高分子量小麥谷蛋白亞基

實驗一

小麥高分子量谷蛋白亞基測定2023/7/51高分子量小麥谷蛋白亞基

●實驗內(nèi)容：測定小麥高分子量谷蛋白亞基●實驗?zāi)康?①掌握利用不連續(xù)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)分離小麥高分子量谷蛋白亞基（HMW-GS）方法；②了解小麥高分子量谷蛋白亞基的命名方法；③識別部分常見小麥高分子量谷蛋白亞基圖譜。

2023/7/52高分子量小麥谷蛋白亞基

小麥高分子量谷蛋白亞基（HMW-GS）與小麥的加工品質(zhì)密切相關(guān)，其組成是小麥品質(zhì)預(yù)測的一項重要指標(biāo)。HMW-GS作為一種分子標(biāo)記，有助于提高小麥品質(zhì)性狀遺傳改良的效率。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)技術(shù)是目前分離小麥HMW-GS的主要方法，此方法具有準(zhǔn)確、微量、快速、操作簡便、分辨率高等優(yōu)點，尤其是可以分析半粒無胚籽粒的HMW-GS組成，所剩余的帶胚半粒仍可以播種或組織培養(yǎng)，因此此方法已經(jīng)成為小麥品種鑒定、親本選配及其后代篩選的重要方法。高分子量小麥谷蛋白亞基●實驗原理：

小麥高分子量谷蛋白亞基不連續(xù)SDS系統(tǒng)集電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)為一體，在這三種效應(yīng)的共同作用下，把小麥谷蛋白亞基按分子量大小分離開來。以亞基組成已知的中國春小麥品種做對照，就可以對待測小麥品種的HMW-GS組成進(jìn)行鑒定。2023/7/54高分子量小麥谷蛋白亞基①電荷效應(yīng)各種蛋白質(zhì)按其所帶電荷的種類及數(shù)量，在電場向一定電極，以一定的速度泳動。遷移率主要取決于所帶電荷的多少、分子量的大小以及分子的形狀等因素。高分子量小麥谷蛋白亞基②分子篩效應(yīng)

由于凝膠具有黏度和較高摩擦阻力，以及其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)直接參與了移動顆粒的分離過程，這種區(qū)別不同大小分子種類的能力就是凝膠所具有的一種篩分能力即分子篩效應(yīng)。③濃縮效應(yīng)蛋白質(zhì)樣品中的各組分在濃縮膠中會被壓縮成層，而使原來很稀的樣品得到高度濃縮。2023/7/56高分子量小麥谷蛋白亞基●

實驗材料、藥品和器材實驗材料：小麥籽粒，小麥普通中國春和馬奎斯為對照實驗器材：離心機、電泳儀、電泳槽、梳子、制膠架、成像儀、研缽、振蕩器、微波爐、天平、pH計、移液器、微量進(jìn)樣器、染色盤、搖床、量筒等。實驗藥品：丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、N,N,N,,N,-四甲基乙二胺、過硫酸銨、二硫蘇糖醇、甘氨酸、甘油、十二烷基硫酸鈉、考馬斯亮藍(lán)等。高分子量小麥谷蛋白亞基

試劑配制：①麥谷蛋白提取液：4gSDS+1gDTT+250ml0.5MTris-HCl(PH=6.8)+20ml甘油+

30mg溴酚藍(lán)

+

蒸餾水定溶至100ml。②10×電極緩沖液：Tris-HCI30.3g+

甘氨酸144g

+SDS10g+蒸餾水定溶至1000ml。③30%丙烯酰胺：30g+蒸餾水定溶至100ml。④2%甲叉雙丙烯酰胺：2g+蒸餾水定溶至100ml。高分子量小麥谷蛋白亞基

⑤1MTris-HCI（PH=6.8）:12.1gTris+蒸餾水定溶至100ml,用1NHCI調(diào)PH=6.8。⑥3MTris-HCI（PH=8.8）:36.3gTris+

蒸餾水定溶至100ml,用1MHCI調(diào)PH=8.8。⑦10%SDS：SDS10g+

蒸餾水定溶至100ml。⑧10%過硫酸銨：1g過硫酸銨

+

蒸餾水定溶10ml。⑨染色液：100mgG-250+12g三氯乙酸+蒸餾水定溶至200ml。高分子量小麥谷蛋白亞基●實驗操作步驟1、小麥谷蛋白提取程序①取單粒小麥種子研磨成粉，轉(zhuǎn)入離心管中，加入適量的蛋白質(zhì)提取液，在旋渦振蕩器上混合均勻；②將離心管放入65℃水浴鍋中水浴45min后取出離心管放，室溫冷卻；③將冷卻后的離心管12000轉(zhuǎn)/min離心30min，保存于4℃冰箱備用。高分子量小麥谷蛋白亞基2電泳程序①封板：利用1%瓊脂封板，以防玻璃板漏膠；②凝膠配制：見表1。③制膠：按表1的配方分別配制8%和15%兩種分離膠，然后用兩個取液器進(jìn)行以下操作，先吸取1.0ml已經(jīng)混勻的15%分離膠，加到玻璃板之間，再向15%分離膠中加入8%的分離膠0.5ml，充分混勻后，從中吸取

