsareDNAelementscarryingantibioticresistanceencodinggenecassettes,andplayanimportantroleinbacteriacapturinganddisseminatingantibioticresistancegene.Thisarticlereviewedtheclass,distribution,construction,sourceofintegronandgenecassettes,integroncapturingandexpressinggenecassettesandtherelationshipbetweenintegronandmultidrugresistantofbacteria;thetreatmenttomultidrugresistantofbacteria.

KEYWORDSIntegron;Genecassettes;Multidrugresistance

近年來隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，尤其是不合理的使用，細(xì)菌的耐藥性，甚至是多重耐藥開始大量出現(xiàn)，給臨床感染性疾病的治療帶來極大困難。病原菌耐藥的產(chǎn)生主要是通過自身基因的突變累積，或者在水平方向上獲取外源性耐藥基因，或者兩種機(jī)制并存引起的。1989年，Stokes等首次提出了一個(gè)與耐藥基因水平傳播的可移動(dòng)基因元件——整合子(integron)［1］。整合子是一種基因單位，包括位點(diǎn)特異性重組功能的基因決定簇，在整合酶的作用下能識(shí)別并俘獲或刪除移動(dòng)性基因盒［2］，并在位于整合子上游的啟動(dòng)子的作用下得以表達(dá)，使細(xì)菌具有耐藥及多重耐藥性。整合子可以通過結(jié)合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合型噬菌體在同種和不同種菌屬間傳播，使細(xì)菌的耐藥性得以廣泛擴(kuò)散。整合子是細(xì)菌尤其是革蘭陰性菌多重耐藥快速發(fā)展的主要原因［3］。

1整合子的結(jié)構(gòu)

整合子是保守、可移動(dòng)的轉(zhuǎn)座子樣DNA元件，能捕獲和整合耐藥基因，形成巨大的多基因座。整合子包括兩端的高度保守片斷(conservedsegment，CS)和中間的可變區(qū)(variableregion)。可變區(qū)含有一個(gè)或多個(gè)基因盒。整合子含有三個(gè)功能元件：位于5′端的一個(gè)編碼整合酶(integrase，IntI)的基因(intI)、一個(gè)基因重組位點(diǎn)attI和一個(gè)啟動(dòng)子［4，5］，啟動(dòng)子有P1和P2兩種，大多數(shù)整合子都含有P1啟動(dòng)子，部分還含有P2啟動(dòng)子。3′端的結(jié)構(gòu)因整合子的種類不同而不同。整合子的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

2整合子的分類和分布

整合子是根據(jù)其整合酶的DNA堿基序列不同進(jìn)整合子的結(jié)構(gòu)模式圖行分類的，整合酶屬于酪氨酸整合酶家族，目前發(fā)現(xiàn)的整合酶至少有6類，其中對(duì)I、II和III類整合子的研究較多，且明確與細(xì)菌耐藥性有關(guān)。

I類整合子

I類整合子在臨床耐藥菌中最常見［6］，它與Tn21轉(zhuǎn)座子家族相關(guān)，其整合酶基因編碼含有337個(gè)氨基酸的整合酶。5′端有編碼整合酶的基因intI1和啟動(dòng)子P1，部分還有啟動(dòng)子P2及基因重組位點(diǎn)attI；3′端有3個(gè)開放讀碼框(ORF)，即季銨鹽化合物及溴乙錠的耐藥基因(qacE△1)，磺胺耐藥基因(sul1)和功能不明的ORF5［7，8］。大多數(shù)I類整合子的5′CS相似，3′CS存在差異。至今發(fā)現(xiàn)I類整合子在革蘭陰性菌中廣泛分布，包括腸桿菌科中的大腸埃希菌屬、志賀菌屬、變形菌屬等以及非發(fā)酵菌中的假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬等。

II類整合子

II整合子與Tn7轉(zhuǎn)座子家族相關(guān)，其整合酶基因有缺陷，編碼的整合酶IntI2約有318個(gè)氨基酸，與IntI1有46%的同源性；在3′保守端有5個(gè)tns基因，與Tn7的轉(zhuǎn)移有關(guān)。現(xiàn)已在腸桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬和沙門菌中分離出II類整合子。

III類整合子

III類整合子是Arakawa在耐碳青霉烯類抗生素的黏質(zhì)沙雷菌的質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的，其編碼的整合酶IntI3含有320個(gè)氨基酸，與IntI1有61%的同源性［9］。III類整合子帶有編碼β內(nèi)酰胺酶的基因盒balIMP，目前在假單胞菌、肺炎克雷伯菌、木糖氧化產(chǎn)堿桿菌等革蘭陰性菌中分離出III類整合子［10］。

