耳葉苔畢業(yè)設(shè)計(jì)論文

摘要：psbA基因編碼的D1蛋白是光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的重要組成部分，參與維持PSⅡ反應(yīng)中心構(gòu)象的穩(wěn)定和電子的傳遞。以耳葉苔科植物的psbA基因序列作為研究材料，通過(guò)預(yù)測(cè)耳葉苔科各物種間的分化時(shí)間，推測(cè)可能影響其進(jìn)化的外部因素；應(yīng)用位點(diǎn)模型、分支模型、分支位點(diǎn)模型以及FEL模型對(duì)psbA基因進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化分析，檢測(cè)可能受到正選擇的位點(diǎn)，為D1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究提供參考信息。研究結(jié)果顯示耳葉苔科植物最早的分化發(fā)生在距今約121Ma年前，進(jìn)入新生代分化速度明顯加快，推測(cè)與被子植物的興盛有關(guān)；通過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化分析，在D1蛋白中檢測(cè)到4個(gè)正選擇位點(diǎn)，30個(gè)高度保守的位點(diǎn)，研究結(jié)果再一次驗(yàn)證了psbA基因高度保守的特性。關(guān)鍵詞：耳葉苔科；psbA基因；分歧時(shí)間；適應(yīng)性進(jìn)化；DivergenceTimeEstimationandAdaptiveEvolutionAnalysisofFrullaniaceae收稿日期:收稿日期:修改稿收到日期：基金項(xiàng)目：作者簡(jiǎn)介：孫君波(1986-)，男（漢族），碩士生，專業(yè)方向：植物學(xué)。E-mail:dxxsjb@163.com通訊作者：蘇應(yīng)娟(1965-)，女，博士，研究方向：進(jìn)化遺傳學(xué)。TelE-mail:suyj@Abstract:D1proteinencodedbypsbAgeneisanveryimportantcomponentofPhotosynthesisSystemⅡ(PSⅡ)andcontributestothestabilityofPSⅡ’sreactioncenterandelectrontransfer.ThedivergencetimeisestimatedusingpsbAgeneofFrullaniaceae,theadaptiveevolutionofpsbAgeneisalsoanalyzedundersitemodel,branchmodel,branch-sitemodelandFELmodel,respectively.Theresultshowsthatthefirstdivergenceeventhappenedabout121Maago,thespeedofdivergenceacceleratedafterCenozoic;Foursiteswerefoundedunderpositiveselectionwhilethirtysitesundernegativeselectionandnositewasfoundedtoexperiencedcoevolution.TheresultofourresearchisanotherevidenceofthehighlyconservativeofpsbAgene.Keywords:Frullaniaceae;psbAgene;divergencetime;adaptiveevolution;coevolution在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間里，人們普遍認(rèn)同這樣一種觀點(diǎn)：白堊紀(jì)被子植物的興起伴隨著包括蕨類植物在內(nèi)的眾多非種子維管植物多樣性和豐富度的急劇下降。Schnelder等基于化石記錄利用分子鐘重新估算了被子植物和蕨類各自的分化時(shí)間，研究結(jié)果表明現(xiàn)存的絕大多數(shù)蕨類植物的分化發(fā)生在白堊紀(jì)被子植物繁盛之后，即蕨類在適應(yīng)由被子植物提供的新的生境的過(guò)程中發(fā)生了物種的“輻射式”增長(zhǎng)。之后對(duì)水龍骨科附生蕨類rbcL基因的適應(yīng)性進(jìn)化分析表明蕨類植物的確可以通過(guò)功能基因的進(jìn)化達(dá)到適應(yīng)外界新環(huán)境的目的。苔蘚植物是一類與蕨類具有相似起源與進(jìn)化歷史的植物類群，對(duì)蕨類的研究結(jié)果提示我們苔蘚植物在進(jìn)化過(guò)程中極有可能也經(jīng)歷了類似的物種快速分化的階段。耳葉苔科（Frullaniaceae）是苔類植物中較大的一科，包括毛耳苔屬（Jubula）和耳葉苔屬（Frullania）。現(xiàn)存的耳葉苔科植物約有800多種[1-2]，主要分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，其生活方式以附生為主。由于在水分、光照等方面存在較大差異，推測(cè)耳葉苔科各物種在進(jìn)化過(guò)程中相關(guān)的功能基因會(huì)發(fā)生適應(yīng)性進(jìn)化，尤其是與光合作用相關(guān)的基因。光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）定位于葉綠體的基粒類囊體膜上，是光反應(yīng)“Z”鏈上的第一個(gè)蛋白-色素復(fù)合體，同時(shí)也是自然界中唯一一個(gè)能將水分子分解成氫和分子氧的復(fù)合體。PSⅡ主要負(fù)責(zé)光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化，在光合作用過(guò)程中發(fā)揮重要作用。psbA基因編碼的D1蛋白是構(gòu)成PSⅡ反應(yīng)中心的核心蛋白之一，與D2蛋白共同構(gòu)成了PSⅡ的基本骨架；D1蛋白也是PSⅡ中一個(gè)重要的功能蛋白亞基，直接能與了光合作用過(guò)程中原初電荷的分離與電子傳遞，因此，D1蛋白在結(jié)構(gòu)上發(fā)生的任何改變都有可能極大的影響PSⅡ的結(jié)構(gòu)與功能，進(jìn)而影響光合作用的效率。因此在時(shí)間框架下對(duì)psbA基因進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化分析將有助于進(jìn)一步闡明光合作用中功能基因適應(yīng)性進(jìn)化的機(jī)制。生物進(jìn)化就是生物與環(huán)境之間相互作用并導(dǎo)致遺傳系統(tǒng)與表型發(fā)生一系列不可逆改變并不斷適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程（楊繼等.植物生理學(xué)，高等教育出版社）。在分子水平上進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化分析可以為蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究提供重要的參考信息。