1.0ml加到玻璃板之間，如此反復(fù)操作上述步驟，高分子量小麥谷蛋白亞基直至距玻璃板上緣約3cm處時，向膠面上加一層正丁醇，靜置，直至分離膠凝固。倒置膠板，流出正丁醇，用蒸餾水沖洗膠面，用濾紙吸盡多余水。

按表1配制5%濃縮膠，混勻后倒入玻璃板之間，將梳子放置在玻璃板間，注意不要產(chǎn)生氣泡，靜置至膠凝。待濃縮膠凝固后，垂直取出梳子，加蒸餾水，甩出樣品槽中的殘膠。

2023/7/512高分子量小麥谷蛋白亞基成分8%分離膠50ml15%分離膠50ml5%濃縮膠10mlH2O23.211.56.830%Acr13.325.01.71MTris-HCl(pH8.8)12.512.51MTris-HCl(pH6.8)1.2510%SDS0.50.50.110%AP0.5(0.25)0.5(0.25)0.1TEMED0.03(0.02)0.020.01表1分離膠與濃縮膠配方成分8%分離膠50ml15%分離膠50ml5%濃縮膠10mlH2O23.211.56.830%Acr13.325.01.71MTris-HCl(pH8.8)12.512.51MTris-HCl(pH6.8)1.2510%SDS0.50.50.110%AP0.5(0.25)0.5(0.25)0.1TEMED0.03(0.02)0.020.01表1分離膠與濃縮膠配方2023/7/513高分子量小麥谷蛋白亞基④點樣：將膠板放在電泳槽中加入電極緩沖液至高出內(nèi)側(cè)玻璃板上邊約0.5cm，用微量進(jìn)樣器吸取蛋白質(zhì)10-20ul分別加在每個樣品槽底部凝膠面上。⑤電泳：下槽為正極，上槽為負(fù)極，每膠板30mA穩(wěn)流電泳，直至溴酚藍(lán)接近分離膠底部，電泳完畢。

2023/7/514高分子量小麥谷蛋白亞基⑥卸膠、染色和脫色：卸下膠板，用手術(shù)剪撬開玻璃板，將整塊分離膠浸沒在0.25%考馬斯亮藍(lán)溶液中，放在搖床上緩緩搖動染色過夜；次日，取出凝膠，蒸餾水漂洗直至呈現(xiàn)清晰可見的蛋白質(zhì)色帶。⑦拍照：利用凝膠成像儀或者普通像機拍照觀察。2023/7/515高分子量小麥谷蛋白亞基

圖1小麥高分子量谷蛋白亞基的命名是依其相對遷移率，●

結(jié)果分析

1小麥高分子量谷蛋白亞基的命名

小麥高分子量谷蛋白亞基的命名是依其相對遷移率，按Payne的數(shù)字命名法命名，見圖1

圖1小麥高分子量谷蛋白亞基的命名是依其相對遷移率，高分子量小麥谷蛋白亞基

2小麥高分子量谷蛋白亞基SDS圖譜部分小麥高分子量谷蛋白亞基SDS圖譜見圖2

圖2部分小麥高分子量谷蛋白亞基SDS圖譜2小麥高分子量谷蛋白亞基SDS圖譜部分小麥高分子量谷蛋白亞基SDS圖譜見圖22小麥高分子量谷蛋白亞基SDS圖譜部分小麥高分子量谷蛋白亞基SDS圖譜見圖2

圖2部分小麥高分子量谷蛋白亞基SDS圖譜2小麥高分子量谷蛋白亞基SDS圖譜部分小麥高分子量谷蛋白亞基SDS圖譜見圖2高分子量小麥谷蛋白亞基圖3中國春、紅火麥、馬奎斯和濟(jì)麥20高分子量谷蛋白亞基SDS圖譜

HMW-GS的變異由Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1三個位點上的等位基因所控制，不同小麥基因型的高分子量谷蛋白亞基組成不同，但也有相同。如中國春、紅火麥、馬奎斯和濟(jì)麥20的高分子量谷蛋白亞基SDS圖譜見圖3

圖3中國春、紅火麥、馬奎斯和濟(jì)麥20高分子量谷蛋白亞基SDS圖譜高分子量小麥谷蛋白亞基●注意事項：①丙烯酰胺和雙丙烯酰胺有很強的神經(jīng)毒性，容易吸附在皮膚上，且作用有積累性，稱量時戴手套和口罩；②封板和灌膠時都不能產(chǎn)生氣泡，以防漏膠及譜帶彎曲；③使用過的滴管、玻璃器皿要立即沖洗，以防止凝固堵塞；④平板玻璃昂貴，實驗過程中要特別小心。