IV類整合子

在霍亂弧菌基因中發(fā)現(xiàn)的IV類整合子又稱為超級(jí)整合子(superintegron)，其編碼的整合酶含有320個(gè)氨基酸，與IntI1有%的同源性。IV類整合子中含有179個(gè)基因盒，在179個(gè)基因盒中至少有216個(gè)未知功能的開放讀碼框(ORFs)［11］。還沒有發(fā)現(xiàn)它直接與多重耐藥有關(guān)。

3基因盒的結(jié)構(gòu)和種類

基因盒是較小的、可移動(dòng)的DNA分子，常以環(huán)形獨(dú)立狀態(tài)存在，只有被整合子捕獲并整合到整合子中才能轉(zhuǎn)錄。不同基因盒的結(jié)構(gòu)和功能不同，但基本結(jié)構(gòu)為一個(gè)開放讀碼框ORF(通常是耐藥基因)和一個(gè)短的回文序列attC，它是被整合酶識(shí)別的特異性重組位點(diǎn)。最初發(fā)現(xiàn)attC位點(diǎn)有59個(gè)堿基的片斷(59baseelement，59be)，故attC位點(diǎn)又稱59be?；蚝薪Y(jié)構(gòu)如圖2示。基因盒本身沒有啟動(dòng)子，必須插入到整合子中在啟動(dòng)子P的作用下得以表達(dá)，基因盒總是以相同圖2基因盒結(jié)構(gòu)模式圖

方向插入，而且從整合子5′端保守片段中的啟動(dòng)子開始轉(zhuǎn)錄。多個(gè)基因盒可以同時(shí)插入到整合子。迄今已報(bào)道60多個(gè)基因盒，比較常見的基因盒有以下幾類。

aad基因編碼氨基糖苷類的耐藥性

目前至少已發(fā)現(xiàn)15種由aad基因編碼并傳遞對(duì)氨基糖苷類的耐藥性。aad基因又分A和B兩類，目前已發(fā)現(xiàn)aadA有7個(gè)成員——aadA1～aadA7，aadA1編碼對(duì)四環(huán)素的耐藥性，aadA2編碼對(duì)鏈霉素和大觀霉素的耐藥性。aadB基因編碼對(duì)慶大霉素、卡那霉素和妥布霉素的耐藥性。

aac基因編碼氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶

aac基因主要表現(xiàn)對(duì)氨基糖苷抗生素的耐藥，目前主要有aac1、aac2′、aac3和aac6′，其中aac(3)又可分為aac(3)Ia、aac(3)Ib、aac(3)Ic。最近，Ahmed等在一株河流弧菌的I類整合子中發(fā)現(xiàn)了aac3Id［12］。

dfr基因

dfr基因即二氫葉酸還原酶基因，編碼對(duì)甲氧磺胺嘧啶類的耐藥性。以dfrA1多見，大多以基因盒插入I、II類整合子，還能高頻插人到含sul1的I類整合子中表現(xiàn)出更強(qiáng)的對(duì)甲氧磺胺嘧啶的耐藥性。

編碼β內(nèi)酰胺酶和超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的基因

目前這類基因越來越多的被發(fā)現(xiàn)［13，14］，如blaPSE1、blaCMY2、blaVEB1和blaGES2等，形成對(duì)青霉素類和頭孢菌素類的耐藥。特別是近年發(fā)現(xiàn)較多的編碼對(duì)亞胺培南等碳青霉烯類抗生素耐藥的金屬β內(nèi)酰胺酶基因，如blaIMP、blaVIM、blaSPM、blaGIM和blsSIM等。

其它基因盒

cat基因編碼氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(chloramphenicolacetyltransferases)，對(duì)氯霉素耐藥；oxa編碼苯唑西林酶，對(duì)苯唑西林耐藥；aar基因介導(dǎo)利福平耐藥；ere介導(dǎo)紅霉素耐藥；qnr介導(dǎo)喹諾酮耐藥。

4整合子對(duì)基因盒的捕獲和表達(dá)

整合子在整合酶的催化作用下，通過識(shí)別基因盒的attC位點(diǎn)，可以將游離的耐藥基因盒整合到自身的染色體上。在整合的過程中，只有一種方向5′→3′，多個(gè)基因盒按照同樣的方向排列，在整合子的啟動(dòng)子帶動(dòng)下得以表達(dá)。捕獲過程如圖3所示。整合過程可以分為特異性整合和非特異性整合兩種。