尤其是1962年Zuckerkandl提出分子鐘假說(shuō)之后，人們可以在時(shí)間框架下研究生物的進(jìn)化歷史，并將生物的進(jìn)化與地質(zhì)史上的重大事件聯(lián)系起來(lái)，有助于深入理解環(huán)境變遷影響生物適應(yīng)性進(jìn)化的機(jī)制。經(jīng)過(guò)近五十年的發(fā)展與完善，如今的“分子鐘”假說(shuō)已經(jīng)較好的解決了不同譜系間分子異速進(jìn)化的問(wèn)題，即使在缺少化石資料的情況下也可以很好的估計(jì)物種的分歧時(shí)間，這為研究早期物種的適應(yīng)性進(jìn)化提供了契機(jī)。鑒于psbA基因在光合作用中的重要作用以及GenBank中已經(jīng)收錄了大量的psbA基因全序列，本研究選取110種耳葉苔科植物的psbA基因全序列進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化分析，目的在于：（1）通過(guò)估計(jì)耳葉苔科各物種的分化時(shí)間，推測(cè)可能影響其進(jìn)化的地質(zhì)事件；（2）檢測(cè)psbA基因各位點(diǎn)在進(jìn)化過(guò)程中承受的選擇壓力，進(jìn)而推斷在維持D1蛋白結(jié)構(gòu)、功能以及適應(yīng)環(huán)境方面發(fā)揮重要作用的位點(diǎn)，為D1蛋白的結(jié)構(gòu)功能研究提供參考資料。1、材料和方法1.1序列數(shù)據(jù)從GenBank下載110種耳葉苔科植物以及6種作為外類群的細(xì)鱗苔科植物的psbA基因全長(zhǎng)序列(表1)。應(yīng)用ClustalX2.0軟件[9]對(duì)序列進(jìn)行多重比對(duì)并加以手工校正；編輯后的序列矩陣中，每條序列包含有1059個(gè)核苷酸，353個(gè)密碼子。本文中氨基酸位點(diǎn)編號(hào)參照Lejeuneapallescens（ABL86495）的編碼。耳葉苔科系統(tǒng)發(fā)育重建與分歧時(shí)間估計(jì)運(yùn)行Modeltest3.7軟件選取最優(yōu)的核苷酸進(jìn)化模型。根據(jù)Modeltest選取的GTR+I+G模型設(shè)置似然模型參數(shù)，用Mrbayes3.1.2軟件經(jīng)貝葉斯途徑構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育模型的后驗(yàn)概率依據(jù)Mropolis-Hastings-Green算法通過(guò)4條鏈（MarkovChainMonteCarlo,MCMC）運(yùn)行15000000代估計(jì)。MCMC分析以隨機(jī)樹起始，每100代保存1棵樹，使用Tracerv1.4.1軟件[12]檢驗(yàn)各參數(shù)的收斂程度。最初的37500棵樹被當(dāng)作老化樣本摒棄，以剩余樣本構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。采用BEASTv1.5.3軟件[10]中的UCLD（UncorrelatedLognormalDistributedRelaxedClockModel）分子鐘模型估算各分支的分歧時(shí)間，利用最近共同祖先時(shí)間（Tmrca，themostcommonancient）對(duì)各分支的分歧時(shí)間加以校正。根據(jù)Modeltest3.7軟件[11]選取的核苷酸替換模型設(shè)定MCMC運(yùn)算的參數(shù)，迭代運(yùn)算30000000代，每1000代保存1株樣本；利用Tracerv1.4.1軟件[12]檢驗(yàn)各參數(shù)的收斂程度。將最初的7500棵樹作為老化樣本摒棄，用剩余樣本重建時(shí)間尺度下的一致樹。表1植物材料及其psbA基因GenBank登錄號(hào)Table1PlantmaterialsandtheirpsbAgeneGenBankaccessionnumbers中文名Chinesename學(xué)名SpeciesnameGenebank登錄號(hào)Accessionnumber-FrullanoidesmexicanaSlageren.EF011851-FrullaniaaculeataTaylorFJ380698喙尖耳葉苔FrullaniaacutilobaMitt.FJ380572-Frullaniaaff.neurotaCosta&GradsteinFJ380637-FrullaniaamplicraniaSteph.FJ380599-FrullaniaampulliferaJ.B.Jack&Steph.FJ380561-FrullaniaanderssoniiAngstrom.FJ380558-FrullaniaangulataMitt.FJ380703-FrullaniaanomalaE.A.Hodgs.FJ380611-FrullaniaapicalisMitt.FJ380695尖葉耳葉苔Frullaniaapiculata(Reinw.,Blume&Nees)Dumort.FJ380681折扇耳葉苔Frullaniaarecae(Spreng.)GottscheFJ380624-FrullaniaarmitianaSteph.FJ380676-Frullaniaaterrima(Hook.f.&Taylor)Gottsche,Lindenb.&NeesFJ380680-Frullaniaatrata(Sw.)Dumort.FJ380687-FrullaniaazoricaSim-Simetal.FJ380586緬甸耳葉苔FrullaniaberthoumieuiiSteph.FJ380563細(xì)莖耳葉苔FrullaniabolanderiAustin.FJ380671-FrullaniabrasiliensisRaddiFJ380700-FrullaniabrittoniaeA.Evans.FJ380592-Frullaniacalifornica(AustinexUnderw.)A.EvansFJ380658-Frullaniacf.madothecoidesDavisAY607942-Frullaniachevalieri(R.M.Schust.)R.M.Schust.FJ380616-Frullaniacongesta(Hook.f.&Taylor)Hook.f.&TaylorexGottscheetal.FJ380645-FrullaniacuencensisTaylorFJ380636-FrullaniadeplanataMitt.FJ380568-FrullaniadepressaMitt.FJ380634-Frullaniadiptera(Lehm.)Gottsche,Lindenb.&NeesFJ380570-FrullaniaduthianaSteph.FJ380593-FrullaniaeboracensisGottscheAY688827-Frullaniaeboracensissubsp.Parvistipula(Steph.)R.M.Schust.FJ380588-Frullaniaecklonii(Spreng.)Spreng.FJ380622皺葉耳葉苔Frullaniaericoides(NeesexMart.)Mont.FJ380550波葉耳葉苔FrullaniaeymaeS.Hatt.FJ380562-FrullaniafalcilobaTaylorexLehm.FJ380544-FrullaniafengyangshanensisR.L.Zhu&M.L.SoFJ380596-Frullaniaferdinandi-muelleriSteph.FJ380575-Frullaniafragilifolia(Taylor)Gottsche,Lindenb.