圖3耐藥基因盒的整合過程

特異性整合是將耐藥基因盒整合到交換位點(diǎn)attI和attC，耐藥基因盒可以自由的被整合或切除。耐藥基因盒的表達(dá)依賴于整合子5′端保守區(qū)的啟動(dòng)子，通常包含P1和P2兩個(gè)啟動(dòng)子。不同整合子中啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)與啟動(dòng)強(qiáng)度有所不同，其中P1是主要啟動(dòng)子?；蚝械谋磉_(dá)不僅與啟動(dòng)子的強(qiáng)弱有關(guān)，還與距離啟動(dòng)子的遠(yuǎn)近有關(guān)，當(dāng)基因盒直接位于5′保守末端時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，而下游的表達(dá)較弱，且同一基因盒整合在不同位點(diǎn)時(shí)表達(dá)水平不同。原因可能與基因盒59be的結(jié)構(gòu)有關(guān)。59be內(nèi)包含不完全反向重復(fù)序列，容易形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)成為轉(zhuǎn)錄終子信號(hào)或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的內(nèi)切信號(hào)。但下游表達(dá)較弱或不表達(dá)的基因盒，在抗生素的壓力下，有可能借助整合酶介導(dǎo)的基因重組，插入到強(qiáng)啟動(dòng)子或靠近P1的位置，由低水平表達(dá)轉(zhuǎn)為高效表達(dá)，耐藥水平隨之上升。

非特異性整合是將基因盒整合到非交換位點(diǎn)attI和attC，而且整合于非特異性位點(diǎn)的耐藥基因盒，一旦整合上就不能夠被切下，這對(duì)于細(xì)菌耐藥性的傳播和細(xì)菌的進(jìn)化有重要意義。非特異性整合的基因盒的表達(dá)依賴于適當(dāng)方向啟動(dòng)子的存在，在沒有適當(dāng)啟動(dòng)子時(shí)不能被表達(dá)。

5整合子系統(tǒng)與細(xì)菌多重耐藥的關(guān)系

大多基因盒都含有對(duì)抗菌藥物耐藥的基因，整合子通過捕獲一個(gè)或多個(gè)耐藥基因盒，在啟動(dòng)子的作用下表達(dá)對(duì)抗菌藥物的多重耐藥。整合子系統(tǒng)作為一個(gè)可移動(dòng)的基因元件，可位于細(xì)菌染色體上，將細(xì)菌耐藥性傳給子代；也可以借助于可移動(dòng)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子在同種或不同種細(xì)菌之間水平傳播，使細(xì)菌的耐藥性得以擴(kuò)散。

近年各國學(xué)者通過對(duì)不同菌屬及不同來源的I、II、III類整合子的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)I類整合子在大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、沙門菌、銅綠假單胞菌等檢出率很高，如在荷蘭臨床分離的大腸埃希菌和沙門菌的I類整合子檢出率分別為76%和43%，高于II類整合子的檢出率11%和1%，且整合子陽性的菌株表現(xiàn)出明顯的多重耐藥性［15］。澳大利亞學(xué)者通過對(duì)肉牛來源的細(xì)菌進(jìn)行II類整合子的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)6種不同的II類整合子，其可變區(qū)含有不同的耐藥基因，其中一個(gè)含有9個(gè)功能未知的開放讀碼框(OFRs)，但不含耐藥基因［16］。Pairano等［17］檢測(cè)62株志賀菌，并對(duì)21種抗生素耐藥情況設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)都有I、II類整合子和抗生素耐藥基因的存在，II類陽性株都有2214bp的基因異常，并介導(dǎo)對(duì)甲氧芐氨嘧啶、鏈絲霉素、鏈霉素和大觀霉素耐藥，提示同一類整合子可攜帶不同的耐藥基因盒，同一個(gè)耐藥基因可出現(xiàn)在不同的整合子上，整合子可在院內(nèi)細(xì)菌中播散多重耐藥。Quintein等［18］在一株銅綠假單胞菌發(fā)現(xiàn)一個(gè)含有碳青霉烯類抗生素耐藥基因VIM2的I類整合子In100，該耐藥基因排在整合子可變區(qū)耐藥基因盒的第一位，提示可能為新近獲得并高效表達(dá)對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥，表明微生物為適應(yīng)環(huán)境，通過整合子系統(tǒng)捕獲新的耐藥基因盒。Valverde等通［19］過對(duì)一株含有一個(gè)新的I類整合子In117的研究發(fā)現(xiàn)，不但基因盒之間可以發(fā)生融合，整合子也可以發(fā)生CR1的重組，攜帶更多的耐藥基因盒，增強(qiáng)了細(xì)菌的多重耐藥性，再通過質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子水平傳播，使細(xì)菌的多重耐藥性得以廣泛擴(kuò)散。在歐洲和韓國，人和動(dòng)物來源的細(xì)菌的整合子耐藥基因盒的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其含有相同的耐藥基因盒，提示耐藥的基因盒可以通過食物在人和動(dòng)物之間傳播，尤其是沙門菌屬，可能導(dǎo)致細(xì)菌的多重耐藥性隨著食物的流通更加廣泛的擴(kuò)散［20，21］。