&NeesFJ380667-Frullaniafugax(Hook.f.&Taylor)Gottsche,Lindenb.&NeesFJ380609-FrullaniafulfordiaeS.Hatt.FJ380608暗綠耳葉苔芽胞變種Frullaniafuscovirensvar.gemmipara(R.M.Schust.&S.Hatt.)S.Hatt.&P.J.LinFJ380590短瓣耳葉苔Frullaniagaudichaudii(Nees&Mont.)Nees&Mont.(Ⅰ)FJ380665-FrullaniagibbosaNeesFJ380638-Frullaniaglomerata(Lehm.&Lindenb.)Nees&Mont.FJ380613-Frullaniagracilis(Reinw.,Blume&Nees)Dumort.FJ380674-FrullaniagrossiclavaSteph.FJ380656-FrullaniahamataSteph.FJ380651-FrullaniahattoriivonKonrat&BragginsFJ380678-FrullaniaholostipulaS.Hatt.&D.G.GriffinFJ380627-FrullaniahoweanaSteph.FJ380559細(xì)瓣耳葉苔FrullaniahypoleucaNeesFJ380639-FrullaniaincumbensMitt.FJ380610石生耳葉苔FrullaniainflataGottscheFJ380670-Frullaniaintermedia(Reinw.,Blume&Nees)Dumort.FJ380652-Frullaniaintumescens(Lehm.&Lindenb.)Lehm.&Lindenb.FJ380690-FrullaniajackiiGottscheFJ380595-FrullaniakunzeiLehm.&Lindenb.FJ380697-Frullanialobulata(Hook.)Dumort.FJ380619-FrullaniamagellanicaF.Weber&NeesFJ380618-FrullaniameyenianaLindenb.FJ380693-FrullaniamicrocaulisGolaFJ380620-Frullaniamicrophylla(Gottsche)PearsonFJ380668-FrullaniamirabilisJ.B.Jack&Steph.FJ380685列胞耳葉苔Frullaniamoniliata(Reinw.,Blume&Nees)Mont.AY507484-Frullaniamonocera(Taylor)Gottsche,Lindenb.&NeesFJ380574-FrullaniamoritzianaLindenb.&GottscheFJ380691-FrullaniamultilaceraSteph.FJ380673尼泊爾耳葉苔Frullanianepalensis(Spreng.)Lehm.&Lindenb.FJ380580厚角耳葉苔Frullanianodulosa(Reinw.,Nees&Blume)NeesFJ380650-FrullaniaobcordataLehm.&Lindenb.FJ380641-FrullaniaobscurifoliaMitt.FJ380604-FrullaniapatulaMitt.FJ380567-FrullaniaperuvianaGottscheFJ380704-FrullaniapittieriSteph.FJ380692-FrullaniaplanaSull.FJ380583-FrullaniapolystictaGottsche,Lindenb.&NeesFJ380660-FrullaniaptychanthaMont.FJ380644-FrullaniapurpureaSteph.FJ380672-FrullaniareflexistipulaSandeLac.FJ380573-FrullaniaregularisSchiffnerFJ380654-FrullaniarepandistipulaSandeLac.FJ380646-FrullaniareptansMitt.FJ380603褶瓣耳葉苔Frullaniariojaneirensis(Raddi)SpruceFJ380628-FrullaniaripariaHampeexLehm.FJ380598-Frullaniarostrata(Hook.f.&Taylor)Gottsche,Lindenb.&NeesFJ380615齒葉耳葉苔FrullaniaserrataGottscheFJ380683-FrullaniasheanaS.Hatt.FJ380675-FrullaniasolanderianaColensoFJ380614-Frullaniasp.Pocs&PocsFJ380679-FrullaniasphaerocephalaSpruceFJ380621-FrullaniaspiniferaTaylorFJ380560-FrullaniaspinigastriaS.Hatt.FJ380566-Frullaniasquarrosula(Hook.f.&Taylor)Hook.f.&TaylorexGottscheetal.FJ380547-FrullaniasubcaducaS.Hatt.FJ380597-FrullaniasubdentataSteph.FJ380682-FrullaniasubincumbensS.Hatt.FJ380605-Frullaniasubnigricaulisvar.subtruncataS.HattFJ380565-FrullaniasubrostrataS.Hatt.FJ380677歐耳葉苔Frullaniatamarisci(L.)Dumort.AM396284-Frullaniatamariscisubsp.asagrayana(Mont.)S.Hatt.FJ380657-Frullaniatamariscisubsp.Nisquallensis(Sull.)S.Hatt.FJ380661塔拉大克耳葉苔FrullaniataradakensisSteph.FJ380591-FrullaniatetrapteraNees&Mont.FJ380633-Frullaniatrinervis(Lehm.)Lehm.&Lindenb.FJ380647-FrullaniausamiensisStephFJ380589-JubulabogotensisSteph.AM396281毛耳苔Jubulahutchinsiaesubsp.javanica(Steph.)Verd.AY507492-Jubulahutchinsiaesubsp.pennsylvanica(Steph.)Verd.AY607954-LejeuneacancellataNees&Mont.exMont.EF011810-Lejeuneacavifolia(Ehrh.)Lindb.Emend.BuchAM396279-LejeuneacerinavoucherWilsonetal.EF011820-LejeuneacladogynaEvansAY607958-Lejeuneaflava(Sw.)NeesEF011789-LejeuneapallescensMitt.EF011772-Lejeuneapaucidentata(Steph.)GrolleEF011826-NipponolejeuneapiliferaAM396291-NipponolejeuneasubalpinaAM3962901.3序列變異程度分析用BioEditversion[35]將核苷酸序列翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列并進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)公式H(l)=-Sf(b,l)ln(f(b,l))計(jì)算各氨基酸位點(diǎn)的熵值（Entropyvalue）并繪制熵圖（Entropyplot）。每個(gè)位點(diǎn)的熵值與其他位點(diǎn)的狀態(tài)無(wú)關(guān)，只取決于該位點(diǎn)上各類氨基酸殘基出現(xiàn)的頻率。熵值的大小反映該位點(diǎn)變異程度的高低[36,37]。1.4適應(yīng)性進(jìn)化分析采用進(jìn)化分析軟件PAML4.1[13]中的位點(diǎn)模型、分支模型以及分支-位點(diǎn)模型（A模型）分析耳葉苔科D1蛋白各位點(diǎn)在適應(yīng)性進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)受的選擇壓力：位點(diǎn)模型假定系統(tǒng)樹不同分支所經(jīng)受的選擇壓力相同，但同一分支上的不同氨基酸位點(diǎn)經(jīng)受的選擇壓力不同。本研究選用位點(diǎn)模型中的3對(duì)模型：M0(單比率模型)和M3(離散模型)、M1a(近中性模型)和M2a(正選擇模型)以及M7(beta模型)和M8(beta&ω模型)[14-15]。其中模型M0、M1a以及M7是空模型，假設(shè)條件中不允許ω>1，而模型M2a、M3以及M8的假設(shè)條件允許ω>1。模型M2a、M3以及M8和他們各自的空模型（M0、M1a以及M7）是相互嵌套的，可以對(duì)它們進(jìn)行似然比檢驗(yàn)(likelihoodratiotest,LRT),檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量為2??(??=?1－?0，?1、?0分別表示兩個(gè)模型下的最大似然值)，依χ2分布檢驗(yàn)其顯著性,自由度為兩個(gè)模型參數(shù)數(shù)目的差值。分支模型[15,16]允許不同分支所經(jīng)受的選擇壓力不同。其中單比率（one-ratio）模型是最簡(jiǎn)單的模型，假設(shè)進(jìn)化樹上所有分支經(jīng)受的選擇壓力相同，即所有分支具有相同的ω值；自由比率（free-ratio）模型假設(shè)不同的分支經(jīng)受不同的選擇壓力，即不同分支具有不同的ω值。分支-位點(diǎn)模型[17,18]中的A模型把所有分支分為兩類：前景分支和后景分支，只有前景分支可能受到正選擇作用。該模型中假設(shè)存在四類位點(diǎn)：0類位點(diǎn)在所有分支中都是保守的，其ω值（ω0）介于0到1之間；1類位點(diǎn)在所有分支中受到中性選擇的作用，其ω值（ω1）等于1；2a類位點(diǎn)在背景分支中受到負(fù)選擇，但在前景支中受到正選擇；2b類位點(diǎn)在背景支中受到中性選擇，但在前景支中受到正選擇。該模型包括兩種似然比檢驗(yàn)：檢驗(yàn)1和檢驗(yàn)2，根據(jù)Yang的建議，本研究采用檢驗(yàn)2[13]。此外，將耳葉苔科psbA基因序列提交在線服務(wù)器Datamonkey（/）[19]采用FEL（FixedEffectsLikelihoodmodel)模型分析各氨基酸位點(diǎn)經(jīng)受的選擇壓力。最后將序列信息提交在線服務(wù)器SWISS-MODEL（/repository/）進(jìn)行同源建模[21-23]。2結(jié)果2.1耳葉苔科系統(tǒng)發(fā)育重建與分歧時(shí)間估計(jì)圖1為基于貝葉斯法構(gòu)建的耳葉苔科各物種psbA基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。由構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，耳葉苔科較明顯的分為兩大支（后驗(yàn)概率為1.00）：第一支由毛耳苔屬的JubulabogotensisSteph.、Jubulahutchinsiaesubsp.javanica(Steph.)Verd.和日鱗苔屬的Nipponolejeuneapilifera、Nipponolejeuneasubalpina組成，這與J?rnHentschel等[24]所報(bào)道的一致；第二支由毛耳苔屬Jubulahutchinsiaesubsp.pennsylvanica(Steph.)Verd.和所有耳葉苔科的物種組成。其中Jubulahutchinsiaesubsp.pennsylvanica(Steph.)Verd.處于基部位置。為準(zhǔn)確估計(jì)耳葉苔科各主要支系的分歧時(shí)間，本研究采用JochenHeinrichs等[25]報(bào)道的日鱗苔科與耳葉苔科的分歧時(shí)間進(jìn)行單點(diǎn)校正。分析結(jié)果顯示，耳葉苔科第一次分化發(fā)生在約121百萬(wàn)年前，進(jìn)入新生代（約65.0百萬(wàn)年前）之后分化速度明顯加快，分析可能是與白堊紀(jì)被子植物的興盛以及古新世-始新世最熱地質(zhì)事件有關(guān)。圖1基于耳葉苔科psbA基因序列數(shù)據(jù)和UCLD分子鐘模型構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1ThephylogenetictreeofFrullaniaceaeestablishedfrompsbAgenesequenceswithuncorrelatedlognormaldistributedrelaxedclockmodel2.2序列變異程度分析圖2耳葉苔科D1蛋白各位點(diǎn)的熵值圖Fifure2EntropyplotforaminoacidresiduesinD1proteinofFrullaniaceae圖2為耳葉苔科D1蛋白各位點(diǎn)的熵值圖。熵值為零表示該位點(diǎn)高度保守，熵值越大說(shuō)明該位點(diǎn)發(fā)生的改變?cè)蕉啵儺惓潭仍礁?。由圖我們可以看出耳葉苔科psbA基因中大部分位點(diǎn)是高度保守的，只有少數(shù)的位點(diǎn)在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了改變。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，全長(zhǎng)為353個(gè)殘基的D1蛋白前體共有18個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了變異，占序列全長(zhǎng)的5.1%；其中有6個(gè)位點(diǎn)位于C末端的非功能區(qū)，該區(qū)域只存在于D1蛋白前體中，在成熟D1蛋白中被剪切除去[5]；其他12個(gè)變異位點(diǎn)則分散分布在D1蛋白的功能區(qū)中。