石磊等［22］通過對(duì)暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院2004年分離的109株臨床菌株的分析顯示，所有菌株均表現(xiàn)3種以上抗生素耐藥，40%的菌株對(duì)9種以上抗生素耐藥，%存在整合酶基因，其中5株同時(shí)含有I、II類整合子，證實(shí)一株細(xì)菌可以含有多種整合子；對(duì)其可變區(qū)的分析表明，這些整合子普遍含有1個(gè)以上的耐藥基因盒，證明整合子廣泛分布于各種菌株中，并介導(dǎo)細(xì)菌的多重耐藥。研究表明，不同地區(qū)銅綠假單胞菌的整合子攜帶基因盒種類存在顯著差異，提示整合子對(duì)耐藥基因盒的攜帶可能和當(dāng)?shù)蒯t(yī)療環(huán)境及抗菌藥物的使用背景有關(guān)［23］。對(duì)南京地區(qū)98株銅綠假單胞菌整合子可變區(qū)的擴(kuò)增，其中35株可變區(qū)擴(kuò)增陽性，共發(fā)現(xiàn)6種不同結(jié)構(gòu)的可變區(qū)，主要含有編碼氨基糖苷類、β內(nèi)酰胺類耐藥基因，表現(xiàn)出對(duì)慶大霉素、卡那霉素、頭孢菌素及碳青霉烯類抗生素的耐藥，其中有3種為新型基因盒的組合形式：aadA6orfD、aadBblaP1和aadBaac(6′)IIablaCARB8。其中aadA62orfD型基因盒檢出率最高，占所有基因盒的%(15/35)，是在南京地區(qū)PA中流行的一種基因盒組合的形式，介導(dǎo)對(duì)氨基糖苷類抗生素的耐藥［24］。陽大慶等研究72株鮑曼不動(dòng)桿菌顯示，整合子陽性株對(duì)除亞胺培南、頭孢吡肟和頭孢哌酮/舒巴坦以外的其它抗菌藥耐藥率較整合子陰性株存在不同程度的差異［25］。

6多重耐藥菌的治療

鑒于整合子在細(xì)菌多重耐藥性的重要作用，要求臨床在抗感染治療過程中應(yīng)規(guī)范、合理的使用抗菌藥物，避免在抗菌藥物選擇壓力下產(chǎn)生新的耐藥基因并通過整合子得以擴(kuò)散。對(duì)于多重耐藥菌株的治療，研究顯示頭孢吡肟、亞胺培南、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦、阿米卡星等耐藥率相對(duì)較低，可以用作多重耐藥菌感染的治療。國外報(bào)道亞胺培南和阿米卡星、氨芐西林/舒巴坦和阿米卡星在體外均有協(xié)同和部分協(xié)同作用。隨著器官移植后免疫抑制劑的使用及重癥監(jiān)護(hù)病房呼吸機(jī)的應(yīng)用等，臨床泛耐藥菌株的檢出率較前明顯增加，特別是非發(fā)酵菌的泛耐藥現(xiàn)象更加嚴(yán)重。研究資料顯示，多黏菌素可能是目前對(duì)泛耐藥的銅綠假單胞菌或鮑曼不動(dòng)桿菌最有效的抗菌藥物之一，多數(shù)患者在指導(dǎo)劑量［多黏菌素B～/(kg·d)］治療條件下全身給藥耐受良好，不良反應(yīng)發(fā)生率較低且輕微，且多黏菌素誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生繼發(fā)耐藥可能性低［26，27］。Timurkaynak等研究表明多黏菌素或聯(lián)合使用其它藥物對(duì)泛耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌療效肯定，聯(lián)合其它類抗菌藥物治療可以增加療效并可能避免誘導(dǎo)耐藥性的產(chǎn)生［28］。周伯平［29］等通過對(duì)一例泛耐藥的銅綠假單胞引起的肺部感染在先、后使用頭孢吡肟、亞胺培南、阿米卡星等治療無效時(shí)，使用多黏菌素靜脈和霧化吸入治療33d后患者明顯好轉(zhuǎn)，治療過程中血肌酐一直在正常范圍內(nèi)，未出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，提示多黏菌素可以作為泛耐藥菌的治療方法之一。

7結(jié)語

整合子系統(tǒng)是近年發(fā)現(xiàn)的新可移動(dòng)基因元件，可以捕獲耐藥基因，使細(xì)菌表現(xiàn)為對(duì)抗生素多重耐藥，給臨床治療帶來極大的困難。整合子本身不能移動(dòng)，但常作為轉(zhuǎn)座子的一部分或借助可移動(dòng)性質(zhì)粒在同種細(xì)菌或不同種細(xì)菌間播散，造成細(xì)菌耐藥性的擴(kuò)大。通過對(duì)整合子系統(tǒng)的進(jìn)一步研究，可以

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