這些變異位點(diǎn)的變異程度普遍較低（熵值介于0.04和0.35之間），只有位點(diǎn)30I和155T的變異度較高（熵值分別為0.66781和0.64956）。2.3耳葉苔科psbA基因正選擇位點(diǎn)的鑒定用PAML4.0b10軟件計(jì)算得耳葉苔科psbA基因在位點(diǎn)模型、分支模型以及分支-位點(diǎn)模型下的對(duì)數(shù)似然值和各參數(shù)估計(jì)值（表2）。在位點(diǎn)模型中，第一對(duì)模型M0-M3用于檢測(cè)作用于各位點(diǎn)上的選擇壓力是否存在差異。模型M3的似然值?=-3907.386458，模型M0的似然值?=-3985.506892，似然比檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量2Δ?=156.240868，明顯大于d.f.=4、P=95%時(shí)χ2檢驗(yàn)的臨界值9.49，模型M3統(tǒng)計(jì)上顯著優(yōu)于M0（表3），由此可推斷耳葉苔科psbA基因各位點(diǎn)上經(jīng)受的選擇壓力顯著不同，即不同位點(diǎn)的ω值顯著不同。模型M2a以及M8的假定條件中均允許ω>1，并同時(shí)檢測(cè)到同一個(gè)氨基酸位點(diǎn)，即155T（P>99%），受到正選擇，LRT檢驗(yàn)結(jié)果顯著。在分支模型中，通過(guò)比較自由比率模型和單比率模型共檢測(cè)出A、B、C三個(gè)分支可能發(fā)生正選擇(圖1)，其ω值均為999.00。在分支-位點(diǎn)模型中分別以這三個(gè)分支作為前景分支進(jìn)行分析，結(jié)果只在分支A和分支C檢測(cè)到一個(gè)正選擇位點(diǎn)：19N。但在隨后的LRT檢驗(yàn)中，分支A和分支C的檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量2Δ?分別為0.423062和0.422382，均小于d.f.=4、P=95%時(shí)χ2檢驗(yàn)的臨界值3.84，檢驗(yàn)結(jié)果并不支持位點(diǎn)19N是一個(gè)統(tǒng)計(jì)上顯著的發(fā)生正選擇的氨基酸位點(diǎn)，推測(cè)可能是由于前景分支選擇壓力放松造成的假陽(yáng)性結(jié)果。表2各類位點(diǎn)間可變?chǔ)乇戎的Ｐ拖碌膮?shù)估計(jì)值和對(duì)數(shù)似然值Table2Parameterestimatesandlog-likelihoodvaluesundermodelsofvariableωratiosamongsites模型Modelsnp似然值?參數(shù)估計(jì)值Estimatedvalueofparameters正選擇位點(diǎn)Positiveselectionsites位點(diǎn)模型SitemodelsM0（單一比值）M0：Oneratio175-3985.506892ω=0.02650無(wú)NoneM1a（近中性）M1a：Nearneutral176-3933.082580p0=0.97603,ω0=0.02397P1=0.00810,ω1=1.00000不允許NotallowedM2a（選擇）M2a：Positiveselection178-3924.066915p0=0.97656,P1=0.02060，P2=0.00284ω0=0.00844,ω1=1.00000ω2=6.08838155T**M3（離散）M3：Discrete179-3907.386458p0=0.92026,p1=0.07690,p2=0.00284ω0=0.00000，ω1=0.23603，ω2=5.74112155T**M7（beta）M7：beta176-3928.684116p=0.00500，q=0.10114不允許NotallowedM8（beta&ω）M8：beta&ω178-3907.890409p0=0.99716，p=0.01082，q=0.26453,p1=0.00284，w=5.74080155T**分支模型Branchmodels單比率（one-ratio）175-3985.506892ω=0.02650無(wú)None自由比率(free-ratio)347-3925.532334ωA=999.0000，ωB=999.0000，ωC=999.0000無(wú)None分支-位點(diǎn)模型Branch-sitemodels分支a零假設(shè)A0NullmodelA0177-3929.967965p0=0.00000，p1=0.00000，p2a+p2b=1.00000ω0=0.00812，ω1=1.00000，ω2=1.00000不允許Notallowed備選假設(shè)AAlternativemodelA178-3929.756434p0=0.00000，p1=0.00000，p2a+p2b=1.00000ω0=0.00812，ω1=1.00000，ω2=84.3396919N（0.755）分支b零假設(shè)B0NullmodelB0177-3932.680023p0=0.97597，p1=0.02403，p2a+p2bω0=0.00811，ω1=1.00000，ω2=1.00000不允許Notallowed備選假設(shè)BAlternativemodelB178-3932.680023p0=0.97596，p1=0.02404，p2a+p2b=0.00000ω0=0.00811，ω1=1.00000，ω2=1.00000無(wú)None分支c零假設(shè)C0NullmodelC0177-3929.970251p0=0.00000，p1=0.00000，p2a+p2b=1.00000ω0=0.00812，ω1=1.00000，ω2=1.00000不允許Notallowed備選假設(shè)CAlternativemodelC178-3929.759060p0=0.00000，p1=0.00000，p2a+p2b=1.00000ω0=0.00812，ω1=1.00000，ω2=96.2103919N(0.873)此外，位點(diǎn)模型檢測(cè)到大量的負(fù)選擇位點(diǎn)，說(shuō)明耳葉苔科植物的psbA基因非常保守。模型M0由序列數(shù)據(jù)估計(jì)得各位點(diǎn)的平均ω值為0.0265，表明凈化選擇在psbA基因的進(jìn)化過(guò)程中起主導(dǎo)作用。模型M2a和M8均允許位點(diǎn)受到正選擇作用，在統(tǒng)計(jì)上也顯著優(yōu)于它們各自對(duì)應(yīng)的空模型M1a和M7。模型M2a的結(jié)果顯示psbA基因中有97.7%的位點(diǎn)受到負(fù)選擇的作用（ω=0.00844）。同時(shí)模型M8也檢測(cè)到99.7%的位點(diǎn)處于負(fù)選擇壓力下。所有的分析結(jié)果均支持耳葉苔科psbA在進(jìn)化上是高度保守的。表3似然比值檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量（2Δ?）Talbe3Likelihoodratiostatistics(2Δ?)模型比較Comparion2Δ?2Δ?自由度d.f.位點(diǎn)模型SitemodeM0vs.M3156.24086849.49M1avs.M2a18.03133025.99M7vs.M841.58741425.99M8vs.M8a22.24697613.84分支模型BranchmodelM0vs.F119.949116172206.87分支-位點(diǎn)模型Branch-sitemodelA0vs.A0.42306213.84B0vs.B0.00000013.84C0vs.C0.42238213.84.注：np表示模型中參數(shù)的數(shù)目；“*”和“**”分別表示在95%和99%水平上檢測(cè)到的正選擇位點(diǎn)。Note:npstandsforthenumberofparametersindifferentmodels.“*”and“**”standforthepositivelyselectedsitedwerefoundedunder95%and99%crediblelevel,respectively.應(yīng)用在線分析軟件Datamonkey的FEL模型分別檢測(cè)P=0.1、P=0.05、P=0.01時(shí)psbA基因上的選擇壓力變化。P=0.1時(shí)共檢測(cè)到4個(gè)正選擇位點(diǎn)（155T、203I、345A、351V）和84個(gè)負(fù)選擇位點(diǎn)；P=0.05時(shí)共檢測(cè)到1個(gè)正選擇位點(diǎn)（155T）和65個(gè)負(fù)選擇位點(diǎn)；P=0.001時(shí)檢測(cè)到1個(gè)正選擇位點(diǎn)（155T）和30個(gè)負(fù)選擇位點(diǎn)（圖3A）。在FEL模型下檢測(cè)到的正選擇位點(diǎn)的ω值都接近于無(wú)限大，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯著，表明這些位點(diǎn)幾乎沒有發(fā)生同義替換（圖3B）。除檢測(cè)到正選擇位點(diǎn)外，在P=0.1、P=0.05、P=0.01時(shí)還分別檢測(cè)到84、65、30個(gè)高度保守的位點(diǎn)（分別占氨基酸殘基總數(shù)的23.80%、18.41%、8.50%），推測(cè)這些保守位點(diǎn)與維持D1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)，表明耳葉苔科AB圖3耳葉苔特psbA基因在Datamonkey中的分析結(jié)果A:Datamonkey檢測(cè)到的正負(fù)選擇位點(diǎn)數(shù)；B：30個(gè)高度保守位點(diǎn)的dN以及dS值Figure3TheDatamonkeyanalysisresultforthepsbAgeneofFrullaniaceaeA:ThenumbersofnegativelyandpositivelyselectedsitesinDatamonkey;B:ThedNanddSvaluesof30highlyconservedsites.2.4正負(fù)選擇位點(diǎn)的定位由SWISS-MODEL預(yù)測(cè)得到D1蛋白第10到344號(hào)位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)，用Raswin軟件將檢測(cè)到的正選擇位點(diǎn)和高度保守位點(diǎn)在三維結(jié)構(gòu)上進(jìn)行定位。正選擇位點(diǎn)155T和203I分別定位在跨膜α-螺旋B和D上(圖4)，另兩個(gè)正選擇位點(diǎn)345A和351V位于C末端的九個(gè)氨基酸殘基的延長(zhǎng)區(qū)（該區(qū)域在成熟的D1蛋白中被切除）。將FEL模型檢測(cè)到的30個(gè)高度保守的位點(diǎn)在D1蛋白的三維結(jié)構(gòu)上進(jìn)行定位發(fā)現(xiàn)，這些位點(diǎn)大多在維持D1蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和電子的傳遞方面扮演重要的角色。有11個(gè)位點(diǎn)（33F、115I、130E、132E、133L、162P、163I、205V、270S、271L、286T）定位在跨膜α-螺旋上（圖5），由此可見這些跨膜α-螺旋對(duì)于維持D1蛋白結(jié)構(gòu)和功能非常重要；另有8個(gè)位點(diǎn)（77I、130E、228T、252H、263A、270S、271L、323R）是D1蛋白與D2蛋白間發(fā)生相互作用的位點(diǎn)；另有兩個(gè)位點(diǎn)（252H、271L）還參與了QB結(jié)合“口袋”的形成，而QB在D1蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)正是多種有機(jī)農(nóng)藥的作用位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的突變與植物各種抗性特征的形成有關(guān)[33]。其他的位點(diǎn)參與了D1蛋白膜兩側(cè)結(jié)構(gòu)域的形成，可能在維持D1蛋白結(jié)構(gòu)和電子的快速傳遞方面發(fā)揮作用。圖4psbA基因編碼D1蛋白三維結(jié)構(gòu)以及正選擇位點(diǎn)的空間位置（基質(zhì)側(cè)在上，類囊體腔側(cè)在下）Figure4The3-DstructureofD1proteinencodedbypsbAgeneandthepositionforthepositivelyselectedsites(Thecytoplasmicsideisontop,thelumenalsideonthebottom).圖5psbA基因編碼D1蛋白比對(duì)結(jié)果(用紅色陰影標(biāo)出部分表示五處跨膜結(jié)構(gòu)域，分別用H1、H2、H3、H4、H5表示)。Figure5ThealignmentresultforD1proteinencodedbypsbAgene(Fivetransmembraneregionsarehighlighted,signedbyH1、H2、H3、H4、H5,respectively)3討論本研究利用已報(bào)道的耳葉苔科與細(xì)鱗苔科的分歧時(shí)間（155.9±10.3百萬(wàn)年前）進(jìn)行單點(diǎn)校正，估計(jì)得耳葉苔科psbA基因第一次分化事件，即毛耳苔屬和耳葉苔屬的分化，發(fā)生在距今約121百萬(wàn)年的白堊紀(jì)。進(jìn)入新生代（約65.0百萬(wàn)年前）之后分化速度明顯加快，尤其是漸新世中期（距今約30.0百萬(wàn)年），耳葉苔科的豐富度呈現(xiàn)出“輻射性”增長(zhǎng)的趨勢(shì)。這促使我們不得不思考這樣一個(gè)問(wèn)題：促使耳葉苔科發(fā)生這種物種“輻射式”增長(zhǎng)的動(dòng)力是什么呢？Schneider[29]等的研究認(rèn)為，在白堊紀(jì)被子植物的繁盛導(dǎo)致陸地生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生顯著變化。為應(yīng)對(duì)被子植物引起的陸地生態(tài)系統(tǒng)的變化，蕨類植物在白堊紀(jì)發(fā)生物種的“輻射式”分化。蘇應(yīng)娟等對(duì)水龍骨科附生蕨類Rubisco大亞基的研究也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。由此我們可以推測(cè)，白堊紀(jì)被子植物興起后也改變了耳葉苔科植物生存的環(huán)境，再加上高達(dá)的被子植物本身也為附生其上的耳葉苔植物提供了復(fù)雜的生存環(huán)境（樹干的不同部位光照強(qiáng)度和水分條件存在顯著差異），這極有可能導(dǎo)致耳葉苔科植物經(jīng)歷與蕨類植物相似的物種進(jìn)化過(guò)程。另外，耳葉苔科植物物種的“輻射式”增長(zhǎng)與當(dāng)時(shí)地球的氣候變化關(guān)系密切。進(jìn)入新生代之后，地球上曾發(fā)生許多重大的地質(zhì)事件[26]，比如古新世—始新世最熱事件(PETM，Paleocene-EoceneThermalMaximum)、漸新世初大冰期事件(EOGM，theEarliestOligoceneGlacialMaximum)以及中中新世變冷事件等，導(dǎo)致地球上的氣候發(fā)生很大波動(dòng)。古新世-始新世最熱事件(PETM)，又被稱為晚古新世最熱事件(LPTM，LatePaleoceneThermalMaximum)[27]，是指古新世末始新世初（約55百萬(wàn)年前），全球平均氣溫在很短的時(shí)間內(nèi)升高4-8℃的地質(zhì)事件。溫度的迅速升高直接導(dǎo)致全球的動(dòng)、植物分布和豐富度發(fā)生大幅度波動(dòng)[28]。全球氣溫上升使得高緯度地區(qū)的生態(tài)環(huán)境變得更適合植物生長(zhǎng)，原本分布于熱帶、亞熱帶的植被，尤其是較高等的被子植物，開始向高緯度地區(qū)擴(kuò)張。作為先鋒物種，被子植物先一步進(jìn)入新的環(huán)境，為附生在其枝干上的耳葉苔科植物向高緯度擴(kuò)張創(chuàng)造了條件[2,29]。在漸新世初期（大約34Ma年前），全球氣候開始由溫暖濕潤(rùn)向寒冷干燥轉(zhuǎn)變[30,31]，這對(duì)各種植物對(duì)環(huán)境改變的適應(yīng)能力是一種嚴(yán)峻的考驗(yàn)。一些不適應(yīng)這種氣候變化的植物類群或者向低緯度地區(qū)退縮，或者通過(guò)進(jìn)化適應(yīng)這種寒冷的氣候，進(jìn)而形成新的物種。耳葉苔科雖然是一類較低等的植物類群，但對(duì)溫度的波動(dòng)和干旱有一定的抵抗能力，我們推測(cè)耳葉苔科極有可能通過(guò)演化適應(yīng)了這種“惡劣”的環(huán)境，進(jìn)而發(fā)生了物種的快速分化。因此我們推測(cè)，進(jìn)入白堊紀(jì)之后，被子植物的繁盛為低等的耳葉苔科植物提供了復(fù)雜多樣的生存環(huán)境，再加上新生代之后一系列重大地質(zhì)事件所導(dǎo)致的地球氣候劇烈波動(dòng)的影響，耳葉苔科發(fā)生了物種的“輻射式”增長(zhǎng)（蘇老師等人的文章）。序列變異分析顯示耳葉苔科D1蛋白是高度保守的，353個(gè)氨基酸殘基中只有18個(gè)（占序列全長(zhǎng)的5.1%）發(fā)生變異，其中只有12個(gè)位點(diǎn)位于功能結(jié)構(gòu)區(qū)且變異度都不高。PAML和Datamonkey的分析結(jié)果也顯示D1蛋白是高度保守的。其中PAML位點(diǎn)模型中的M2a模型檢測(cè)到D1蛋白中97.7%的位點(diǎn)高度保守（ω<0.1），Datamonkey中的FEL模型也檢測(cè)到30個(gè)（P=0.001）高度保守的位點(diǎn)，說(shuō)明凈化選擇在耳葉苔科psbA基因的進(jìn)化過(guò)程中起主導(dǎo)作用。通過(guò)D1蛋白三維結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，本研究中檢測(cè)到的保守位點(diǎn)大都與D1蛋白生理功能的正常行使有關(guān)。比如D1蛋白上的次級(jí)電子受體QB結(jié)合區(qū)主要由D和E跨膜α-螺旋之間的位點(diǎn)組成，該區(qū)域所有位點(diǎn)的ω值均小于1；位點(diǎn)161Y和190H直接參與了光合作用過(guò)程中的水的光解，這兩個(gè)位點(diǎn)的ω值均小于0.1；Datamonkey檢測(cè)到的30個(gè)高度保守位點(diǎn)中有12個(gè)位點(diǎn)（33F、115I、130E、132E、133L、162P、163I、205V、228T、270S、271L、286T）位于跨膜α-螺旋上，有8個(gè)位點(diǎn)（77I、130E、228T、252H、263A、270S、271L、323R）是D1、D2蛋白之間相互作用的部位，這些位點(diǎn)對(duì)維持PSⅡ的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定具有重要作用。耳葉苔科psbA基因之所以如此高度保守，可能是由以下原因?qū)е碌模海?）psbA基因在耳葉苔科中是單拷貝基因，在光合作用中發(fā)揮著不可替代的作用。在漫長(zhǎng)的演化過(guò)程中psbA基因也會(huì)發(fā)生突變，但這些突變往往是有害的。由于PSⅡ功能的損失得不到補(bǔ)償，植物光合作用的效率就會(huì)降低甚至完全喪失，自然選擇就會(huì)把這些有害變異從種群中清除；psbA基因也有可能發(fā)生有利突變，但是受到遺傳漂變等非定向選擇作用的影響，這部分有利變異丟失，所以psbA表現(xiàn)的高度保守；（2）耳葉苔科有可能是通過(guò)生理功能或形態(tài)結(jié)構(gòu)上的改變達(dá)到快速適應(yīng)復(fù)雜多變的環(huán)境的目的[38-39]，因此在基因水平上找不到耳葉苔科發(fā)生適應(yīng)性進(jìn)化的證據(jù)；（3）基于密碼子替換模型，利用ω>1作為判斷正選擇的標(biāo)準(zhǔn)只能檢測(cè)到非同義突變統(tǒng)計(jì)上顯著高于同義突變的正選擇位點(diǎn)。而psbA基因是一個(gè)非常古老的基因，其適應(yīng)性進(jìn)化有可能發(fā)生在早期并被固定下來(lái)，那么利用現(xiàn)存的基因序列作為研究材料，就無(wú)法準(zhǔn)確鑒定出在其“祖輩”中發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化并被固定下來(lái)的正選擇位點(diǎn)。參考文獻(xiàn)：[1]胡人亮.苔蘚植物學(xué)[M].上海:高等教育出版社,1987.[2]吳彥君,于晶,曹同.8種耳葉苔屬植物的孢子形態(tài)及壁層結(jié)構(gòu)電鏡觀察[J].武漢植物學(xué)研究,2008,26（4）:337—342.[3]吳鵬程.苔蘚植物生物學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，1998.[4]ZHONGZHP(鐘珍萍),WUNH(吳乃虎).AreviewofthestructureandexpressionofplantphotogenepsbA[J].JournalofFujianAgriculturalUniversity(福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)),1997,26(3):257-261(inChinese).[5]馬建忠.葉綠體基因組的模式基因—光系統(tǒng)Ⅱ32kDa蛋白基因(psbA)的研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，1993，（5）：22-23.[6]李曉鵬.PSⅡ反應(yīng)中心D1蛋白的小肽抗體的制備和鑒定[J].生物化學(xué)與生物學(xué)進(jìn)展,1997,（3）:283-285.[7]郭延平,劉輝,胡美君,等.植物PSⅡ反應(yīng)中心D1蛋白的結(jié)構(gòu)與功能[J].園藝學(xué)進(jìn)展(第七輯),2006,326-331.[8]YANGZ.Computationalmolecularevolution[M].Oxford:OxfordUniversityPress,2006.[9]ThompsonJD,GibsonTJ,PlewniakF,JeanmouginF,HigginsDG.TheCLUSTAL_Xwindowsinterface:flexiblestrategiesformultiplesequencealignmentaidedbyqualityanalysistools.NucleicAcidsRes,1997,25(24):4876-4882.[10]DRUMMONDAJ,RAMBAUTA.BEAST:Bayesianevolutionaryanalysisbysamplingtrees[J].BMCEvol.Biol.,2007,7:214-221.[11]POSADAD,CRANDALLK.Modeltest:testingthemodelofDNAsubstitution[J].Bioinformatics,1998,14:817-818.[12]RAMBAUTA,DRUMMONDAJ.2009.Tracerv1.4.1http://tree.bio.ed.ac.uk/software/tracer/[2009-09-21].[13]YANGZ.PAML4:PhylogeneticAnalysisbyMaximumLikelihood[J].Mol.Biol.Evol.,2007,24:1586-1591.[14]NielsenR,YangZ.LikelihoodmodelsfordetectingpositivelyselectedaminoacidsitesandapplicationstotheHIV-1envelopegene.Genetics,1998,148(3):929-936.[15]YangZ.MaximumlikelihoodestimationonlargephylogeniesandanalysisofadaptiveevolutioninhumaninfluenzavirusA.JMolEvol,2000,51(5):423-432.[16]YangZ,NielsenR.Synonymousandnonsynonymousratevariationinnucleargenesofmammals.JMolEvol,1998,46(4):409-418.[17]YANGZ,WONGW,NIELSENR.Bayesempiricalbayesinferenceofaminoacidsitesunderpositiveselection[J].Mol.Biol.Evol.,2005,22:1107-1118.[18]ZHANGJ,NIELSENR,YANGZ.Evaluationofanimprovedbranch-sitelikelihoodmethodfordetectingpositiveselectionatthemolecularlevel[J].Mol.Biol.Evol.,2005,22:2472.[19]KOSAKOVSKYPONDSL,FROSTSDW.Notsodifferentafterall:acomparisonofmethodsfordetectingaminoacidsitesunderselection[J].Mol.Biol.Evol.,2005,22(5):1208-1222.[20]FaresMA,McNallyD.CAPS:coevolutionanalysisusingproteinsequences[J].Bioinformatics.2006,22(22):2821-2822.[21]ArnoldK.,BordoliL.,KoppJ.,andSchwedeT.(2006).TheSWISS-MODELWorkspace:Aweb-basedenvironmentforproteinstructurehomologymodelling.Bioinformatics,22,195-201.[22]SchwedeT,KoppJ,GuexN,andPeitschMC(2003)SWISS-MODEL:anautomatedproteinhomology-modelingserver.NucleicAcidsResearch31:3381-3385.[23]Guex,N.andPeitsch,M.C.(1997)SWISS-MODELandtheSwiss-PdbViewer:Anenvironmentforcomparativeproteinmodelling.Electrophoresis,18:2714-2723.[24]J?rnHentschel,MatthewJ.vonKonrat,TamásPócs,AlfonsSch?fer-Verwimp,A.JonathanShaw,HaraldSchneider,JochenHeinrichs.Molecularinsightsintothephylogenyandsubgenericclassi?cationofFrullaniaRaddi(Frullaniaceae,Porellales)..MolecularPhylogeneticsandEvolution.2009，52:142-156.[25]Jochenheinrichsetal.Evolutionofleafyliverworts(Jungermanniidae,Marchantiophyta):estimatingdivergencetimesfromchloroplastDNAsequenceusingpenalizedlikelihoodwithintegratedfossilevidence[J].MolecularPhylogenetics,2007,56(1):31-44.[26]陸鈞,陳木宏.新生代主要全球氣候事件研究進(jìn)展[J].熱帶海洋學(xué)報(bào),2006,25(6):72-79[27]ZachosJC,LohmannKC,WalkerJCG,etal.AbruptclimatechangeandtransientclimatesduringthePaleogene:Amarineperspective[J].JournalofGeology,1993,101:191-213.[28]KennettJP,StottLD.Abruptdeepseawarming,paleoceanographicchangesandbenthicextinctionsattheendofthePalaeocene[J].Nature,1991,353:3192322.[29]SchneiderH,SchuettpelzE,PryerKM,etal.Fernsdiversifiedintheshadowofangiosperms[J].Nature,2004,428(6982):553-557.[30]COXALLHK,WILSONPA,PLIKEH,etal.RapidstepwiseonsetofAntarcticglaciationanddeepercalcitecompensationinthePa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